Introduction
Massive diafyseale knogledefekter er en stor udfordring for den ortopædiske kirurg. Knogleerstatning med autologt knogletransplantat, der i øjeblikket betragtes som guldstandard behandling, er i begrænset udbud og er forbundet med høst-relateret sygelighed. Af disse grunde har væv-manipuleret knogle konstruktioner kombinerer knoglemarvsceller mesenchymstamceller med osteokonduktive scaffolds blevet udforsket som et alternativ til autotransplantater i ortopædkirurgi.
Til dato har de fleste af de undersøgelser, udført i klinisk relevante dyremodeller såsom hunde, svin og får 1-3, men foreløbig evaluering af disse konstruktioner i ortotopisk, segmentær, kritisk størrelse knogle defekter i små-dyremodeller (ligesom mus) kan have adskillige fordele: (i) lave omkostninger, (ii) et stort antal dyr kan betjenes; (Iii) i modsætning til store dyremodeller, homogenitet musestammer begrænser individuelle variationer i stillads resorption ennd knogledannelse og; (Iv) vigtigst, tilgængeligheden af specifikke antistoffer og gen-målrettede dyr muliggøre evaluering af den biologiske proces involveret i knogleheling. Sidst, men ikke mindst, brug af immundeficiente musestammer muliggør også undersøgelser under anvendelse af enten podninger eller celler af human oprindelse uden negative immunreaktioner i mus.
Trods de førnævnte fordele, massive diafyseale knogler defektmodeller i mus er sparse. De fleste af sådanne modeller bruger knoglefiksering med et intramedullært stift, som fylder knoglemarven hulrum (således begrænser mængden af materiale, der skal testes) og også hæmmer reproducerbarhed ved ikke at give roterende og aksial stabilitet 2,4-7.
Målene for den aktuelle undersøgelse er (i) at efterligne en klinisk knogle ikke-union situation til at beskrive en reproducerbar, kritisk-størrelse, segmentær, femoral defekt model i mus, som er stabiliseret af nøjagtig og reproducerbar låsning-plade osteosynthESIS, der giver en meget stabil biomekanisk miljø 8-10; (Ii) at illustrere den foreliggende model med to potentielle knoglesubstitutter og beskrive knogledannelse analyser, der kan anvendes.
Protocol
Etik Statement: Musene anvendt i den foreliggende undersøgelse blev behandlet i overensstemmelse med de retningslinjer, der er offentliggjort af Den Europæiske Komité for "Pleje og anvendelse af forsøgsdyr" (direktiv 2010/63 / EU og den europæiske konvention ETS 123). Den eksperimentelle protokol blev godkendt af den etiske komité for Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet Lariboisiére Saint-Louis (CEEA LV / 2010-01-04).
1. Dyr
- Brug athymiske mus (10 uger gamle). Brug et minimalt antal 6 mus med defekt efterlades tomt som negativ kontrolgruppe.
2. Stilladser Forberedelse
- Syngene Graft Forberedelse
- Brug bone isotransplantat at fylde defekten til at give kontrolgruppe med et minimum af 6 dyr.
- Anskaf knogle isografter ved høst fjernet lårbensknogle fra mus, der tilhører enten "defekter efterlades tomme eller" defekter fyldt med koral stillads "grupper (ther undgår anvendelsen af ekstra dyr til at indsamle knogle isotransplantat) 11.
- Skyl resekterede knogle med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og holde det sterilt hjælp fugtig gaze kompres.
- Coral Scaffold Forberedelse
- Brug stillads, som er lavet af naturlige koral: Acropora sp. koral exoskeleton kuber, 3 x 3 x 3 mm som potentielle knoglesubstitut med et minimum af 6 dyr.
- Skære i hånden hver koral terning til formen af cylinderen (3,5 højde; 2 mm diameter).
- Sterilisere hver stillads ved autoklavering (121 ° C i 20 min), vask det med sterilt PBS, og nedsænket det i komplet dyrkningsmedium (α-MEM) i 24 timer før implantation i mus.
3. anæstesiprocedurer og analgesi
- Give forebyggende analgesi, 15 min før anæstesi, ved subkutan injektion af buprenorphin (0,1 mg / kg dyrelegemsvægt).
- Påfør salve i dyretøjne at forhindre tørhed hver 30 min, mens dyrene er under anæstesi.
- Placer mus på en varmepude for at forhindre hypotermi.
- Anæstesi og Analgesi under den kirurgiske procedure
- Injicer intraperitonealt en opløsning indeholdende xylazin (8 mg / kg) og ketamin (100 mg / kg).
- Levere ilt via flow-by (50 ml / min).
- Bekræft tilstrækkelig dybde af anæstesi ved tilstedeværelsen af god muskelafslapning og manglende dyr respons på en skadelig stimulus (f.eks., Fast tå knivspids).
- Injicer subkutant en enkelt dosis af enrofloxacin (0,05 mg / kg) som mikrobielle profylakse.
- Postoperativ analgesi
- Giv postoperativ analgesi ved subkutan injektion af buprenorphin (0,1 mg / kg) hver 12 timer i 3 på hinanden følgende dage.
- Anæstesi under Diagnostic Imaging Procedurer
- Placer musene i en anesthetizing-box, og derefter inducere og vedligeholde anæstesi under anvendelse af ca. 4% og 2% isofluran i oxygen hhv.
- Bekræft tilstrækkelig dybde af anæstesi ved god dyr muskelafslapning og manglen på bevægelse.
- Recovery betingelser
- Hold mus på opvarmning pad indtil fuld helbredelse
- Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje efter operationen.
- Må ikke returnere et dyr, der har gennemgået kirurgi til selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
- Post-operative betingelser
- Vært musene særskilt i de første 3 dage Host musene ved 4 i bure efter dag 3.
- Giv vand og tilpasset mad ad libitum. Tillad musene til vægt-bjørn, uden nogen aktivitet begrænsning hele post-operative periode.
4. Kirurgisk procedure:Femoral Segmentoplysninger Defect Model 11,12
- Efter anæstesi, placere hver mus i ventrale tilbagelænethed med venstre bagben i forlængelse.
- Skrubbe lemmer til aseptisk kirurgi under anvendelse af 10% povidoniod i 5 minutter og derefter placere et sterilt afdækningsstykke under lemmet for at skabe en steril overflade (et sterilt afdækningsstykke transparent anvendes for at kunne overvåge respiratorisk bevægelse under proceduren). Der sørges for at opretholde steriliteten af det kirurgiske område i løbet af proceduren.
- Lav en 15-17-mm langsgående hud incision over anterolaterale af lårbenet, der strækker sig fra hofteleddet til knæleddet.
- Incise fascia lata, opdele vastus lateralis-musklen og biceps femoris-musklen for at blotlægge den fulde længde af den femorale knogleskaft. Bør der udvises forsigtighed for at bevare iskiasnerven kaudalt og ledkapslen distalt (figur 1).
- For at øge femoral diafyse exposikker, transektere glutealregionen og biceps femoris fra den 3. trochanter.
- Udfør en cirkulær dissektion af lårbenet i midten af diafysen.
- Påfør en 6-hullers titanium mikro-låseplade (10 mm lang, 1,5 mm bred, vægt: 30 mg) på den forreste femorale side.
BEMÆRK: Hullerne af pladen, som er konisk forsænket med en cylindrisk del, rumme titanium selvskærende låseskruer (2 mm lang, 0,47 mm ydre diameter, vægt: 5 mg, med undersiden af hovedet skruegevind for at muliggøre låsning inden pladen hul), der er forbundet med en stilk, der snor fra, når låst. - Bor den mest proximale hul af pladen under anvendelse af en 0,3 mm bor og enten dedikeret motorkraft eller ikke-dedikeret motorkraft drevet ved 2.500 rpm ved ca. 500 mW 12).
- Sæt den første skrue hjælp af en dedikeret skruetrækker og derefter låse den (figur 2).
BEMÆRK: Da tilpasning af than plade bestemmes ved anvendelse af dette første skrue, er det vigtigt at positionere pladen parallelt til lårbenet ved isætning skruen. - Bor den mest distale hul af pladen på en lignende måde, indsætte og låse skruen (figur 3).
- Indsæt, men gør ingen lås, de to andre ydre skruer.
- Placer ledningen af 0,22 mm Gigli så tæt omkring knoglen i en medio-lateral orientering og derefter indsætte det i spalterne i læren (figur 4).
- Indsæt den dedikerede jig på stilken af de to sidstnævnte skruer og anvende det over pladen (figur 5).
- Udfør en 3,5-mm lang mid-diafyseal femoralis ostectomy hjælp af Gigli så under vanding (ved hjælp af steril isotonisk saltvand) for at forhindre termisk nekrose. Har kirurgens assistent tage jig. Har kirurgen anvende en konstant jævn spænding. Pas på ikke at filtrer saven tråd og bruge de midterste to tredjedele af tråden. Undgå exces bevægelse for at opnå en lige knogle snit (figur 6).
- Efter ostectomy Fjern Gigli så. For at undgå beskadigelse af det bløde væv, skåret savtråden tæt til benet på den ene side.
- Fjern skabelonen og lås de to sidste skruer (figur 7).
- Enten lade segmentdefekt tom eller kirurgisk udfylde det ved at sætte materialer, der skal testes inden i defekten.
- Rigeligt skylle det kirurgiske område med steril isotonisk saltopløsning.
- Placer vastus lateralis musklen løst over pladen. Luk fascia og subkutane fly ved anvendelse af en simpel kontinuert sutur mønster og 5,0 glycomer 631 sutur; lukke huden med en enkel afbrudt sutur mønster anvendelse af 4,0 glycomer 631 sutur. Alternativt er det også muligt at lukke huden ved hjælp af hud lim.
5. In vivo Vurderinger af Bone Regeneration
- Med musene under bedøvelse, udføre radiografiskevurderinger i en langsgående måde ved hjælp af både konventionel røntgen (26 kV, 10 sek 2X forstørrelse, 20 linjer / mm rumlig opløsning) og høj opløsning mikro-computertomografi (μCT).
- For μCT analyse, hente billeder med en opløsning på 36 um (50 kV og 478 mA ved 40 ms eksponeringstid, ved anvendelse af en 0,5 mm aluminium filter, rotation skridt på 0,7 º, og tomografisk rotation på 180 º). Analyser billederne ved hjælp beboeren software.
6. Ex Vivo Vurderinger af Bone Regeneration
- Ti uger efter operationen, inducere anæstesi under anvendelse isofluran i oxygen, og derefter ofre musene ved intraperitoneal injektion af en overdosis barbiturat (1 ml pentobarbital).
- Udskære femoralis knogler, fjerne overliggende muskelvæv, og fastsætte de knogle prøver i 4% paraformaldehyd (pH 7,4) i fire dage.
- Fjern pladen og skruer fra hver udskårne knogle prøve efter paraformaldehyd fixation.
- Ex Vivo u CT Analyse
- Placer hver skåret ud og fast knogle i polyethylen rør fyldt med 75% alkohol og analysere den ved hjælp af ex vivo μCT.
- Erhverve billeder ved 80 kV og 100 uA (eksponeringstid på 1000 ms, aluminium 0,5 filter, og 4 um kamera pixelstørrelse (2.400 x 4.000 med en voxel størrelse på 7 um), gennemsnit fire rammer for hver rotation tilvækst på 0,9 º.
- Rekonstruere 3-dimensionelle billeder (gennemsnitlig voxel størrelse på 13 um) ved hjælp af en Hamming-filtreret back-projektion med beboeren software.
- For kvantitativ analyse af knogledannelse, bruge resident software til at få mængden af mineraliseret væv (lavere grå tærskel på 45 gråtoner indekser og øvre grå tærskel på 240 gråtoner indeks) i en beslutsom og konsekvent region af interesse svarende til defekten.
- Udfør analyser på samme måde for hver mus med samme region af interesse.
- Brug envejsanalyse test (konfidensinterval - ved 95%, og det betydelige niveau på p <0,05) for at sammenligne knoglen union sats og volumenet af mineraliseret væv i området af interesse mellem grupperne.
- histologisk analyse
- Integrer hver skåret ud og fast lårbensknogle i methylmethacrylat harpiks og behandle det for uafkalket histologi.
- Skær hver knogle prøve på langs i tyk sektion (200 um) med en cirkulær vandkølet diamant sav.
- Grind hver knogle prøve sektion ned til en tykkelse på 100 um, polere det, og plette det ved hjælp Stevenel blå og van Gieson picrofuchsin pletter.
BEMÆRK: Efter farvning, synes celler i blå, ben i pink, og koraller i brun under lysmikroskopi.
Representative Results
De førnævnte kirurgiske procedurer varede fra 45 til 60 min. Ostectomy og osteosyntese var let at udføre ved hjælp af en kirurg assistent men uden brug af forstørrelsesglas system. Ingen intraoperativ komplikationer forekom. I en foreløbig undersøgelse af 18 mus 11, postoperative røntgenbilleder kan påvises, at knogledefekten længde (3,43 ± 0,12 mm) og pladen positionering (afstanden mellem knæleddet hulrum og den distale del af pladen = 2,65 ± 0,56 mm) var reproducerbare.
Anæstesi-relateret dødelighed var ca. 5%.
Funktionel genopretning af opererede lemmer var fremragende i alle dyr og fuld vægtbærende blev observeret inden for en dag efter operationen (Animeret figur 1). Vægten af osteosyntese (plade og skruer), der anvendes i pgensendte undersøgelse var ca. 0,1% af musenes kropsvægt. Ingen postoperative komplikationer (f.eks sårinfektion, implantat svigt, knogletransplantation migration, etc.) opstod. Ingen skade på sig selv eller skader forårsaget af cagemates indtraf.
Når kirurgisk inducerede knogledefekter blev efterladt tomt, blev ingen signifikant knogledannelse observeret med konsekvent knogle ikke-union. I modsætning hertil, når defekterne var fyldt med enten en isotransplantat eller en koral stillads, nydannede knogle strækker sig fra den proximale og distale knogle kanter blev observeret. Hertil kommer, mens knogledannelse tilladt reetablering af knogle kontinuitet i de fleste defekter behandlet med isografter (figur 8), blev det kun observeret inde koraller stillads i defekter fyldt med dette materiale. Faktisk blev ingen knogle observeret ved en afstand på mere end 1 mm fra benede kanter. Fravær af brusk i alle histologiske analyser resultater er bevis forstabilitet af en opnået osteosyntese (figur 9, figur 10).
Røntgenbilleder og microCT analyser dokumenteret, at knogle union ikke forekomme i alle dyr af defekten-venstre-tom gruppe, 10 uger efter implantation. Mængden af mineraliseret væv vurderet af microCT analyser var 0,8 ± 0,3 mm 3 og var repræsentativ for den nydannede-bone. I de isotransplantat og koraller stillads grupper blev knogle union opnået i 4 og 4 dyr hhv. Volumenet af mineraliseret væv vurderes ved microCT analyser var 4,4 ± 0,9 mm3 og 8,9 ± 0,7 mm3. I disse grupper, men fordi både isotransplantat og koraller stillads indeholdt mineraler, ny knogledannelse ikke kunne være virkelig skelnes fra det resterende implanterede materiale (isotransplantat eller koral stillads). Både antallet af bon union og mængden af mineraliseret væv opnået fra isotransplantat gruppen ogfra koraller stillads gruppen var signifikant (p <0,001) højere end dem, der opnås fra defekt venstre-tom gruppe.
Figur 1:. Kirurgisk Eksponering for Oprettelse af Femoral Segmentoplysninger Defect En 15-17-mm langsgående hud incision, der strækker sig fra hofteleddet til knæleddet, blev lavet over anterolaterale af lårbenet. Fascia lata blev indsnit; vastus lateralis musklen og biceps femoris musklen blev delt for at blotlægge den fulde længde af den femorale diafysen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: PlatePositionering og proksimal skrueplacering. Pladen blev påført på den forreste femorale side. Den mest proximale hul af pladen blev boret; den første skrue blev indsat, og derefter, låst. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Distal skrueplacering Den mest distale hul af pladen blev boret og skruen blev indsat og låst. (Gengivet med tilladelse fra Tissue Eng del C, 2013, 19 (4), 271-280) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Gigli Saw Positionering. De andre to yderste skruer blev indsat, men ikke låst og tråden af de 0,22 mm Gigli save var bundet tæt omkring knoglen i en medio-lateral retning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Jig Positionering jig blev indsat på stilken af de to sidstnævnte skruer og anvendes over pladen og tråden af saven blev derefter indsat i spalterne i udspændingsanordningen.. (Gengivet med tilladelse fra Tissue Eng del C, 2013, 19 (4), 271-280) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:. Ostectomy Ostectomy blev udført, og Gigli sav blev trukket tilbage. (Gengivet med tilladelse fra Tissue Eng del C, 2013, 19 (4), 271-280) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7:. Indvendige Skruer Låsning Rensesoldet blev fjernet, og de to sidste skruer låst. De segmentdefekter blev derefter enten venstre tomme eller fyldt med de testede materialer. (Gengivet med tilladelse fra Tissue Eng del C, 2013, 19 (4), 271-280) Klik her for at se en større version af dette tal.
t = "Figur 8" src = "/ files / ftp_upload / 52.940 / 52940fig8.jpg" />
Figur 8: Repræsentant Postoperativ Røntgenbilleder og Sagittal μCT Rekonstruktion af lårbensknogle af mus lårbensknogle med den respektive defekt enten venstre tomme (AE), eller fyldt med massive syngen knogletransplantat (FJ), eller fyldt med massive Acropora koraller stilladser (KO. ); umiddelbart efter kirurgi (A, F, K), 4 uger efter operationen (B, G, L), 6 uger efter operationen (C, H, M), og 10 uger efter operation (D, E, I, J, N , O) (plade længde = 10 mm). (Gengivet med tilladelse fra Tissue Eng del C, 2013, 19 (4), 271-280) Klik her for at se en større version af dette tal.
filer / ftp_upload / 52.940 / 52940fig9.jpg "/>
. Figur 9: Repræsentant Røntgenbillede, μCT Genopbygning og histologi af en Defect Fyldt med Coral Stillads Testet i nærværende undersøgelse En stor del af nydannet knogle blev observeret i-mellem de omkringliggende benede kanter og koraller stillads; derimod lille knogle var til stede inde i stilladset. Pletter: Stevenel Blå og von Gieson picrofuchsin. Under disse betingelser, knogle, celler og koraller farves røde, blå og brune, hhv. Scale bar = 500 um. ACS = Acropora koraller stillads; BN = knogle. (Gengivet med tilladelse fra Tissue Eng del C, 2013, 19 (4), 271-280) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: repræ sentant Histologi af en defekt Venstre Empty (A), Fyldt med Massive syngene Bone Graft (B), og Fyldt med Coral Stillads (C). I mangel tomt, afrunding af den benede kanter med medullær kanalen påfyldning og rigelige fibrøst væv dyb i defekten blev observeret. I defekten fyldt med massiv syngene knogletransplantat, observeredes knogle kontinuitet mellem implantatet og de omgivende benede kanter; knoglemarv var til stede i hele det oprindelige hulrum. I defekten fyldt med koral stillads, iagttoges nydannet knogle mellem de omgivende benede kanter og koraller stillads, men lille knogle var til stede inde i stilladset. Pletter: Stevenel Blå og von Gieson picrofuchsin. Under disse betingelser, knogle, celler og koraller farves røde, blå og brune, hhv. Scale bar = 500 mm. ACS, koral stillads; BN, ben; BM, knoglemarv; FT, fibrøst væv. (Genoptrykt med tilladelse fra Tissue Eng del C, 2013, 19 (4), 271-280)OAD / 52.940 / 52940fig10large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Animerede / video Figur 1: Repræsentant video af gangart på en mus en dag postoperativt. Fuld vægt bærende blev observeret. Klik her for at se denne video.
Discussion
Ektopisk implantation af ortopædiske-relaterede materialer og indretning i mus almindeligvis udføres for at vurdere knogledannende kapacitet af forskellige skeletter 13,14. Vigtige forskelle dog eksistere mellem ektopiske og ortotopisk modeller, herunder indfødte osteogent signalering faktorer og parakrine interaktioner med værten knogledannende celler.
Den foreliggende undersøgelse etablerer en reproducerbar murine stor segmentær, kritisk størrelse femoralis defekt (3,5 mm, ca. 20-25% af lårben længde). I betragtning af størrelsen af en sådan defekt og stabilitet, som den resulterende plade osteosyntese, denne model efterligner den klinisk-stødt atrofisk knogle ikke-union.
Den post-operative periode valgt i nærværende undersøgelse, er i overensstemmelse med tidligere beskrevne ikke-union modeller mus, viser en mangel på tilstrækkelig heling efter 8 til 12 uger 4,9,15,16.
Vigtigst, reproduCIBLE og stabil osteosyntese, samt stabiliteten af de implanterede knoglesubstitutter blev opnået uden signifikant morbiditet og mortalitet 1,2 med anvendelse af både låseplade og en jig at udføre ostectomy. Dette resultat står i kontrast også resultaterne rapporteret når enten en udvendig fikseringsindretning eller et intramedullært søm blev anvendt 4,5,17-24. For de eksterne fikseringsindretninger potentielle ulemper omfatter: variabilitet i stivhed, infektioner af stifterne skrifter, løsning af stifterne, potentialer skader som følge benene og af materialerne (4 til 20% af musenes kropsvægt). For det intramedullære søm potentielle ulemper omfatter: fyldning af medullære kavitet med neglen og iatrogen skade af ledfladerne.
Andre murine segmenter, kritisk størrelse femorale defekter stabiliseret ved plade osteosyntese er blevet beskrevet med knogle defekt skabt af en burre og spænder fra 1,5 til 2 mm længde 16,25. I the foreliggende model, anvendelse af en jig og en savtråd muliggjorde en nøjagtig 3,5 mm langt ostectomy uden væsentlige muskler traumer.
Men for at lykkes i at udføre proceduren bør man tage på betragtning flere vigtige punkter: Brug ikke små mus (Nude mus med enten en vægt under 25 g eller alder under 8 uger) ellers pladen skal være for lang. Når man nærmer sig lårbensknogle, sørge for at bevare både iskiasnerven kaudalt og artikulære kapsel distalt. Påfør pladen på den forreste side af den femorale knogle og da tilpasningen af pladen bestemmes ved anvendelse af dette første skrue, sørge for at placere pladen parallelt til lårbenet ved isætning denne første skrue.
Før det ostectomy, sørge for at udføre en cirkulær dissektion af lårbenet i midten af diafysen at undgå muskulære traumer. Ved udførelse af ostectomy, skal kirurgen assistent holde fast vejledning og surGeon skal passe (i) ikke at tangle savtråden, (ii) at anvende de midterste to tredjedele af tråden, mens anvendelse en konstant jævn spænding, og (iii) for at undgå overskydende bevægelse for at opnå en lige knogle snit.
Knogleheling er muligt i den foreliggende model billede anvendes en knogletransplantation. Desuden denne model giver mulighed for yderligere undersøgelser af de involverede i knogler udskiftning strategier mekanismer, når enten menneske-oprindelse podninger eller celler anvendes i et godt standardiseret, store, segmentær, knogledefekt.
Endvidere i overensstemmelse med den nuværende udvikling kræver forbedring og reducering af anvendelse af dyr i ortopædi-relateret forskning, denne model kan anvendes sammen med in vivo billedteknik såsom bioluminescens. Sådanne ikke-invasive teknikker tillader overvågning både implanteret celleoverlevelse og væv healing uden at kræve dyr offer 26.
Store begrænsninger for den foreliggende model er både denbærende betingelser og mængden af knogledefekten skabes, fordi de ikke fuldt ud efterligne dem, der optræder klinisk hos mennesker. Andre begrænsninger af modellen, er (i) radio-opaciteten af pladen, som kan kræve fjernelse af pladen før ex vivo μCT analyse og kan komplicere fortolkningen af de langsgående radiografiske undersøgelsesresultater, og (ii) den manglende evne til at modulere plade stivhed som kan være en vigtig mekanisk parameter i knogledannelse 27-30.
Man skal huske på også, ved brug af enten knogle isotransplantat eller andre stilladser indeholder en mineralsk komponent (specifikt calciumcarbonat), at en vis skævhed introduceres i segmentering processen med mikro-CT-analyse, fordi nydannede knogletæthed delvist overlappede med enten isotransplantat densitet eller stillads densitet. Af denne grund knoglevolumen opnå ved mikro-CT analyse meste afspejler mængden af mineraliseret væv (nydannet knogle plusknogle erstatning) 11,26,31.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Rena Bizios for hendes værdifulde kommentarer til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM , Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich, France | M4526 | 500 ml |
| Acropora sp. coral exoskeleton cubes, Biocoral® | Biocoral®, Inoteb, France | 3 x 3 x 3 mm cubes, autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization | |
| Buprenorphine, Buprecare® | Axience, Pantin, France | 0.3 mg/ml | |
| Xylazine, Rompun® 2% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 20 mg/ml | |
| Ketamine, Ketamine 500® | Virbac, Carros, France | 50 mg/ml | |
| Isoflurane, Forène® | Abbott, Arcueil, France | ||
| Enrofloxacine, Baytril® 5% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 50 mg/ml | |
| Pentobarbital, Dolethal® | Vétoquinol, Lure, France | 182.2 mg/ml | |
| Anesthetizing box | Ugo Basile, Gemonio, Italy | 7900/10 | |
| Plastic transparent sterile drape, BusterOpCover 30 x 45 cm | Buster, Coveto, Montagu, France | 613867 | |
| 10% povidone iodine, Vétédine® Solution | Vétoquinol, Lure, France | 100 mg/ml | |
| Titanium micro- locking plate, MouseFix Plate XL | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.120 | 6 holes, 10 mm long and 1.5 mm wide, autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
| 0.3 mm drill bit, Drill Bit 0.30 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.592.200 | autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
| Engine power | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | AccuPen | Cold sterilzation (ethylene oxide) |
| Screw driver, Handrill | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.390.130 | autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
| Self-tapping locking screws, MouseFix Screw 2 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.100 | 2 mm long, 0.47 mm outer diameter and 0.34 mm core diameter, autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
| Jig, MouseFix XL Drill and Saw Guide | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.301.103 | 3.5 mm between the slots, autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
| 0.22-mm Gigli saws (0.22 mm Saws) | RISystem AG, Davos, Switzerland | ||
| 5.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
| 4.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
| X-ray, MX20 | Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie | ||
| In vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1176 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
| Ex vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1172 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
| Resident software: Nrecon (v1.6.9) / Ctan (v.1.14.4) | Skyscan, Aartselaar, Belgium |
References
- Auer, J. A., et al. Refining animal models in fracture research: seeking consensus in optimising both animal welfare and scientific validity for appropriate biomedical use. BMC Musculoskelet Disord. 8 (72), (2007).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Horner, E. A., et al. Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice. Tissue Eng. Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).
- Srouji, S., et al. A model for tissue engineering applications: femoral critical size defect in immunodeficient mice. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (5), 597-606 (2011).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Orthop Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
- Harris, J. S., Bemenderfer, T. B., Wessel, A. R., Kacena, M. A. A review of mouse critical size defect models in weight bearing bones. Bone. 55 (1), 241-247 (2013).
- Garcia, P., et al. The LockingMouseNail--a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. J. Surg. Res. 169 (2), 220-226 (2011).
- Garcia, P., Histing, T., Holstein, J. H., Pohlemann, T., Menger, M. D. Femoral non-union models in the mouse. Injury. 41 (10), 1093-1094 (2010).
- Garcia, P., et al. Development of a reliable non-union model in mice. J. Surg. Res. 147 (1), 84-91 (2008).
- Viateau, V., Logeart-Avramoglou, D., Guillemin, G., Petite, H. Animal Models for bone tisue enginering purposes. Sourcebook of models for biomedical research. Conn, P. M. , Humana Press. 725-738 (2008).
- Manassero, M., et al. A novel murine femoral segmental critical-sized defect model stabilized by plate osteosynthesis for bone tissue engineering purposes. Tissue Eng. Part C Methods. 19 (4), 271-280 (2013).
- Matthys, R., Perren, S. M. Internal fixator for use in the mouse. Injury. 40 Suppl 4, S103-S109 (2009).
- Becquart, P., et al. Ischemia is the prime but not the only cause of human multipotent stromal cell death in tissue-engineered constructs in vivo. Tissue Eng. Part A. 18 (19-20), 2084-2094 (2012).
- Deschepper, M., et al. Proangiogenic and prosurvival functions of glucose in human mesenchymal stem cells upon transplantation. Stem Cells. 31 (3), 526-535 (2013).
- Oetgen, M. E., Merrell, G. A., Troiano, N. W., Horowitz, M. C., Kacena, M. A. Development of a femoral non-union model in the mouse. Injury. 39 (10), 1119-1126 (2008).
- Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
- Zwingenberger, S., et al. Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice. J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).
- Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J. Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
- Claes, L., et al. Hyperhomocysteinemia is associated with impaired fracture healing in mice. Calcif. Tissue Int. 85 (1), 17-21 (2009).
- Drosse, I., et al. Validation of a femoral critical size defect model for orthotopic evaluation of bone healing: a biomechanical, veterinary and trauma surgical perspective. Tissue Eng. Part C Methods. 14 (1), 79-88 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. J. Orthop. Trauma. 23 (5 Suppl), S31-S38 (2009).
- Johnson, K. D., August, A., Sciadini, M. F., Smith, C. Evaluation of ground cortical autograft as a bone graft material in a new canine bilateral segmental long bone defect model. J. Orthop. Trauma. 10 (1), 28-36 (1996).
- Meinig, R. P., Buesing, C. M., Helm, J., Gogolewski, S. Regeneration of diaphyseal bone defects using resorbable poly(L/DL-lactide) and poly(D-lactide) membranes in the Yucatan pig model. J. Orthop. Trauma. 11 (8), 551-558 (1997).
- Wu, J. J., Shyr, H. S., Chao, E. Y., Kelly, P. J. Comparison of osteotomy healing under external fixation devices with different stiffness characteristics. J. Bone Joint Surg. Am. 66 (8), 1258-1264 (1984).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. J. Surg. Res. 192 (2), 454-463 (2014).
- Manassero, M., et al. Comparison of Survival and Osteogenic Ability of Human Mesenchymal Stem Cells in Orthotopic and Ectopic Sites in Mice. Tissue Eng. Part A. 22 (5-6), 534-544 (2016).
- Bos, R. R., et al. Degradation of and tissue reaction to biodegradable poly(L-lactide) for use as internal fixation of fractures: a study in rats. Biomaterials. 12 (1), 32-36 (1991).
- Oest, M. E., Dupont, K. M., Kong, H. J., Mooney, D. J., Guldberg, R. E. Quantitative assessment of scaffold and growth factor-mediated repair of critically sized bone defects. J.Orthop. Res. 25 (7), 941-950 (2007).
- Pihlajamaki, H., Bostman, O., Tynninen, O., Laitinen, O. Long-term tissue response to bioabsorbable poly-L-lactide and metallic screws: an experimental study. Bone. 39 (4), 932-937 (2006).
- Rai, B., et al. Combination of platelet-rich plasma with polycaprolactone-tricalcium phosphate scaffolds for segmental bone defect repair. J. Biomed. Mater Res. A. 81 (4), 888-899 (2007).
- Komlev, V. S., et al. Kinetics of in vivo bone deposition by bone marrow stromal cells into porous calcium phosphate scaffolds: an X-ray computed microtomography study. Tissue Eng. 12 (12), 3449-3458 (2006).
