Summary
Craniofacial हड्डियों की सेल संगठन लंबे समय से धारणा रही है लेकिन सीधे कल्पना की कभी नहीं रही है। मल्टी-स्पेक्ट्रल सेल लेबलिंग और विवो लाइव में इमेजिंग zebrafish निचले जबड़े में गतिशील सेल व्यवहार के दृश्य की अनुमति देता है। यहाँ, हम विस्तार प्रोटोकॉल Zebrabow ट्रांसजेनिक मछली हेरफेर करने के लिए और सीधे सेल मध्यनिवेश और मेकेल उपास्थि में chondrocytes की रूपात्मक परिवर्तन देखने।
Abstract
कशेरुकी craniofacial संरचनाओं के विकास सेल प्रवास, प्रसार, आसंजन और भेदभाव की सटीक समन्वय की आवश्यकता है। मेकेल उपास्थि, पहली बार एक ग्रसनी मेहराब व्युत्पन्न की patterning कपाल तंत्रिका शिखा (सीएनसी) कोशिकाओं के प्रवास और प्रगतिशील विभाजन, प्रसार और भेदभाव कर chondrocytes के संगठन शामिल है। कई अध्ययनों से निचले जबड़े morphogenesis दौरान सीएनसी पलायन का वर्णन किया है, लेकिन chondrocytes मेकेल उपास्थि के विकास और विस्तार में संगठन हासिल कैसे की जानकारी अस्पष्ट बनी हुई है। sox10 प्रतिबंधित है और रासायनिक प्रेरित Cre Recombinase की मध्यस्थता पुनर्संयोजन जिससे अलग प्रतिरूप आबादी को दर्शाती है, पूर्वज कोशिकाओं और उनके संतान की एक मल्टी स्पेक्ट्रल लेबलिंग बनाने, अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी, YFP और सीएफपी) के क्रमपरिवर्तन उत्पन्न करता है। कोंफोकल समय चूक फोटोग्राफी का उपयोग करना, यह chondrocytes निरीक्षण करने के लिए संभव है behaviया zebrafish मेकेल उपास्थि के विकास के दौरान।
Multispectral सेल लेबलिंग मेकेल chondrocytes के विस्तार प्रदर्शित करने के लिए वैज्ञानिकों को सक्षम बनाता है। जबड़ा prefigures जो मेकेल उपास्थि, के विस्तार के चरण के दौरान, chondrocytes वे एक संगठित एकल कोशिका बहुस्तरीय पंक्ति में ढेर के रूप में विस्तार करने के लिए प्रभावी intercalate। सेल विस्तार मध्यस्थता करने के लिए यह आयोजन किया intercalating प्रक्रिया की विफलता हम जबड़े विकृतियों में निरीक्षण कि hypoplastic जबड़ा के लिए सेलुलर यंत्रवत विवरण प्रदान करता है।
Introduction
Craniofacial विकास सेल प्रसार, प्रवास और भेदभाव 1,2, 3 ड्राइव करने के लिए जटिल आणविक, सेलुलर और ऊतक बातचीत की आवश्यकता है। इस कसकर विनियमित और जटिल प्रक्रिया craniofacial विकृति सबसे आम जन्म विकृतियों 1-9 लोगों में से हैं कि इस तरह के आनुवांशिक और पर्यावरणीय अव्यवस्थाएं, के अधीन है। शल्य हस्तक्षेपों विकास के आधार को समझने, craniofacial विसंगतियों के लिए उपचार का मुख्य आधार बने हुए हैं, वहीं भविष्य उपचार नया करने के लिए आवश्यक है। इसलिए, अभिसरण और विस्तार और सेल एकीकरण में morphogenesis और तंत्र के अध्ययन के craniofacial कंकाल 1 के गठन में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
कपाल तंत्रिका शिखा विस्थापित और पहली ग्रसनी मेहराब जबड़ा prefigures जो मेकेल उपास्थि, फार्म के लिए करता हूं कि, तब बनती फार्म जबड़े प्रक्रियाओं आबाद। Morphogenesis ओमेकेल उपास्थि च दिशात्मक प्रसार, सेल ध्रुवीकरण और भेदभाव 1,10 के माध्यम से उपास्थिकोशिका संगठन की आवश्यकता है। हालांकि, मेकेल उपास्थि के विकास और विस्तार में उपास्थिकोशिका संगठन की जटिलता अस्पष्ट बनी हुई है। गतिशील सेल व्यवहार को समझना ऐसे hypoplastic जबड़ा phenotypes के रूप में 11 जबड़े के आकार को प्रभावित जन्मजात विकृतियों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
Zebrafish भ्रूण मेकेल उपास्थि morphogenesis के विस्तृत अध्ययन के लिए कई विकासात्मक और आनुवंशिक लाभ प्रदान करते हैं। उनके आनुवंशिक शिक्षणीयता, पारदर्शिता, पूर्व vivo और तेजी से विकास रहते इमेजिंग 6 से सेल आंदोलन और संगठन के अवलोकन के लिए यह अच्छी तरह से उधार शक्तिशाली लाभ कर रहे हैं। ऐसे sox10 के रूप में वंश अनुरेखण उपकरण, का प्रयोग: Kaede ट्रांसजेनिक लाइन, और हम दूसरों भ्रूण craniofacial कंकाल 1,5 के तंत्रिका शिखा मूल चित्रित किया है। Usiयूबीआई के साथ ERT2-CRE: sox10 एनजी Zebrabow एम ट्रांसजेनिक लाइन, यह Craniofacial विकास के दौरान सेलुलर आंदोलनों की जानकारी का पता लगाने के लिए अब संभव है। Zebrabow-एम, अलग fluorophores की अभिव्यक्ति ड्राइविंग यूबीक्यूटिन प्रमोटर, Lox साइटों 8 से घिरे प्रत्येक के साथ इंजीनियर एक ट्रांसजेनिक लाइन है। Zebrabow एम डिफ़ॉल्ट fluorophore आरएफपी व्यक्त लाल है। रचनात्मक अभिव्यक्ति के शामिल होने के बाद, Zebrabow एम recombines निर्माण और कोशिकाओं भ्रूण में मल्टी स्पेक्ट्रल अभिव्यक्ति बनाने अलग fluorophores (आरएफपी, सीएफपी और YFP) का एक संयोजन व्यक्त करते हैं। अलग Juxtaposed पूर्वज से निकाले जाते हैं कि कि सेल आबादी clonally चिह्नित कर रहे हैं, ताकि पुनर्संयोजन घटना के बाद लेबल की कोशिकाओं से विभाजित है कि सभी बेटी कोशिकाओं तो clonally, लेबल रहे हैं। यह क्लोनिंग सेल लेबलिंग करके, प्रतिरूप संकल्प के साथ कोशिकाओं के प्रसार को और प्रवास (चित्रा 1 और 2) का पालन किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) प्रोटोकॉल संख्या # 2010N000106 के तहत सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी। यह आकलन और प्रयोगशाला पशु की देखभाल इंटरनेशनल (AAALAC) के दिशा निर्देशों के प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन के अनुपालन में है।
1. अभिकर्मकों और माल की तैयारी
- 50X E3 के भ्रूण के माध्यम से 1 एल तैयार (2 टेबल देखें) (1 टेबल देखें) और 1X E3 के भ्रूण के माध्यम से 1 एल तैयार करते हैं।
- 1X E3 के 1 एल को पीटीयू के 30 मिलीग्राम जोड़कर एन phenylthiourea (पीटीयू) के साथ E3 भ्रूण मध्यम तैयार। हलचल हे / एन पी टी यू पूरी तरह से भंग कर दिया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए। आरटी पर स्टोर।
- , Pronase समाधान तैयार 1X E3 के 15 मिलीलीटर के साथ pronase (0.5 मिलीग्राम / एमएल) के 150 μl पतला करने के लिए। इस राशि को एक पेट्री डिश के लिए पर्याप्त है। तुरंत प्रयोग करें।
- Methylcellulose समाधान तैयार करें।
- 25 मिलीलीटर के साथ 0.2% Tricaine के 75 मिलीलीटर के मिश्रण से E3-tricaine समाधान तैयार1X E3 के। E3-tricaine समाधान के 75 मिलीलीटर में methylcellulose के 3 जी उबाल लें।
- E3-tricaine समाधान के साथ 100 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा अप करें। अंतिम methylcellulose समाधान एक पीले रंग के साथ चिपचिपा और अपारदर्शी है। भंडारण: आरटी प्रकाश से रक्षा की।
- Tamoxifen शेयर और प्रेरण समाधान
- 4-hydroxytamoxifen 100% इथेनॉल में भंग करके 5 मिमी tamoxifen के शेयर समाधान तैयार है। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर शेयर।
- प्रेरण समाधान प्राप्त करने के लिए 1X E3 में इच्छा एकाग्रता में tamoxifen की ताजा कमजोर पड़ने को तैयार है। चेतावनी! उपयोग करने से पहले एमएसडीएस से परामर्श करें।
- 3 टेबल के अनुसार 0.2% Tricaine के 1 एल तैयार करें।
- कोंफोकल स्लाइड प्राप्त करते हैं। एक ब्लॉक फार्म एक साथ चार coverglass (18 x 18) गोंद तो बीच में भ्रूण के बढ़ते अनुमति देने के लिए 2 सेमी के अलावा एक 24 x 60 coverglass पर 2 ब्लॉक जगह है।
2. भ्रूण तैयारी
- ट्रांसजेनिक लाइनों।
- sox10: ERT2-CRE
नोट: मानक आणविक क्लोनिंग तरीकों का उपयोग कर ERT2 Cre और व्यावसायिक रूप से प्रौद्योगिकी क्लोनिंग पुनर्संयोजन प्राप्त: निशाना बना वेक्टर pDestTol2- sox10 उत्पन्न करता है।- लेंस गंतव्य के साथ एक एलआर प्रतिक्रिया में प्रवेश क्लोन (pENTR3'-Pólya) गठबंधन 5 'sox10 प्रमोटर के 7.2Kb, एक प्रवेश द्वार के बीच क्लोन (PME-ERT2-सीआरई), और एक 3 युक्त प्रवेश क्लोन (pENTR5'- sox10p)' वेक्टर pDestTol2- α-crystallin: YFP।
- निर्माण शुद्ध pDestTol2- sox10: ERT2-CRE। एक सेल मंच पर गुम्मट भ्रूण (F0) में Tol2 Transposase mRNA (50 एनजी / μl) के साथ शुद्ध निर्माण (100 एनजी / μl) सह-इंजेक्षन।
- रोगाणु लाइन संचरण के लिए स्क्रीन F0 वयस्क संस्थापकों में एफ 1 भ्रूण में मजबूत पीले प्रतिदीप्ति पर आधारित है।
- sox10: ERT2-CRE; Zebrabow-एम
- Zebrabow एम outcrossERT2-CRE ट्रांसजेनिक लाइन: sox10 के साथ लाइन (2.1.1)।
- एक मजबूत सर्वव्यापी आरएफपी अभिव्यक्ति और YFP लेंस मार्कर और वयस्कों तक उन्हें बढ़ने का प्रदर्शन करते चयन भ्रूण।
3. भ्रूण संग्रह
- Sox10 के कई जोड़े को निर्धारित करें: ERT2-CRE; Zebrabow एम ट्रांसजेनिक zebrafish 5 बजे और दिन 1 पर शाम 6 बजे के बीच।
- अगले दिन सुबह में डिवाइडर खींचने के लिए और दोपहर के आसपास अंडे इकट्ठा।
- व्यंजन पेट्री और भ्रूण dechorionate को pronase समाधान के 15 मिलीलीटर जोड़ने के लिए उन्हें स्थानांतरित।
- भ्रूण का लगभग 60% dechorionated गया है जब तक 1 मिनट से 5 के लिए भ्रूण सेते हैं। Pronase समाधान decanting द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो और ताजा E3 के माध्यम से भ्रूण 3-4 बार धो लें।
- आर टी ओ / एन पर E3 में dechorionated भ्रूण सेते हैं और उन्हें 10 somites चरण तक पहुंचने के लिए विकसित करते हैं। विभिन्न विकासात्मक विकास से बचने के लिए क्लच प्रति 50-60 भ्रूण सेते हैं। 4. उपचार
- वे 10 somites चरण में हैं सुनिश्चित करने के लिए एक प्रकाश क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण 'विकास मंच की जाँच करें।
- एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) फिल्टर के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, चमकदार लाल भ्रूण अलग।
- पेट्री डिश के लिए hydroxytamoxifen समाधान के 10 माइक्रोन से जोड़ने और 3 घंटे के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस पर पृथक भ्रूण incubating द्वारा Cre पर पुनर्संयोजन की प्रेरण के लिए आगे बढ़ें।
- Tamoxifen के समाधान छानना और E3 के साथ भ्रूण कई बार धोने।
चेतावनी! एक विशेष जैविक अपशिष्ट कंटेनर में tamoxifen के समाधान त्यागें। - 28.5 सीओ / एन में भ्रूण सेते हैं।
- भ्रूण लगभग 28-29 somites चरण (24 घंटा के आसपास के बाद निषेचन) कर रहे हैं, E3-पीटीयू समाधान इसके बाद में 28.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण सेते हैं।
नोट: पीटीयू यहाँ है विकासशील भ्रूण में melanophores के गठन को बाधित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस इलाज के लिए आवश्यक हैऑटो फ्लोरोसेंट melanophores द्वारा प्रतिदीप्ति का संकेत विकृति से बचें। - 28.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण सेते
- पूरी तरह से विकसित craniofacial संरचनाओं कल्पना करने के लिए, रेड सिग्नल और रचनात्मक अभिव्यक्ति मार्कर सकारात्मकता (रेटिना में पीला) की तीव्रता के लिए 4 दिन बाद निषेचन में भ्रूण का चयन करें।
- E3 / 0.015% tricaine समाधान के साथ भ्रूण anesthetize। धीरे भ्रूण उकसाने जब कोई सक्रिय आंदोलनों या पंख गतिविधि का निरीक्षण करते संज्ञाहरण की पुष्टि की है।
- Methylcellulose की एक बूंद से युक्त एक पेट्री डिश में इमेजिंग के लिए चयनित भ्रूण स्थानांतरण और धीरे methylcellulose के साथ भ्रूण शवलेप।
- एक साफ कोंफोकल स्लाइड पर ताजा methylcellulose की एक बूंद जगह और एक microloader टिप का उपयोग बूंद के भीतर अपने भ्रूण माउंट। स्थिति भ्रूण पीछे की ओर नहीं छूने के लिए सावधानी ले रही हैसीधे भ्रूण।
- एक 25 x 25 coverslip साथ घुड़सवार भ्रूण कवर और यदि आवश्यक हो तो coverslip जोड़ तोड़ द्वारा भ्रूण की स्थिति को समायोजित।
- भ्रूण अब छवि के लिए तैयार है।
- भ्रूण ध्यान केंद्रित के लिए; 20x सूखी लेंस उद्देश्य (पिनहोल आकार 2.0 माइक्रोन संख्यात्मक एपर्चर 0.75) का प्रयोग करें।
- माइक्रोस्कोप पर L100 बटन दबाएं और सॉफ्टवेयर में चैनलों का चयन करें।
- कोंफोकल सेटअप बटन का चयन करें और 'ऑटो' पर क्लिक करें और विंडो बंद करने से पहले निम्नलिखित चैनलों का चयन करें: Ch1: सीएफपी, CH2: GFP, CH3: आरएफपी या mCherry
- 'आलिंगन को दूर' बटन पर क्लिक करने से पहले CH2 और CH3 चालू करें। स्कैनिंग शुरू करने के लिए 'खेल' पर क्लिक करें।
- वांछित छवि गुणवत्ता एसी है जब तक सबसे अच्छा आधा फ्रेम / सेकंड और उच्च वोल्टेज (एचवी) 150 के साथ शुरू करने और फिर उसके अनुसार सेटिंग्स का समायोजन करके किया जाता है, जो ब्याज की संरचना पर ध्यान केंद्रितhieved। आरएफपी इसलिए एचवी समायोजित, दूसरे रंग की तुलना में उज्जवल होगा। YFP और आरएफपी सकारात्मक कोशिकाओं दोनों मिल Z स्थिति बदलें।
- सेटिंग्स के साथ सेट के बाद, अपने भ्रूण की छवि पर कब्जा। प्रत्येक विभाजन चैनल में छवि प्रसंस्करण के लिए confocal इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रारूप और झगड़ा प्रारूप में अपने सेव करें।
- इसके बाद, सीएफपी इमेजिंग के लिए, CH2 और CH3 बंद कर देते हैं और Ch1 मोड़ पर है। फोकस क्षेत्र बदलने के बिना चरण 5 में के रूप में सेटिंग्स को फिर से समायोजित।
नोट: सीएफपी कारण पिनहोल आकार का समायोजन करके धोखा दिया जा सकता है कि नीले चैनल में पृष्ठभूमि संकेत करने के लिए पता लगाने के लिए वास्तव में मुश्किल हो सकती है। एक बड़ा पिनहोल आकार संकेत / पृष्ठभूमि शोर अनुपात को कम करने से प्रतिदीप्ति की बेहतर पता लगाने के लिए परमिट। हालांकि, एक बड़ा पिनहोल छवि गुणवत्ता से समझौता किए, कोंफोकल प्रभाव कम हो जाएगा। इसलिए, सेटिंग्स से सावधान समायोजन वांछित छवि गुणवत्ता और तीव्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। - छवि पर कब्जा है और (दोनों प्रारूप में confocal सॉफ्टवेयर और टी इसे बचाने के लिएछवि प्रसंस्करण के लिए आईएफएफ)। चित्र तो परतों विलय और पान और 8 सहयोगियों द्वारा वर्णित के रूप में रंग सेटिंग्स में सुधार करने के लिए आम छवि संसाधन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कार्रवाई की जा सकती।
5. भ्रूण चयन
6. Methycellulose में भ्रूण बढ़ते
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा 7. विश्लेषण
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
पूरे माउंट Alcian नीला दाग द्वारा पारंपरिक उपास्थि दृश्य विकासशील मेकेल उपास्थि देख और आमतौर पर अंतिम सेलुलर संगठन 12 (चित्रा 1 ए) कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है में अमूल्य किया गया है। आगे वंश sox10 का उपयोग कर ट्रेसिंग, ओवरटाइम विकासशील chondrocytes का विश्लेषण करने के लिए: Kaede ट्रांसजेनिक लाइनों लाइव भ्रूण 2,12 (चित्रा 1 बी) में सेल प्रवास, अभिसरण और विस्तार का अध्ययन करने के लिए सक्षम है। हालांकि, craniofacial कंकाल संरचना में chondrocytes के संगठन समझ खराब रहता है। लाइव इमेजिंग द्वारा, Zebrabow एम ट्रांसजेनिक लाइन मेकेल उपास्थि (चित्रा 1 सी जी) के विस्तार और विकास की मध्यस्थता करता है कि उपास्थिकोशिका मध्यनिवेश और बढ़ाव की प्रक्रिया को प्रकट करने में सक्षम है।
ERT2-CRE भ्रूण 10 somites और Chondro पर tamoxifen के साथ इलाज किया गया: sox10 Zebrabow एम: इस प्रोटोकॉल, यूबीआई मेंनिचले जबड़े में cytes विकास के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर (3 से 5 DPF DPF से) कल्पना थे। निचले जबड़े सबसे अच्छा सलाखें प्लेट और neurocranium पीछे की ओर के हस्तक्षेप के बिना मेकेल उपास्थि के स्पष्ट विचारों अनुमति देने के लिए पेट के बल कल्पना है। चित्रा 2A 2 डी में काला तीर द्वारा संकेत के रूप स्थिरतापूर्वक बनाए रखा और विरासत में मिला रंग आसान वंश अनुरेखण और CNCC कोशिकाओं भाग्य मानचित्रण अनुमति देते हैं। एक नीले सेल की ओर पलायन और उसके पड़ोसी की कोशिकाओं के साथ intercalate प्रतीत होता है। यह तो यह पूर्व से फैली रूप में इस प्रकार मेकेल उपास्थि के वैश्विक आकार को बनाए रखने के लिए एक समान रूप से आकार उपास्थिकोशिका फार्म के लिए पूर्वकाल पीछे अक्ष के साथ elongates।
इस तकनीक को इस तरह के micrognathia वर्णित प्रमुख विशेषताओं में से एक है, जहां रॉबिन दृश्य के रूप में की स्थिति में सेलुलर और अंग स्तर पर निचले जबड़े विकास विकृतियों के अध्ययन की अनुमति देता है। प्रसार, विस्तार या मध्यनिवेश में विफलता को प्रभावी ढंग से टी में देखे जा सकते हैं वह समय के साथ chondrocytes बढ़ रहा है।
| सोडियम क्लोराइड | 14.61 छ |
| KCl | 0.65 छ |
| 2 CaCl | 1.83 छ |
| MgSO 4 | 1.99 छ |
| विआयनीकृत एच 2 ओ | 1000 मिलीलीटर |
| * भंडारण: आरटी | |
| ** एक विरोधी कवक के रूप में नीले methylene की एक बूंद जोड़ें | |
तालिका 1 50X E3 भ्रूण मध्यम नुस्खा
| 50X E3 | 20 मिलीलीटर |
| विआयनीकृत एच 2 ओ | 980 मिलीलीटर |
| * भंडारण: आरटी | |
| 1 एम Tris सीएल (पीएच 9.5) | 9 मिलीलीटर |
| tricaine | 2 जी |
| विआयनीकृत एच 2 ओ | 1 एल के लिए कर |
| * भंडारण: आरटी | |
तालिका 3. 0.2% Tricaine नुस्खा
Sox10 चित्रा 1 (ए) प्रतिदीप्ति मेकेल उपास्थि:।। Alcian ब्लू के साथ दाग एक 4 ट्युबिन्गन DPF भ्रूण की GFP (बी) विच्छेदित मेकेल उपास्थि (सी) ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों यूबीआई: ERT2-रचनात्मक: sox10 साथ Zebrabow एम पार। (डीजी) यूबीआई: Zebrabow एम; sox10: ERT2 सीआरआरएफपी (डी) में ई छवि, YFP (ई), सीएफपी (एफ) चैनलों और विलय (जी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Zebrabow-एम के चित्रा 2 (ई) Timelapse फोटोग्राफी: sox10: 3dpf (ए) में ERT2-CRE, 3.5dpf (बी), 4dpf (सी) और 5dpf (डी)। काला तीर एक ही एकल क्लोन को इंगित करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ऊपर से एक दूसरे के पूरक के रूप में वर्णित Alcian नीले और photoconvertible ट्रांसजेनिक लाइनों उपास्थि और हड्डी के विकास की जटिल प्रक्रिया को परिभाषित करने के लिए। हालांकि, जीवोत्पत्ति के दौरान लाइव सेलुलर प्रवास और संगठन लंबे समय से धारणा और परोक्ष रूप से प्रदर्शन किया, लेकिन कल्पना कर कभी नहीं किया गया है। एक उपास्थि विशिष्ट Cre के साथ युग्मित Zebrabow एम ट्रांसजेनिक लाइन हड्डी और उपास्थि गठन में शामिल इन सभी अलग घटनाओं में से एक साथ रहते अवलोकन परमिट। इस तकनीक को इस तरह के micrognathia वर्णित प्रमुख विशेषताओं में से एक है, जहां रॉबिन दृश्य के रूप में की स्थिति में सेलुलर और अंग स्तर पर निचले जबड़े विकास दोषों के अध्ययन की अनुमति देता है। प्रसार, विस्तार या मध्यनिवेश में विफलता को प्रभावी ढंग से समय के साथ बढ़ रही है chondrocytes में देखे जा सकते हैं।
रंग विविधता अनुकूलन
Exten नियंत्रित कर सकते हैं 4-hydroxytamoxifen की एकाग्रता titrating द्वारा रचनात्मक स्तरों अनुकूलनभ्रूण मारक है, जिसके परिणामस्वरूप बिना पुनर्संयोजन और रंग विविधता के टी। एस्ट्रोजन सामान्य रेटिना विकास के लिए महत्वपूर्ण है और इसलिए, Tamoxifen (> 25μM) की अधिक मात्रा रेटिना अध: पतन, उच्च मृत्यु दर (~ 60% से 80), craniofacial विकृतियों और विकास की देरी के लिए प्रेरित कर सकते हैं। इसके अलावा, 4-hydroxytamoxifen अपने आप में भ्रूण के विकास के दौरान 13 विषैला होता है जो इथेनॉल में पतला है। इसलिए, यह सबसे अच्छा एकाग्रता और एक अच्छा पुनर्संयोजन दर प्राप्त करने के लिए प्रदर्शनी की अवधि निर्धारित है लेकिन भ्रूण के लिए विषाक्तता को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
4-hydroxytamoxifen के वांछित एकाग्रता इस प्रोटोकॉल में अनुकूलित किया गया है। विभिन्न सांद्रता (5-25 माइक्रोन), प्रेरण समय अंक (10 somites, 24, 36 व 48 HPF) और अवधि (30 मिनट घंटा 6 वर्ष) (नहीं दिखाया डेटा) का परीक्षण किया गया। उच्च खुराक (10 माइक्रोन माइक्रोन से 20 से) सिम का उत्पादन किया, जबकि Tamoxifen (5 माइक्रोन) के एक कम खुराक एक सीमित पुनर्संयोजन का उत्पादनilar पुनर्संयोजन और रंग विविधता। खुराक से अधिक 20 माइक्रोन भ्रूण के सामान्य विकास के साथ छेड़छाड़ की और craniofacial विकृतियों के अध्ययन के लिए इसलिए उपयुक्त नहीं है। 2 घंटा से भी कम समय प्रेरण अवधियों पर्याप्त पुनर्संयोजन बनाने के लिए पर्याप्त नहीं थे, जबकि प्रेरण प्रेरित विषाक्तता और भ्रूण में विकास संबंधी विसंगतियों के 6 घंटा। 3 या 4 घंटे के लिए प्रेरण पुनर्संयोजन और अंतिम परिणाम की राशि में अलग नहीं किया था।
प्रेरण 24 HPF भ्रूण अवस्था वांछित पुनर्संयोजन और फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति का उत्पादन नहीं किया था के बाद। इसलिए, भ्रूण मृत्यु दर काफी अधिक संख्या में जिसके परिणामस्वरूप के बिना सामान्य विकास और रंग की उपयुक्त मात्रा के बीच सबसे अच्छा समझौता Tamoxifen के एक 10μM एकाग्रता के साथ 10 somites में तैनाती के 3 घंटा होने के लिए निर्धारित किया गया था।
छवि के गुणवत्ता
लगातार और उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। अगर छठी के एक ही क्षेत्रईडब्ल्यू पूरे मेकेल कार्टिलेज या ब्याज की craniofacial संरचना कल्पना करने में असमर्थ है, पूरे ढांचे को जेड ढेर लेने से मैप किया जा सकता है। हालांकि, जेड के ढेर को प्राप्त करने के कारण आंदोलन कलाकृतियों के लिए जीना भ्रूण इमेजिंग में चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसलिए यह Z ढेर छवि की गुणवत्ता के बीच एक समझौता होना बहुत जरूरी है, लंबी अवधि के लेजर प्रदर्शन के दौरान इमेजिंग सत्र और लेजर प्रेरित तस्वीर विरंजन की रोकथाम के दौरान आवश्यक जानकारी की राशि।
इस तकनीक का एक और सीमा फ्लोरोसेंट प्रोटीन इमेजिंग के दौरान एक ही स्थिरता दिखाने के लिए नहीं है। उदाहरण के लिए आरएफपी एक अपेक्षाकृत स्थिर प्रोटीन है लेकिन YFP अस्थिर हो सकता है। इसलिए, यह उपयुक्त तीव्रता के साथ एक दिया भ्रूण में रंगों की अधिकतम संख्या का पता लगाने के अनुभव से सबसे अच्छा इमेजिंग सेटिंग्स निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
यह सीएफपी पढ़ने में असमर्थ है, क्योंकि रंग स्थिरता के अलावा, confocal खुर्दबीन एक और सीमा हैएक साथ और YFP चैनल। इस सीएफपी से उत्सर्जन दोनों 470nm और 535nm चैनलों में पता चला है कि इस तथ्य के कारण है। इसके अलावा, सीएफपी (470-535nm) के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और एक झल्लाहट (प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण) विरूपण साक्ष्य बनाने YFP (530nm) ओवरलैप की उत्तेजना स्पेक्ट्रम,। सीएफपी प्रतिदीप्ति पता चला है जब दूसरे शब्दों में, यह इस प्रकार एक गैर विशिष्ट संकेत बनाने YFP प्रतिदीप्ति उत्तेजित। इस कारण से, इस प्रोटोकॉल के सभी प्रतिदीप्ति चैनलों को अलग-अलग थे स्कैनिंग और अलग से एक आम इमेजिंग संसाधन सॉफ्टवेयर का उपयोग व्यक्तिगत छवियों विलय की रूपरेखा। सभी तीन प्रतिदीप्ति भाव अधिक रंग विविधता 8 की अनुमति के लिए एक साथ पढ़ा जा सकता है, जहां पान एट अल के पत्र में वर्णित के रूप में confocal खुर्दबीन की सीमाओं को नाकाम करने के लिए, एक दो फोटॉनों माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जा सकता है। पान एट अल उनकी Zebrabow एम लाइनों (30 रंग) में रंग विविधता की एक बड़ी स्पेक्ट्रम वर्णित किया गया है। इस prot में वर्णित शर्तों के बादचित्रा 2 में दिखाया गया है कुछ रंग क्रमपरिवर्तन के बाद इमेजिंग प्रसंस्करण के दौरान खो दिया जा सकता था, हालांकि ocol, प्रतिदीप्ति और recombinations के विभिन्न तीव्रताओं, प्राप्त किया जा सकता है।
रंग विरासत और प्रतिरूप विश्लेषण
पान एट अल भाग्य मानचित्रण 8 के लिए अनुमति देता है कि संतान के लिए पूर्वज से Zebrabow-एम में स्थिरतापूर्वक बनाए रखा रंग विरासत वर्णित किया गया है। तंत्रिका CNCC कोशिकाओं पर केंद्रित इस प्रोटोकॉल मेकेल उपास्थि के गठन को चिह्नित करने के लिए। zebrafish में CreERT2 के उपयोग के कुशल tamoxifen प्रेरित loxP कैसेट पुनर्संयोजन और craniofacial विकास के दौरान CNCC वंश लेबलिंग की शुरुआत नियंत्रित करने की क्षमता के लिए अनुमति देता है। इस विधि को आसानी से मेकेल उपास्थि के अलावा सभी तंत्रिका शिखा डेरिवेटिव कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, विभिन्न मीटर पर प्रकाश डाला जाएगा विभिन्न विभिन्न अंग प्रणालियों में प्रतिरूप विश्लेषण के लिए एक अलग ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइन का उपयोगजीवोत्पत्ति के दौरान सेल के विकास के Odes।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
लेखकों कृपया मछली सुविधा और लाइनों के उत्कृष्ट देखभाल के लिए Zebrabow एम ट्रांसजेनिक लाइन, pDEST वेक्टर के लिए जेफ्री बर्न्स और रेनी Ethier-Daigle साझा करने के लिए एलेक्स Schier धन्यवाद।
अनुदान:
हम बच्चों के लिए श्राइनर्स हॉस्पिटल से बच्चे (ईसीएल) और पोस्ट डॉक्टरेट प्रशिक्षण फैलोशिप के लिए NIDCR RO3DE024490 और श्राइनर्स हॉस्पिटल से उदार वित्तीय सहायता (एलआर और वाईके) के लिए आभारी हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
- Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
- Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
- McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
- Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Vieira, A. R. Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
- Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
- Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).
