Summary
두개 안면 뼈의 세포 조직은 긴 가설하지만 직접 시각화 적이있다. 멀티 스펙트럼 셀 라벨 및 생체 라이브에서 영상은 제브라 피쉬 아래턱에 동적 셀 동작을 시각화 할 수 있습니다. 여기, 우리 세부 프로토콜은 Zebrabow에게 유전자 변형 물고기를 조작하고 직접 세포 인터 및 멕켈의 연골에서 연골 세포의 형태 학적 변화를 관찰한다.
Abstract
척추 동물의 두개 안면 구조의 개발은 세포 이동, 확산, 접착 및 분화의 정확한 조정이 필요합니다. 멕켈의 연골, 제 인두 아치 유도체의 패터닝은 두개골 신경 크레스트 (CNC) 세포의 이동과 진보적 인 분할, 증식 및 분화 된 연골 세포의 조직을 포함한다. 몇몇 연구는 아래턱 형태 발생 동안 CNC 마이그레이션을 설명했지만,이 연골 세포의 연골 멕켈의 성장 및 확대에 조직을 실현하는 방법의 상세는 불분명. sox10은 제한 및 화학적으로 유도 Cre 호텔 재조합 효소 - 중재 재조합하여 별개의 클론 인구를 반영 전구 세포 및 그들의 자손의 멀티 스펙트럼 라벨을 만드는, 독특한 형광 단백질 (RFP, YFP와 CFP)의 순열을 생성합니다. 공 촛점 시간 경과 사진을 사용하면, 연골 세포를 관찰 할 수있다 behavi또는 제브라 피쉬 멕켈의 연골의 개발 과정.
멀티 스펙트럼 셀 라벨은 멕켈의 연골 세포의 확장을 보여 과학자 수 있습니다. 하악을 prefigures 멕켈의 연골의 확장 단계에서 연골 세포들은 조직 단일 셀 계층 행에 스택으로 확장에 영향을하는 층간 삽입. 세포 확장을 중재하기 위해이 조직 인터 프로세스의 실패는 우리가 하악 기형에서 관찰 형성 부전 하악의 세포 기계적인 설명을 제공합니다.
Introduction
두개 안면 개발은 세포 증식, 이동 및 분화, 2, 3를 구동하는 복잡한 분자, 세포 및 조직의 상호 작용을 필요로한다. 이 엄격하게 규제하고 복잡한 과정은 두개 안면 기형이 가장 흔한 선천성 기형 1-9의 사이 있도록 유전과 환경 교란에 될 수 있습니다. 수술 개입이 개발 기초를 이해, 두개 안면 기형 치료의 의지가 남아 있지만 미래의 치료를 혁신하는 것이 필수적이다. 따라서, 통합 및 확장과 세포 통합의 형태 형성과 메커니즘을 연구하는 것은 두개 안면 골격 (1)의 형성에 새로운 통찰력을 제공합니다.
두개골 신경 크레스트 마이그레이션 및 첫 번째 인두 아치 하악을 prefigures 멕켈의 연골을 형성 확장, 다음 짝을 형성 하악 프로세스를 채 웁니다. 형태 형성 오멕켈의 연골 f를 방향 증식, 세포 편광과 차별화 1,10 통해 연골 세포 조직을 필요로한다. 그러나, 멕켈의 연골의 성장과 확장에 연골 세포 조직의 복잡함은 확실하지 않다. 동적 세포의 행동을 이해하는 것은 이러한 형성 부전 하악 표현형 (11) 하악의 크기에 영향을 미치는 선천성 기형을 이해하는 것이 중요합니다.
Zebrafish의 배아는 멕켈의 연골 형태 형성의 자세한 연구를위한 많은 발달과 유전 적 장점을 제공한다. 유전 취급 용이성, 투명성, 생체 및 급속한 발전은 라이브 영상 6 세포의 이동과 조직의 관찰 잘 빌려주는 강력한 장점이다. 같은 sox10 같은 혈통-추적 도구 사용 : 카에데 형질 전환 라인을, 우리와 다른 배아 두개 안면 골격 1.5의 신경 크레스트 기원을 묘사했다. USIUBI와 ERT2-Cre 호텔 : sox10을 겨 Zebrabow-M 유전자 변형 라인은 두개 안면 개발 과정에서 세포 운동의 세부 사항을 탐험 할 수있게되었습니다. Zebrabow-M은, 서로 다른 형광 물질의 발현을 구동 유비퀴틴 프로모터의 LOX 사이트 (8)에 의해 각각 측면으로 설계된 트랜스 제닉 라인이다. Zebrabow-M의 기본 형광이 RFP를 표현, 빨간색입니다. Cre 호텔의 발현 유도 후, Zebrabow-M은 재결합을 구성하고 세포는 배아에서 멀티 스펙트럼 표현을 생성하는 다른 형광체 (RFP, CFP와 YFP)의 조합을 표현한다. 다른 병치 된 전구 세포에서 유래하는 세포 집단이 클론 적 표시되도록 재조합 이벤트 이후의 표지 세포 분열 모든 딸 세포를 클론 적, 표시되어 있습니다. 이 복제 셀 라벨에 의해, 클론 해상도와 세포 증식 및 마이그레이션 (그림 1, 2) 다음에 할 수 있습니다.
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Protocol
매사 추세 츠 종합 병원 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 프로토콜 번호 # 2010N000106에서 모든 절차를 승인했다. 이 평가 및 실험 동물 관리 국제 (AAALAC) 가이드 라인의 인증 협회을 준수합니다.
1. 시약 및 재료 준비
- E3 배아 50X 배지 1 L을 제조 (표 2 참조) (표 1 참조)과 1X E3 배아 배지 1 L를 준비한다.
- 1X E3의 1 L에 PTU 30mg을 첨가하여 N-페닐 티오 (PTU)와 E3 배아 매체를 준비한다. 저어 O / N은 PTU가 완전히 용해되었는지 확인합니다. 실온에서 보관하십시오.
- , 프로 나아 제 용액을 제조 1X E3 15 ml의 프로 나제 (0.5 ㎎ / ㎖) 150 ㎕의 희석. 이 금액은 1 페트리 접시에 충분하다. 즉시 사용합니다.
- 메틸 셀룰로오스 솔루션을 준비합니다.
- 25 ml의 0.2 % tricaine 75 ml를 혼합하여 E3-tricaine 솔루션을 준비1X E3의. E3-tricaine 용액의 75 mL에 메틸 셀룰로오스의 3g을 끓인다.
- E3-tricaine 솔루션 100ml로 최종 볼륨을 확인합니다. 최종 메틸 셀룰로오스 용액은 황색 색조와 점성과 불투명하다. 저장 : RT 빛으로부터 보호.
- 타목시펜 재고 및 유도 솔루션
- 4- hydroxytamoxifen 100 % 에탄올에 용해시켜 5 mM의에게 타목시펜 스톡 용액을 제조 하였다. -80 ° C에서 보관 재고.
- 유도 용액을 얻었다 1X E3에서 소망 농도 타목시펜의 신선한 희석을 준비한다. 주의! 사용하기 전에 MSDS (물질 안전 보건 자료)를 참조하십시오.
- 표 3에 따라 0.2 % tricaine의 1 리터를 준비합니다.
- 공 초점 슬라이드를 얻습니다. 블록을 형성하기 위해 함께 네 개의 커브 글라스 (18 X 18) 접착제 다음 중간에 배아 장착 할 수 있도록 2cm 간격 24 X 60 커브 글라스에 2 블록을 배치합니다.
2. 배아 준비
- 형질 전환 라인.
- sox10 : ERT2-Cre 호텔
참고 : 표준 분자 클로닝 방법을 사용하여 ERT2-Cre 호텔과 상용 기술을 복제 재결합을 얻을 : 대상 벡터 pDestTol2- sox10를 생성합니다.- 렌즈 목적지와 LR 반응에 진입 클론 (pENTR3' - 폴리 -A) 겸용 5 'sox10 프로모터의 7.2Kb, 게이트웨이 중간 클론 (PME-ERT2-Cre 호텔)와 (3)을 포함하는 항목 클론 (pENTR5'- sox10p)' 벡터 pDestTol2-의 α-crystallin을 : YFP.
- 구조를 정화 pDestTol2- sox10 : ERT2-Cre 호텔을. 하나의 셀 단계에서 WT 배아 (F0)에 TOL2의 트랜스 mRNA의 (50 NG / μL)와 정제 된 구조 (100 NG / μL)를 공동 주입.
- 세균 온라인 전송을위한 화면 F0 성인 설립자 F1 배아 강한 노란색 형광을 기반으로.
- sox10 : ERT2-Cre 호텔, Zebrabow-M
- Zebrabow-M을 교배ERT2-Cre 호텔 형질 전환 라인 : sox10와 라인 (2.1.1).
- 강한 유비쿼터스 RFP 발현과 YFP 렌즈 마커와 성인까지 그들을 성장을 보이는 선택 배아.
3. 배아 컬렉션
- sox10의 여러 쌍을 설정 : ERT2-Cre 호텔을, Zebrabow-M 형질 전환 제브라 피쉬를 오후 5시와 1 일 오후 6시 사이.
- 다음 날, 아침에 디바이더를 당겨 정오 경 계란을 수집합니다.
- 요리를 페트리와 배아를 dechorionate하는 프로 나제 용액 15ml를 추가로 전송.
- 배아의 약 60 %가 dechorionated 때까지 1 분 5의 배아를 품어. 프로 나제 솔루션을 경사하여 반응을 중지하고 신선한 E3 매체와 태아에게 3 ~ 4 회 반복한다.
- RT O / N에서 E3에서 dechorionated 배아를 품어하고는 10 somites 단계에 도달하기 위해 개발 할 수 있습니다. 다른 발달 성장을 방지하기 위해 클러치 당 50 ~ 60 배아를 품어. 4. 치료
- 그들은 10 somites의 단계에 보장하기 위해 빛 필드 현미경으로 배아 '발달 단계를 확인합니다.
- 적색 형광 단백질 (RFP) 필터와 형광 현미경을 사용하여 밝은 빨간색 배아를 분리.
- 페트리 접시에 hydroxytamoxifen 용액 10 μm의를 추가하고 3 시간 동안 28.5 ° C에서 분리 된 배아를 배양하여 Cre 호텔 - 재결합의 유도로 넘어갑니다.
- 타목시펜 솔루션을 가만히 따르다 및 E3와 배아를 여러 번 씻는다.
주의! 특별한 생물학적 폐기물 용기에 타목시펜 솔루션을 폐기합니다. - 28.5 ° CO / N에서 배아를 품어.
- 배아는 약 28 ~ 29 somites 단계 (24 시간 약 게시물 수정) 때, E3-PTU 솔루션 이하에서 28.5 ° C에서 배아를 배양한다.
참고 : PTU가 여기에 개발 배아에 melanophores의 형성을 억제하는 데 사용됩니다. 이 치료는 할 필요가자동 형광 melanophores 의한 형광의 신호 왜곡을 피하기. - 28.5 ° C에서 배아를 품어
- 완전히 개발 된 두개 안면 구조를 시각화하기 위해, 레드 신호와 Cre 호텔 표현 마커 양성 (망막 노란색)의 강도 4 일 후 수정의 배아를 선택합니다.
- E3 / 0.015 %의 tricaine 솔루션 배아를 마취. 부드럽게 배아를 괴롭히는 경우 활성 운동 또는 지느러미 활동이 관찰되지 않을 때 마취가 확인된다.
- 메틸 방울을 함유하는 페트리 접시에 이미징 선택된 배아를 전송하고 부드럽게 메틸 셀룰로스와 배아 방부.
- 깨끗한 공 초점 슬라이드에서 신선한 메틸 한 방울을 배치하고 microloader 팁을 사용하여 드롭 내에서 배아를 탑재합니다. 위치 배아는 등쪽으로 만지지 않도록주의를 복용직접 배아.
- 25 × 25 커버 슬립으로 장착 배아를 커버하고, 필요한 경우 커버 슬립을 조작함으로써 태아의 위치를 조정한다.
- 배아는 이제 이미지에 대한 준비가되어 있습니다.
- 배아를 초점을 맞추기 위해, 20 배 건조 렌즈 목표 (핀홀 크기 2.0 μm의 개구 수 0.75)를 사용합니다.
- 현미경에 L100 버튼을 눌러 소프트웨어의 채널을 선택합니다.
- 공 초점 설정 버튼을 선택하고 '자동'을 클릭하고 창을 닫기 전에 다음과 같은 채널을 선택 : 채널 1 : CFP, 채널 2 : GFP, CH3 : RFP 또는 mCherry을
- '연동을 제거'버튼을 클릭하기 전에 채널 2와 CH3의 전원을 켭니다. 스캔을 시작하는 '놀이'를 클릭하십시오.
- 원하는 화질 AC 때까지 가장 ½ 프레임 / 초 고전압 (HV) (150)로 시작하고 따라서 설정을 조정함으로써 행해진 다 관심 구조에 초점hieved. RFP 따라서 HV를 조정, 다른 색상보다 밝은 것입니다. YFP 및 RFP 양성 세포를 모두 찾을 수있는 Z 위치를 변경합니다.
- 설정으로 설정하면, 당신의 배의 이미지를 캡처합니다. 각 분할 채널에서 이미지 처리를 위해 공 촛점 이미징 소프트웨어 형식 및 TIFF 형식으로 사진을 저장합니다.
- 다음으로, CFP 이미징, 채널 2와 CH3를 끄고 채널 1의 전원을 켭니다. 초점 영역을 변경하지 않고, 단계 5와 설정을 다시 조정한다.
참고 : CFP 인해 핀홀 크기를 조정하여 회피 할 수있다 파랑 채널에서 배경 신호를 감지하기 정말 어려울 수 있습니다. 큰 핀홀 크기는 신호 / 배경 잡음 비를 감소시켜보다 효율적으로 형광을 검출 할 수있게한다. 그러나, 큰 핀홀 이미지 품질 저하, 공 초점 효과를 감소시킬 것이다. 따라서, 설정 조절은 조심 원하는 이미지의 품질 및 강도를 달성하기 위해 요구된다. - 이미지를 캡처 (모두 형식으로 공 초점 소프트웨어와 T를 저장이미지 처리를위한 IFF). 이미지는 다음 레이어를 병합하고 8 팬과 동료들에 의해 설명 된 바와 같이 색 설정을 개선하기 위해 공통의 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 처리 될 수있다.
5. 배아 선택
6. 프로필 메틸 셀룰로오스에서 배아를 장착
형광 현미경으로 7. 분석
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Representative Results
전체 마운트 알 시안 블루 얼룩에 의해 전통적인 연골 시각화 개발 멕켈의 연골을 관찰하고 일반적으로 최종 세포 조직 (12) (그림 1A)를 시각화하는 데 사용에 귀중한하고있다. 더 혈통은 sox10를 사용하여 추적, 초과 근무 개발 연골 세포를 분석하기 : 카에데 유전자 변형 라인 라이브 배아 2,12 (그림 1B)에 세포 이동, 통합 및 확장을 연구 수있게되었습니다. 그러나, 두개 안면 골격 구조에서 연골 세포의 조직은 제대로 이해 남아 있습니다. 라이브 영상으로 Zebrabow-M 트랜스 제닉 라인 멕켈의 연골 (도 1C-G)의 확장과 성장을 매개 연골을 흡장 및 연신 공정을 공개 할 수있다.
ERT2-Cre 호텔 배아 10 somites하고 콘드에서 타목시펜으로 치료 하였다 :; sox10이 Zebrabow-M :이 프로토콜, UBI에서아래턱에 cytes은 개발 과정에서 서로 다른 시점에서 (3 ~ 5 DPF DPF에서)를 시각화했다. 아래턱은 가장 사골 판과 뇌 머리 뼈 등쪽의 간섭없이 멕켈의 연골의 명확한 전망을 할 수 있도록 복부 사진입니다. 그림 2A-2D에 검은 색 화살표로 표시된 바와 같이 안정적으로 유지하고 상속 색상은 쉽게 추적 혈통과 CNCC 세포의 운명 매핑 할 수 있습니다. 단일 블루 셀은 이전과 그 인접 셀과 층간 삽입 나타납니다. 그러므로이 전방으로 연장 따라서 멕켈의 연골의 형태를 유지하는 글로벌 균일 연골 모양을 형성하는 전후방 축을 따라 뻗어 나온.
이 기술은 micrognathia 설명 눈에 띄는 기능 중 하나입니다 로빈 순서와 같은 조건에서 세포와 기관 수준에서 아래턱 성장 기형에 대한 연구를 할 수 있습니다. 증식, 확장 또는 인터에 실패 효과적으로 T에 가시화 될 수있다 그 시간 동안 연골 세포 성장.
| 염화나트륨 | 14.61 G |
| KCl을 | 0.65 G |
| 염화칼슘 2 | 1.83 G |
| 황산 | 1.99 G |
| 탈 H 2 O | 1,000 ml의 |
| * 저장 : RT | |
| ** 항진균로 메틸렌 블루의 1 방울을 추가 | |
표 1. 50X E3 배아 매체 조리법
| 50X (E3) | 20 ㎖ |
| 탈 H 2 O | 980 ml의 |
| * 저장 : RT | |
| 1M 트리스 - CL (PH 9.5) | 9 ml의 |
| tricaine | 2g |
| 탈 H 2 O | 1 L에 메이크업 |
| * 저장 : RT | |
표 3. 0.2 % Tricaine 레시피
sox10 그림 1. (A) 형광 멕켈의 연골 :.. 알 시안 블루로 염색 4 튀빙겐 DPF 배아의 GFP (B) 해부 멕켈의 연골 (C) 형질 전환 제브라 피쉬 라인 UBI : ERT2-CRE : sox10와 Zebrabow-M 크로스. (DG) UBI : Zebrabow-M, sox10 : ERT2-CRRFP (D)에서 전자 이미지, YFP (E), CFP (F) 채널 및 병합 (G). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Zebrabow-M의 그림 2. (AD) 어 Timelapse 사진 : sox10 : 3dpf (A)에서 ERT2-Cre 호텔, 3.5dpf (B), 4dpf (C) 및 5dpf (D). 검은 색 화살표가 같은 단일 클론를 가리 킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
위에서 서로를 보완 설명으로 알 시안 블루와 photoconvertible 형질 전환 라인은 연골과 뼈 개발의 복잡한 프로세스를 정의 할 수 있습니다. 그러나, 기관 형성기 동안 라이브 세포의 이동과 조직은 오랫동안 가정 간접적으로 증명하지만 시각 적이있다. 연골 특정 Cre 호텔과 함께 Zebrabow-M 형질 전환 라인은 뼈와 연골 형성에 관여하는 모든 별개의 이벤트를 동시에 실시간 관찰을 허용합니다. 이 기술은 micrognathia 설명 눈에 띄는 기능 중 하나입니다 로빈 순서와 같은 조건에서 세포와 기관 수준에서 아래턱 성장 결함의 연구를 할 수 있습니다. 증식, 확장 또는 인터에 실패 효율적으로 시간이 지남에 따라 성장 연골 세포에 가시화 될 수있다.
색상 다양성 최적화
exten을 제어 할 수있는 4 hydroxytamoxifen의 농도를 적정하여 Cre 호텔 레벨 최적화배아 치사 초래없이 재조합 및 색상의 다양성 t. 에스트로겐은 정상 망막 개발을위한 중요하기 때문에, 타목시펜 (> 25μm 인)의 과다 복용은 망막 변성, 높은 사망률 (~ 60~80%), 두개 안면 기형 및 발달 지연을 유도 할 수있다. 또한, 4 hydroxytamoxifen 자체 배아 발달 동안 13 독성 에탄올에 희석된다. 따라서, 가장 양호한 농도 및 재결합 속도를 얻기 박람회 기간을 결정하지만 배아 독성을 제한하는 것이 중요하다.
4 hydroxytamoxifen의 원하는 농도는이 프로토콜에 최적화되었습니다. 다른 농도 (5-25 μM), 유도 시간 지점 (somites 10, 24, 36 및 48, HPF) 및 지속 시간 (30 분 내지 6)은 (데이터는 미도시) 시험 하였다. 고용량가 (10 μm의 μm의 20에서)를 시뮬레이션 제작하는 동안 타목시펜 (5 μM)의 낮은 복용량은 제한된 재조합 생산재조합 ILAR 및 색상의 다양성. 복용량보다 큰 20 μm의는 배아의 정상적인 발달을 손상 및 두개 안면 기형을 연구 때문에 적합하지 않습니다. 2 시간 미만의 유도 기간은 적절한 재결합을 작성하기에 충분하지 동안 유도에 의한 독성과 배아의 발달 기형 이상 6 시간. 3 ~ 4 시간 동안 유도 재조합 및 최종 결과의 양에 차이가 없었다.
유도 24 HPF 배아 단계가 원하는 재조합 형광 발현을 생산 수있었습니다. 따라서, 배아 사망률 상당히 높은 수치의 결과가없는 정상적인 색의 개발 및 적량 간의 최상의 절충 타목시펜의 10μM 농도에서 10 somites 유도를 3 시간 인 것으로 측정되었다.
이미지 품질
일관되고 높은 품질의 이미지를 얻기 어려울 수 있습니다. 만약 VI의 단일 필드EW 전체 멕켈의 연골이나 관심의 두개 안면 구조를 시각화 할 수없는, 전체 구조는 Z - 스택을 복용하여 매핑 할 수 있습니다. 그러나, Z - 스택을 획득 인해 이동 유물 라이브 배아 영상에 도전 할 수있다. 그러므로 그것이 Z 스택 이미지의 품질 간의 절충을 위해 중요 장기 레이저 노광시 이미징 세션과 레이저 유발 광 백화 방지 중에 필요한 정보의 양.
이 기술의 또 다른 한계는 형광 단백질 이미징 동안 같은 안정성을 보여주지 않는다는 것입니다. 예를 들어 RFP는 비교적 안정한 단백질이지만 YFP가 불안정 할 수있다. 따라서, 적당한 강도로 주어진 배아 색상의 최대 수를 검출하기 위해 경험적 최선 촬상 설정을 결정하는 것이 중요하다.
이 CFP를 읽을 수 있기 때문에 색상 안정성 이외에도, 공 초점 현미경은 다른 제한은함께와 YFP 채널. 이것은 CFP로부터 방출 모두가 470nm와 535nm의 채널에서 검출되기 때문이다. 또한, CFP (470-535nm)의 발광 스펙트럼 및 FRET (형광 공명 에너지 전달) 이슈를 생성 YFP (을 530nm) 오버랩 여기 스펙트럼. CFP 형광이 검출 될 때 즉, 그것은 따라서 비특이적 신호를 생성 YFP 형광을 여기시킨다. 이러한 이유로,이 프로토콜은 모든 형광 채널 따로 따로 주사했다 일반적인 영상 처리 소프트웨어를 이용하여 각각의 이미지를 병합 설명합니다. 세 형광 색 표현이 더 다양성 8 허용 동시에 판독 될 수있다 팬 등의 논문에 기재된 바와 같이 공 초점 현미경의 한계를 회피하기 위해, 두 개의 광자 현미경에 사용될 수있다. 팬 등은 Zebrabow-M 라인 (최대 30 색)의 색상 다양성의 큰 스펙트럼을 설명했다. 이 PROT에 기재된 조건에 이어도 2에 도시 된 바와 같이 어떤 컬러가 치환 후의 촬상 처리 중에 손실되었을 수도 있지만 ocol, 형광 및 재조합 상이한 강도를 얻을 수있다.
색상 상속 및 클론 분석
팬 등은 운명 매핑 (8)을 허용 자손에 전구에서 Zebrabow-M에서 안정적으로 유지 색 상속을 설명했다. CNCC 신경 세포에 집중이 프로토콜 멕켈의 연골의 형성을 특성화. 제브라 피쉬 CreERT2의 효율적인 사용은 타목시펜 유도에 loxP 재조합 카세트 및 두개 안면 개발 중에 CNCC 계통 표시의 개시를 제어 할 수있는 능력을 허용한다. 이 방법은 쉽게 멕켈의 연골 게다가 모든 신경 능선 유도체를 가시화하도록 구성 될 수있다. 또한, 다른 m을 강조한다 다양한 다른 기관계에서 클론 분석을 위해 다른 트랜스 제닉 리포터 라인을 사용기관 형성 동안 세포 성장의 송시.
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Acknowledgments
저자는 친절 물고기 설비 및 라인의 우수한 케어 Zebrabow-M 유전자 변형 라인, pDEST 벡터에 대한 제프리 번스와 르네 이티 - Daigle 공유를위한 알렉스 Schier 감사합니다.
자금 조달 :
우리는 어린이를위한 이너스 병원에서 어린이 (ECL) 및 박사후 연수 장학금에 대한 NIDCR RO3DE024490와 슈라 이너스 병원에서 관대 한 자금 지원 (LR 및 YK)에 대해 감사하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
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