Summary
منذ فترة طويلة افترض تنظيم خلية من خلايا العظام القحفي ولكن لم تصور مباشرة. وضع العلامات خلية متعددة الأطياف والحية على الهواء مباشرة التصوير يسمح التصور من سلوك الخلية الحيوي في الفك السفلي الزرد. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول للتلاعب Zebrabow الأسماك المعدلة وراثيا ومراقبة مباشرة إقحام خلية والتغيرات المورفولوجية للغضروفية في غضروف ميكل.
Abstract
تطوير الهياكل القحفي الفقارية يتطلب التنسيق الدقيق للهجرة الخلايا وانتشار، الالتصاق والتمايز. الزخرفة من غضروف ميكل، والبلعوم الأولى قوس مشتق، ينطوي على الهجرة من قمة العصبية في الجمجمة (CNC) خلايا والتدريجي التقسيم وانتشارها وتنظيم غضروفية متباينة. وقد وصفت عدة دراسات الهجرة CNC خلال أقل التشكل الفك، ولكن تفاصيل كيفية غضروفية تحقيق التنظيم في النمو وتوسيع غضروف ميكل لا يزال غير واضح. وsox10 المقيدة والتي يسببها كيميائيا لجنة المساواة العرقية بوساطة recombinase إعادة التركيب يولد التباديل من البروتينات الفلورية متميزة (RFP، YFP وCFP)، وبالتالي خلق وضع العلامات المتعددة الأطياف من الخلايا الاولية وذريتهم، مما يعكس السكان نسيلي متميزة. باستخدام متحد البؤر الوقت الفاصل بين التصوير الفوتوغرافي، فمن الممكن لمراقبة غضروفية behaviأو أثناء وضع الغضروف الزرد ميكل.
وضع العلامات الخلية متعدد الأطياف تمكن العلماء من إثبات تمديد غضروفية وميكل. خلال مرحلة تمديد غضروف ميكل الذي ينبئ الفك السفلي، غضروفية يقحم لإحداث تمديد لأنها كومة في خلية واحدة في الصف الطبقات تنظيما. فشل هذه العملية الإقحام المنظمة للتوسط تمديد خلية يوفر التفسير الآلي الخلوي للفك السفلي عن نقص التنسج التي نلاحظها في تشوهات الفك السفلي.
Introduction
وتتطلب التنمية القحفي الجزيئية، والتفاعلات الخلوية والأنسجة المعقدة لدفع تكاثر الخلايا، والهجرة والتمايز 1،2، 3. هذه عملية منظمة بإحكام ومعقدة وتخضع لاضطرابات وراثية وبيئية، بحيث تشوهات القحفي هي من بين تشوهات المواليد الأكثر شيوعا 1-9. في حين لا تزال التدخلات الجراحية الدعامة الأساسية لعلاج الشذوذ القحفي، فهم أساس التنمية ضروري لابتكار علاجات في المستقبل. لذلك، ودراسة التشكل والآليات في التقارب والإرشاد والتكامل الخلية يقدم أفكارا جديدة في تشكيل الهيكل العظمي القحفي 1.
الجمجمة العصبية ترحيل قمة وملء أول البلعوم القوس، عمليات الفك السفلي ثم شكل تقرن التي تمتد لتشكيل غضروف ميكل الذي ينبئ الفك السفلي. التشكل سو غضروف ميكل يتطلب تنظيم خلية غضروفية عبر انتشار الاتجاه، الاستقطاب الخلايا والتمايز 1،10. ومع ذلك، فإن تعقيد تنظيم خلية غضروفية في النمو وتوسيع غضروف ميكل لا يزال غير واضح. فهم سلوك الخلية الحيوي أمر بالغ الأهمية لفهم التشوهات الخلقية التي تؤثر على حجم الفك السفلي، مثل الظواهر الفك السفلي مصبغ 11.
الأجنة الزرد توفر العديد من المزايا التنموية وراثية لدراسة مفصلة للغضروف ميكل التشكل. من قابلية الإستطراق الجيني، والشفافية، فيفو السابقين والتطور السريع مزايا قوية الإقراض جيدا لرصد حركة الخلايا والمنظمة من قبل التصوير الحي 6. باستخدام أدوات تتبع النسب، مثل sox10: خط المعدلة وراثيا Kaede الذي، نحن وغيرنا قد حددت أصول قمة العصبية الهيكل العظمي القحفي الجنينية 1،5. باليودنانوغرام sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية مع يو بي آي: Zebrabow-M خط المعدلة وراثيا، أصبح من الممكن الآن لاستكشاف تفاصيل الحركات الخلوية أثناء تطوير القحفي. وZebrabow-M، هو خط المعدلة وراثيا هندسيا مع المروج بتحول القيادة التعبير عن fluorophores مختلفة، ولكل يحيط بها مواقع السلمون المدخن 8. وfluorophore الافتراضي Zebrabow-M هو أحمر، معربا عن طلب تقديم العروض. بعد تحريض لجنة المساواة العرقية التعبير، وZebrabow-M بناء يعيد توحيد والخلايا التعبير عن مزيج من fluorophores مختلفة (RFP، CFP وYFP) خلق التعبير متعددة الأطياف في الجنين. كل الخلايا الوليدة التي تفرق من الخلايا المسمى بعد وقوع الحدث إعادة التركيب ثم يتم المسمى متطابق بسلالة، لذلك وصفت أن السكان الخلية التي تستمد من الأسلاف جنبا إلى جنب مختلفة متطابق بسلالة. من خلال هذا الوسم خلية الاستنساخ، وتكاثر الخلايا والهجرة مع قرار نسيلي يمكن اتباعها (الشكل 1 و 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت لجنة ماساتشوستس العام مستشفى المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) جميع الإجراءات المنصوص عليها في البروتوكول رقم # 2010N000106. هذا هو في الامتثال مع جمعية للتقويم والاعتماد في مختبر رعاية الحيوان الدولية (AAALAC) المبادئ التوجيهية.
1. الكواشف والمواد التحضير
- إعداد 1 L من 50X E3 المتوسط الجنين (انظر الجدول 1) وإعداد 1 لتر من 1X E3 المتوسط الجنين (انظر الجدول 2).
- إعداد E3 المتوسط الجنين مع N-الفنيل (PTU) وذلك بإضافة 30 ملغ من PTU إلى 1 L من 1X E3. ضجة O / N لضمان أن PTU قد حلت تماما. تخزين في RT.
- لإعداد حل pronase، وتمييع 150 ميكرولتر من pronase (0.5 ملغ / مل) مع 15 مل من 1X E3. هذا المبلغ يكفي لطبق بتري 1. استخدامها على الفور.
- يعد حل ميثيل.
- يعد حل E3-تريكين عن طريق خلط 75 مل من 0.2٪ تريكين مع 25 ملمن 1X E3. يغلي 3 جرام من ميثيل في 75 مل من محلول E3-تريكين.
- تشكل الحجم النهائي إلى 100 مل مع حل E3-تريكين. الحل ميثيل النهائي هو لزج وغير شفافة مع لون مصفر. التخزين: RT محمية من الضوء.
- تاموكسيفين الأسهم وحل التعريفي
- إعداد 5 ملي حل الأسهم تاموكسيفين عن طريق إذابة في الإيثانول بنسبة 100٪، hydroxytamoxifen 4. متجر السهم عند -80 درجة مئوية.
- إعداد التخفيف جديدة من التاموكسيفين في تركيز الرغبة في 1X E3 للحصول على حل الاستقراء. الحذر! يرجى الرجوع MSDS قبل الاستخدام.
- إعداد 1 L 0.2٪ تريكين حسب الجدول 3.
- الحصول على الشرائح مبائر. الغراء أربعة ساترة (18 × 18) معا لتشكيل كتلة ثم وضع لبنات 2 على 24 × 60 سم ساترة 2 الى جانب اتاحة الفرصة المتزايدة للجنين في الوسط.
2. إعداد الأجنة
- خطوط المعدلة وراثيا.
- sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية
ملاحظة: توليد ناقلات استهداف pDestTol2- sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية باستخدام أساليب الاستنساخ الجزيئي القياسية والحصول على تجاريا إعادة التركيب تكنولوجيا الاستنساخ.- الجمع بين 5 "استنساخ الدخول (pENTR5'- sox10p) التي تحتوي على 7.2Kb من المروج sox10، استنساخ الأوسط عبارة (PME-ERT2-لجنة المساواة العرقية)، و3 'استنساخ الدخول (pENTR3'-بوليا) في رد فعل LR مع جهة العدسة ناقلات pDestTol2- α-غلوبولين العدسة: YFP.
- تنقية بناء pDestTol2- sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية. شارك في حقن بناء (100 نانوغرام / ميكرولتر) تنقيته مع Tol2 transposase مرنا (50 نانوغرام / ميكرولتر) في أجنة WT (F0) في مرحلة خلية واحدة.
- شاشة مؤسسي F0 الكبار لنقل خط الجرثومية على أساس مضان أصفر قوي في الأجنة F1.
- sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية؛ Zebrabow-M
- تهجين وZebrabow-Mخط (2.1.1) مع sox10: خط المعدلة وراثيا ERT2-لجنة المساواة العرقية.
- اختر الأجنة اظهار تعبير قوي في كل مكان RFP وYFP عدسة علامة وتنمو لهم حتى الكبار.
3. الأجنة مجموعة
- إعداد عدة أزواج من sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية؛ Zebrabow-M الزرد المعدلة وراثيا 17:00 حتي 18:00 في يوم 1.
- في اليوم التالي، وسحب فواصل في الصباح وجمع البيض عند الظهر تقريبا.
- نقلها إلى أطباق بتري وإضافة 15 مل من محلول pronase إلى dechorionate الأجنة.
- احتضان الأجنة عن 1-5 دقائق حتى تم dechorionated ما يقرب من 60٪ من الأجنة. وقف رد فعل من قبل الصب الحل pronase وغسل الأجنة 3-4 مرات مع الطازجة المتوسطة E3.
- احتضان الأجنة dechorionated في E3 في RT O / N والسماح لهم تطوير للوصول إلى مرحلة 10 القطع البدنية النمطية. احتضان 50-60 الأجنة في مخلب لتجنب نمو التنموية المختلفة. 4. علاج
- تحقق المرحلة التنموية الأجنة "تحت المجهر مجال ضوء للتأكد من أنها في مرحلة 10 القطع البدنية النمطية.
- باستخدام المجهر الفلورسنت مع أحمر بروتين فلوري (RFP) مرشح، عزل الأجنة الحمراء الزاهية.
- انتقل إلى تحريض جنة المساواة العرقية، إعادة التركيب من خلال إضافة 10 ميكرومتر من حل hydroxytamoxifen إلى طبق بتري واحتضان الأجنة المعزولة في 28.5 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
- صب الحل تاموكسيفين وغسل الأجنة عدة مرات مع E3.
الحذر! تجاهل الحل تاموكسيفين في وعاء خاص النفايات البيولوجية. - احتضان الأجنة في 28.5 درجة CO / N.
- عندما الأجنة هي تقريبا 28-29 مرحلة القطع البدنية النمطية (حوالي 24 ساعة الإخصاب آخر)، واحتضان الأجنة في 28.5 درجة مئوية في E3-PTU حل الآخرة.
ملاحظة: PTU هنا تستخدم لمنع تشكيل melanophores في الأجنة النامية. هذا هو العلاج اللازم لتجنب تشويه إشارة مضان من قبل melanophores السيارات الفلورسنت. - احتضان الأجنة في 28.5 ° C
- لتصور هياكل القحفي تطويره بالكامل، حدد الأجنة في 4 أيام الإخصاب آخر لشدة الإشارة الحمراء وجنة المساواة العرقية التعبير علامة إيجابية (الصفراء في شبكية العين).
- تخدير الأجنة مع الحل E3 / 0.015٪ تريكين. تأكيد التخدير عندما لا تحركات نشطة أو النشاط الزعانف لوحظ عندما حث بلطف الجنين.
- نقل الجنين اختيارها للتصوير في طبق بتري تحتوي على قطرة من ميتيل وضمخ بلطف الجنين مع ميثيل.
- على شريحة متحد البؤر نظيفة، ضع قطرة من ميثيل الطازجة وجبل الجنين الخاص بك في غضون الهبوط باستخدام طرف microloader. موقف الجنين يأخذ ظهريا الحذر عدم لمسالجنين مباشرة.
- تغطية الجنين شنت مع 25 × 25 ساترة وضبط الموقف من الجنين إذا لزم الأمر عن طريق التلاعب في ساترة.
- الجنين هو الآن على استعداد لصورة.
- استخدام الهدف 20x والجاف عدسة (الفتحة العددية 0.75؛ الثقب حجم 2.0 ميكرون) لتركيز الجنين.
- اضغط على زر L100 على المجهر واختيار القنوات في البرنامج.
- حدد زر الإعداد متحد البؤر وانقر على 'السيارات' وحدد القنوات التالية قبل أن يغلق النافذة: CH1: CFP، CH2: GFP، CH3: طلب تقديم العروض أو mCherry
- بدوره على CH2 CH3 وقبل النقر على زر "إزالة التعشيق. انقر على "مسرحية" لبدء المسح الضوئي.
- التركيز على بنية الفائدة، التي من الأفضل القيام من خلال البدء مع الإطار ½ / ثانية والجهد العالي (HV) 150 ثم ضبط الإعدادات وفقا لذلك حتى نوعية الصورة المطلوبة هي ميلانhieved. ان طلب تقديم العروض تكون أكثر إشراقا من الألوان الأخرى، وبالتالي ضبط HV. تغيير Z موقف للعثور على حد سواء YFP والخلايا إيجابية طلب تقديم العروض.
- مرة واحدة مع مجموعة الضبط، التقاط صورة الجنين الخاص بك. حفظ الصورة الخاصة بك في شكل برامج التصوير وTIFF شكل متحد البؤر لمعالجة الصور في كل قناة الانقسام.
- المقبل، لتصوير CFP، إيقاف CH2 CH3 ووتشغيل CH1. إعادة ضبط الإعدادات كما في الخطوة 5 دون تغيير مجال التركيز.
ملاحظة: CFP يمكن أن يكون من الصعب حقا للكشف بسبب إشارة الخلفية في القناة الزرقاء التي يمكن التحايل عليها من خلال تعديل حجم الثقب. A حجم الثقب أكبر يسمح كشف أفضل لمضان عن طريق الحد من إشارة / نسبة الضوضاء الخلفية. ومع ذلك، فإن الثقب أكبر تقليل تأثير متحد البؤر، المساومة على جودة الصورة. ولذلك، مطلوب التعديل الدقيق لإعدادات لتحقيق جودة الصورة المطلوبة وشدة. - التقاط الصورة وحفظها في شكل كليهما (البرمجيات متحد البؤر وTIFF) لمعالجة الصور. ويمكن بعد ذلك معالجة الصور باستخدام مشترك برامج معالجة الصور لدمج الطبقات وتحسين إعدادات الألوان كما وصفها وعموم الزملاء 8.
5. اختيار الأجنة
6. تركيب الأجنة في Methycellulose
تحليل 7. بواسطة المجهر مضان
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كان التصور الغضروف التقليدي كلها جبل الألسيان بقع زرقاء لا تقدر بثمن في مراقبة وضع غضروف ميكل وتستخدم عادة لتصور نهائي الخلوي التنظيم 12 (الشكل 1A). لمزيد من تحليل غضروفية تطوير العمل الإضافي، وتتبع النسب باستخدام sox10: خطوط المعدلة وراثيا Kaede الذي مكننا من دراسة الهجرة الخلية، والتقارب والإرشاد في الأجنة الحية 2،12 (الشكل 1B). ومع ذلك، فإن تنظيم غضروفية في الهيكل العظمي القحفي تزال غير مفهومة تماما. بواسطة التصوير الحي، خط المعدلة وراثيا Zebrabow-M قادر على الكشف عن عملية إقحام خلية غضروفية والاستطالة التي تتوسط التمديد ونمو الغضاريف وميكيل (الشكل 1C-G).
في هذا البروتوكول، يو بي آي: Zebrabow-M؛ sox10: تم علاج الأجنة ERT2-لجنة المساواة العرقية مع عقار تاموكسيفين في 10 القطع البدنية النمطية وغضروفيوتصور cytes في الفك السفلي عند نقاط زمنية مختلفة خلال تنمية (من 3 إلى 5 DPF DPF). هو أفضل المصوره الفك السفلي البطني للسماح للآراء واضحة من الغضروف وميكل دون تدخل من لوحة وneurocranium الغربالي ظهريا. الألوان حافظت بثبات ورثت تسمح السهل النسب البحث عن المفقودين وCNCC خلايا رسم الخرائط مصير كما يتبين من السهام السوداء في الشكل 2A-2D. تظهر خلية واحدة زرقاء للهجرة ويقحم مع الخلايا المجاورة لها. ثم يستطيل على طول المحور الأمامي الخلفي لتشكيل خلية غضروفية على شكل موحد وبالتالي الحفاظ على الشكل العالمي للغضروف ميكل كما يمتد الأمامية.
تسمح هذه التقنية لدراسة التشوهات نمو الفك السفلي على المستوى الخلوي وجهاز في ظروف مثل تسلسل روبن حيث الفك هي واحدة من السمات البارزة وصفها. الفشل في الانتشار، تمديد أو إقحام يمكن تصور فعال في تي انه المتزايد غضروفية مع مرور الوقت.
| كلوريد الصوديوم | 14.61 ز |
| بوكل | 0.65 ز |
| CaCl 2 | 1.83 ز |
| MgSO 4 | 1.99 ز |
| منزوع الأيونات H 2 O | 1000 مل |
| * التخزين: RT | |
| ** إضافة 1 قطرة من الميثيلين الأزرق كما مضاد للفطريات | |
الجدول 1. 50X E3 الجنينية صفة المتوسطة
| 50X E3 | 20 مل |
| منزوع الأيونات H 2 O | 980 مل |
| * التخزين: RT | |
| 1M تريس، الكلور (درجة الحموضة 9.5) | 9 مل |
| تريكين | 2 ز |
| منزوع الأيونات H 2 O | جعل تصل إلى 1 L |
| * التخزين: RT | |
الجدول 3. 0.2٪ تريكين صفة
الشكل 1. (A) الغضروف الإسفار ميكل من sox10:. GFP (B) الغضروف تشريح ميكل من 4 DPF توبنغن الجنين ملطخة الألسيان الأزرق (C) خطوط الزرد المعدلة وراثيا يو بي آي: Zebrabow-M الصليب مع sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية. (DG) يو بي آي: Zebrabow-M؛ sox10: ERT2، الكرومه الصورة في طلب تقديم العروض (D)، YFP (E)، CFP (F) القنوات ودمج (G). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. (AD) Timelapse التصوير من Zebrabow-M: sox10: ERT2-لجنة المساواة العرقية في 3dpf (A)، 3.5dpf (B)، 4dpf (C) و5dpf (D). وتشير السهام السوداء لنفس استنساخ واحد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوط المعدلة وراثيا الزرقاء وphotoconvertible الألسيان كما هو موضح أعلاه يكمل بعضها البعض لتحديد عملية معقدة من الغضاريف ونمو العظام. ومع ذلك، منذ فترة طويلة افترض الهجرة الخلوية الحية والمنظمة خلال توالد وغير مباشرة ولكن أثبتت تصور أبدا. Zebrabow-M خط المعدلة وراثيا إلى جانب وجود غضروف لجنة المساواة العرقية محددة يسمح المراقبة الحية في وقت واحد من كل هذه الأحداث المتميزة تشارك في تكوين العظام والغضاريف. تسمح هذه التقنية لدراسة العيوب نمو الفك السفلي على المستوى الخلوي وجهاز في ظروف مثل تسلسل روبن حيث الفك هي واحدة من السمات البارزة وصفها. الفشل في الانتشار، تمديد أو إقحام يمكن تصور فعال في غضروفية تزايد مع مرور الوقت.
اللون التنوع الأمثل
تحسين مستويات لجنة المساواة العرقية عن طريق المعايرة تركيز 4-hydroxytamoxifen يمكن السيطرة على أبحاثاطن من إعادة التركيب وتنوع الألوان دون ان تسفر عن الجنين الفتك. هرمون الاستروجين هو أمر حاسم لتنمية شبكية العين العادية، وبالتالي، يمكن أن الجرعات العالية من عقار تاموكسيفين (> 25μM) لحث تنكس الشبكية، ومعدلات وفيات عالية (~ 60-80٪)، تشوهات الوجه و تأخر في النمو. بالإضافة إلى ذلك، يتم تخفيف 4-hydroxytamoxifen في الإيثانول، وهو في حد ذاته غير سامة أثناء التطور الجنيني 13. وبالتالي، فمن المهم تحديد أفضل التركيز ومدة المعرض للحصول على معدل إعادة التركيب جيد، ولكن الحد من سمية للأجنة.
وقد تم تحسين التركيز المطلوب من 4 hydroxytamoxifen في هذا البروتوكول. تم اختبار تركيزات مختلفة (5-25 ميكرون)، نقاط زمنية التعريفي (10 القطع البدنية النمطية، 24، 36 و 48 HPF) ومدته (30 دقيقة إلى 6 ساعات) (لا تظهر البيانات). جرعة منخفضة من عقار تاموكسيفين (5 ميكرومتر) أنتجت إعادة التركيب محدود بينما الجرعات الكبيرة (من 10 ميكرومتر إلى 20 ميكرومتر) تنتج سيمإعادة التركيب ILAR وتنوع الألوان. جرعات أكبر من 20 ميكرومتر للخطر التطور الطبيعي للأجنة، وبالتالي لا تصلح للدراسة التشوهات القحفي. وكانت فترات التعريفي أقل من 2 ساعة لا تكفي لإنشاء إعادة التركيب الملائم في حين أن أكثر 6 ساعات من تحريض يسببها التسمم والشذوذ التنموية في الأجنة. لم الاستقراء لمدة 3 أو 4 ساعات لا تختلف في كمية من إعادة التركيب والنتائج النهائية.
الحث بعد المرحلة الجنينية 24 HPF لم تنتج إعادة التركيب المطلوب والتعبير الفلورسنت. لذلك، تم تحديد أفضل حل وسط بين التطور الطبيعي وكمية مناسبة من الألوان دون ان تسفر عن أعداد كبيرة بشكل كبير من الوفيات الجنينية أن تكون 3 ساعات من تحريض على 10 القطع البدنية النمطية مع تركيز 10μM من عقار تاموكسيفين.
جودة الصورة
ويمكن الحصول على صور ذات جودة عالية ثابتة ويمكن أن يكون تحديا. إذا كان حقل واحد من السادسمصريات غير قادر على تصور كامل الغضروف ميكل أو هيكل القحفي من الفائدة، يمكن تعيين الهيكل كله من خلال اتخاذ Z-المداخن. ومع ذلك، والحصول على Z-مداخن يمكن أن يكون تحديا في مجال التصوير الجنين الحي بسبب القطع الأثرية الحركة. ولذلك فمن المهم أن يكون حلا وسطا بين جودة الصورة Z كومة، وكمية المعلومات المطلوبة خلال دورة التصوير والوقاية من الليزر التي يسببها الصورة تبيض خلال أطول التعرض ليزر المدى.
قيود أخرى من هذه التقنية هو أن البروتينات الفلورية لا تظهر نفس الاستقرار أثناء التصوير. على سبيل المثال طلب تقديم العروض هو بروتين مستقر نسبيا ولكن YFP يمكن أن يكون غير مستقر. وبالتالي، فمن المهم تحديد أفضل إعدادات التصوير تجريبيا للكشف عن الحد الأقصى لعدد الألوان في جنين معين مع كثافة مناسبة.
بالإضافة إلى الاستقرار اللون، المجهر متحد البؤر هو الحد آخر لأنه غير قادر على قراءة CFPوقنوات YFP معا. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن الانبعاثات من CFP تم الكشف في كل من 470nm 535nm وقنوات هذا. بالإضافة إلى ذلك، الطيف انبعاث CFP (470-535nm) وطيف الإثارة من YFP (530nm) التداخل، وخلق الحنق (نقل الطاقة مضان بالرنين) قطعة أثرية. وبعبارة أخرى، عندما يتم الكشف عن مضان CFP، لأنه يثير YFP مضان وبالتالي خلق إشارة غير محددة. لهذا السبب، هذا البروتوكول مخططات بمسح كانت كل القنوات مضان على حدة، ودمج الصور الفردية بشكل منفصل باستخدام مشترك برامج معالجة التصوير. للالتفاف على القيود المفروضة على المجهر متحد البؤر، يمكن استخدام المجهر الفوتونات اثنين كما هو موضح في عموم وآخرون الورق حيث يمكن قراءة جميع أشكال التعبير مضان ثلاثة في وقت واحد مما يسمح للمزيد من الألوان التنوع 8. ووصف بان وآخرون طائفة واسعة من تنوع الألوان في خطوط Zebrabow-M من (تصل إلى 30 لونا). بعد الشروط الموضحة في هذا البروتوكول الاضافيocol، ويمكن الحصول على كثافات مختلفة من مضان وrecombinations كما هو مبين في الشكل 2، على الرغم من أن بعض التباديل اللون قد فقدت أثناء معالجة مرحلة ما بعد التصوير.
الميراث اللون والتحليلات نسيلي
ووصف بان وآخرون الميراث لون حافظت بثبات في Zebrabow-M من السلف إلى النسل الذي يسمح لرسم خرائط مصير 8. تركز على الخلايا العصبية CNCC هذا البروتوكول لتوصيف تشكيل غضروف ميكل. استخدام CreERT2 في الزرد يسمح للكفاءة تاموكسيفين بفعل loxP كاسيت إعادة التركيب والقدرة على التحكم في بداية CNCC وضع العلامات النسب خلال تطوير القحفي. يمكن بسهولة أن تتكيف هذه الطريقة لتصور جميع المشتقات قمة العصبية إلى جانب غضروف ميكل. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام خط مراسل المعدلة وراثيا مختلفة للتحليل نسيلي في مختلف أجهزة الجسم المختلفة وتسليط الضوء على مختلف مقصائد من نمو الخلايا خلال توالد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
الكتاب أشكر أليكس شير لتتكرم تقاسم خط Zebrabow-M المعدلة وراثيا، جيفري بيرنز للناقلات pDEST ورينيه ايتييه-ديغل] لرعاية ممتازة للمنشأة الأسماك والخطوط.
التمويل:
ونحن ممتنون للدعم السخي بتمويل من NIDCR RO3DE024490 ومستشفى شراينرز للأطفال (ECL) والزمالات التدريبية ما بعد الدكتوراه من مستشفى شراينرز للأطفال (LR وYK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
- Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
- Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
- McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
- Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Vieira, A. R. Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
- Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
- Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).
