Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Etablering av en Segmental Femoral kritisk størrelse Defect Modell i Mus stabilisert av Plate osteosintese

Published: October 12, 2016 doi: 10.3791/52940

Introduction

Massive diafysile bein defekter er en stor utfordring for ortopedisk kirurg. Benerstatning med autologt bentransplantasjon, som for tiden betraktes som det gullstandard behandling, er i et begrenset antall, og er forbundet med høsting relaterte sykdommer. Av disse grunner, har vev-konstruert bein konstruksjoner som kombinerer benmarg stamceller med osteoconductive stillaser blitt utforsket som et alternativ for autografts i ortopedisk kirurgi.

Til dags dato, de fleste av studiene er utført i klinisk relevante dyremodeller som hunder, griser og sauer 1-3, men foreløpig vurdering av disse konstruerer i ortotopiske Segment, kritisk størrelse bein defekter i små dyremodeller (som mus) kan ha flere fordeler: (i) lave utgifter, (ii) et stort antall dyr kan betjenes; (Iii) i motsetning til store dyremodeller, homogeniteten av de musestammer begrenser individuelle variasjoner i stillaset resorpsjon ennd beindannelse og; (Iv) viktigst, tilgjengeligheten av spesifikke antistoffer og gen-rettet dyr som gjør det mulig å evaluere den biologiske prosessen involvert i bentilheling. Sist, men ikke minst, bruk av immunsvikt stammer av mus muliggjør også studier ved bruk av enten grafts eller celler av human opprinnelse uten uønskede immunresponser hos mus.

Til tross for de nevnte fordelene, massive diafysile bein defekt modeller i mus er sparsommelig. De fleste av slike modeller bruker ben fiksering med en intramedullær tapp som fyller benmargen hulrom (og dermed begrense volumet av materialet som skal testes), og hindrer også reproduserbarhet ved ikke å gi rotasjon og aksial stabilitet 2,4-7.

Målene for den aktuelle studien er (i) å etterligne en klinisk bein uorganiserte situasjon, for å beskrive en reproduserbar, kritisk størrelse, segmental, femoral feil modell i mus, som er stabilisert av nøyaktig og reproduserbar låseplate osteosynthESIS som gir en svært stabil biomekanisk miljø 8-10; (Ii) for å illustrere den foreliggende modell med to mulige substitutter bein og for å beskrive bendannelse analyser som kan brukes.

Protocol

Etikk Uttalelse: Musene som brukes i denne studien ble behandlet i samsvar med de retningslinjer utgitt av Den europeiske komité for "Pleie og bruk av forsøksdyr" (direktiv 2010/63 / EU og den europeiske konvensjonen ETS 123). Den eksperimentelle protokollen ble godkjent av etikkomiteen av Det medisinske fakultet Lariboisière Saint-Louis (CEEA LV / 2010-01-04).

1. Dyr

  1. Bruk atymisk mus (10 uker gamle). Bruker et minimalt antall av 6 mus med defekten etterlatt tom som negativ kontrollgruppe.

2. Stillas Forberedelse

  1. Syngene Graft Forberedelse
    1. Bruk ben isograft for å fylle defekten for å tilveiebringe styring gruppe med et minimum antall av 6 dyr.
    2. Skaffe bein isografts etter høsting skåret lårbenet fra mus som tilhører enten "feil tomt eller" defekter fylt med koraller stillas "grupper (ther unngår bruk av ekstra dyr for å samle bein isograft) 11.
    3. Skyll resected bein med fosfatbufret saltvann (PBS) og holde det sterilt med fuktig kompress komprimere.
  2. Coral Stillas Forberedelse
    1. Bruk stillaset som er laget av naturlige korall: Acropora sp. korall ytre skjelett kuber, 3 x 3 x 3 mm som potensiell bensubstitutt med et minimum av 6 dyr.
    2. Skjære manuelt hver korall kube til formen av sylinderen (3.5 høyde, 2 mm diameter).
    3. Steriliser hver stillas ved autoklavering (121 ° C i 20 minutter), vaskes med sterilt PBS, og nedsenket det i fullstendig dyrkningsmedium (α-MEM) i 24 timer før implantering i mus.

3. Bedøvelse Prosedyrer og analgesi

  1. Tilveie forebyggende analgesi, 15 minutter før anestesi, ved subkutan injeksjon av buprenorfin (0,1 mg / kg kroppsvekt).
  2. Påfør salven i dyreøyne for å hindre tørrhet hvert 30 min mens dyrene er under narkose.
  3. Plasser mus på en oppvarming pad for å forebygge hypotermi.
  4. Anestesi og analgesi under operasjonen
    1. Injiser intraperitonealt en oppløsning inneholdende xylazin (8 mg / kg) og ketamin (100 mg / kg).
    2. Levere oksygen via strømnings av (50 ml / min).
    3. Bekrefte tilstrekkelig dybde på anestesi ved nærvær av god muskelavslapning og manglende dyr respons til en skadelig stimulus (f.eks., Fast tå klype).
    4. Injiser subkutant en enkelt dose av Enrofloxacin (0,05 mg / kg) som mikrobielle profylakse.
  5. Postoperativ analgesia
    1. Tilveiebringe postoperativ analgesi ved subkutan injeksjon av buprenorfin (0,1 mg / kg) hver 12. time i 3 påfølgende dager.
  6. Anestesi under Diagnostic Imaging prosedyrer
    1. Plasser mus i en anesthetizing-boksen, og deretter fremkalle og vedlikeholde anestesi ved hjelp av ca 4% og 2% isofluran i oksygen, henholdsvis.
    2. Bekrefte tilstrekkelig dybde på anestesi ved god animalsk muskelavslapning, og de manglende bevegelse.
  7. Gjenopprettingsbetingelser
    1. Hold mus på oppvarming pad før full gjenoppretting
    2. Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency etter operasjonen.
    3. Ikke returner et dyr som har gjennomgått kirurgi i selskap med andre dyr før fullt restituert.
  8. Post-operative betingelser
    1. Host musene separat i løpet av de første 3 dagene vert musene med 4 i bur etter dag tre.
    2. Gi vann og tilpasset mat ad libitum. La mus til vekt-bjørnen, uten noen aktivitet begrensning i hele den postoperative perioden.

4. Kirurgisk prosedyre:Femoral Segment Defekt Model 11,12

  1. Etter anestesi, plasserer hver mus i ventral recumbency med venstre bakfot i forlengelsen.
  2. Skrubb lem for aseptisk kirurgi ved anvendelse av 10% povidon-jod i 5 minutter og deretter plassere en steril drapere under lem for å skape en steril overflate (en steril gjennomsiktig drapering brukes for å være i stand til å overvåke luftbevegelse under prosedyren). Er påpasselig med å opprettholde sterilitet av det kirurgiske felt under prosedyren.
  3. Lag en 15-17 mm langsgående snitt i huden over anterolateralt av femur, som strekker seg fra hofteleddet til kneledd.
  4. Incise fascia lata, dele muskelen vastus lateralis og biceps femoris muskler til å utsette hele lengden av femoral diaphysis. Forsiktighet bør tas for å bevare isjiasnerven caudally og leddkapselen distalt (figur 1).
  5. For å styrke femoral diaphysis exposikker, skjære over setemuskelen og biceps femoris fra 3. trochanter.
  6. Utføre en sirkulær disseksjon av femur ved midten av diaphysis.
  7. Påfør en 6-hulls titan mikro-låseplate (10 mm lang, 1,5 mm bred, Vekt: 30 mg) på fremre lår side.
    MERK: hull i platen, som er konisk forsenkede med et sylindrisk parti, imøtekomme titan selvgjengende låseskruer (2 mm lang, 0,47 mm ytre diameter, vekt: 5 mg, med undersiden av hodet skruegjengede for å muliggjøre låsing innenfor platen hull) som er forbundet med en stilk, som vrir seg når den er låst.
  8. Bore den mest proksimale hull i platen ved hjelp av et 0,3 mm bor og enten egen motorkraft eller ikke-utpekt maskinkraft drevet ved 2500 rpm ved omtrent 500 mW 12).
  9. Sett den første skruen med en dedikert skrutrekker og deretter låse den (figur 2).
    MERK: Siden justering av than platen bestemmes ved anvendelse av denne første skrue, er det viktig å plassere platen parallelt med femur ved innsetting av skruen.
  10. Bore den mest distale hull i platen på en lignende måte, sette inn og låse skruen (figur 3).
  11. Sett inn, men gjør ingen lås, de to andre ytre skruer.
  12. Plasser ledningen til 0,22 mm Gigli så tett rundt benet i en medio-lateral orientering og deretter sette det inn i sporene på jiggen (figur 4).
  13. Sett dedikerte jiggen på stammen av de siste to skruene og anvende den over platen (figur 5).
  14. Utfør en 3,5 mm lang mid-diafysile femoral ostectomy bruker Gigli så jeg under vanning (ved hjelp av steril isotonisk saltvann) for å unngå termisk nekrose. Har kirurgen assistent ta jiggen. Har kirurgen bruke en konstant jevn spenning. Vær forsiktig så du ikke å floke sagen wire og å bruke de midterste to tredjedeler av wire. unngå excess bevegelse for å oppnå et rett snitt ben (figur 6).
  15. Etter ostectomy, fjern Gigli så. For å unngå skade på det myke vev, skåret sagtråden nær benet på en side.
  16. Fjerne jiggen og låse de to siste skruene (figur 7).
  17. Enten la segmental defekten tom eller kirurgisk fylle det ved å sette materialer som skal testes inne mangelen.
  18. Værs skylle kirurgiske feltet med sterilt isotonisk saltvann.
  19. Plasser vastus lateralis muskelen løst over platen. Lukk fascia og subkutane flyene ved hjelp av en enkel kontinuerlig sutur mønster og 5,0 glycomer 631 sutur; lukke huden med en enkel avbrutt sutur mønster ved hjelp av 4,0 glycomer 631 sutur. Alternativt er det også mulig å lukke huden ved hjelp av huden lim.

5. In vivo Vurdering av Bone Regeneration

  1. Med musene under narkose utføre røntgenvurderinger i en langsgående måte ved hjelp av både konvensjonelle røntgenstråler (26 kV, 10 sekunder; 2X forstørrelse, 20 linjer / mm romlig oppløsning) og høy oppløsning mikro-computertomografi (μCT).
  2. For μCT analyse, hente bilder med en oppløsning på 36 mikrometer (50 kV og 478 mA, 40 ms eksponeringstid, ved hjelp av en 0,5 mm aluminiumsfilter, rotasjon trinn på 0,7 °, og tomographic rotasjon på 180 º). Analyser bildene ved hjelp av innebygde programvare.

6. ex vivo Vurdering av Bone Regeneration

  1. Ti uker etter operasjonen, indusere anestesi ved bruk av isofluran på oksygen, og deretter ofre mus ved intraperitoneal injeksjon av en overdose av barbiturat (1 ml av pentobarbital).
  2. Eksisere femoral bein, fjerne overliggende muskelvev, og fikse bein prøvene i 4% paraformaldehyde (pH 7,4) i fire dager.
  3. Ta av platen og skruene fra hver skåret bein prøven etter paraformaldehyde fixasjon.
  4. Ex vivo um CT Analysis
    1. Plasser hver skåret ut og fiksert bein i polyetylen rør fylt med 75% alkohol og analysere den ved hjelp av ex vivo μCT.
    2. Hente bilder på 80 kV og 100 uA (eksponeringstiden på 1000 ms, aluminium 0,5 filter, og 4 um kamera pikselstørrelse (2400 x 4000 med en voxel størrelse på 7 pm), gjennomsnittlig fire rammer for hver rotasjon økning på 0,9 º.
    3. Rekonstruere tre-dimensjonale bilder (gjennomsnitt voxel størrelse på 13 mikrometer) ved hjelp av et Hamming-filtrert back-projeksjon med bosatt programvare.
    4. For kvantitativ analyse av beindannelse, bruker bosatt programvare for å få volumet av mineralisert vev (nedre grå terskel på 45 gråskala indekser og øvre grå terskel på 240 gråtoner indekser) i en bestemt og konsekvent regionen av interesse som tilsvarer mangelen.
    5. Gjennomføre analyser på samme måte for hver mus med samme region av interesse.
    6. Bruk enveis analyse test (konfidensintervall - ved 95% og den signifikant nivå på p <0,05) for å sammenligne benet union hastighet og volumet av mineralisert vev i området av interesse mellom gruppene.
  5. histologisk analyse
    1. Embed hver skåret ut og fiksert lårbenet i metylmetakrylat harpiks og behandle den for undecalcified histologi.
    2. Skjær hver bein prøven på langs i tykke delen (200 mikrometer) med en sirkulær vannavkjølt diamant sag.
    3. Grind hver bein prøven delen ned til en tykkelse på 100 mikrometer, polere den, og flekken det ved hjelp Stevenel blå og van Gieson picrofuchsin flekker.
      MERK: Etter farging, celler vises i blått, bein i rosa, og koraller i brunt under lett mikroskopi.

Representative Results

De foran nevnte kirurgiske prosedyrer varte i 45-60 min. Ostectomy og osteosyntese var enkle å utføre ved hjelp av en kirurg assistent, men uten å bruke forstørrelses system. Ingen intraoperative komplikasjoner oppstått. I en forstudie på 18 mus 11, postoperative røntgen gitt bevis for at beinet feil lengde (3,43 ± 0,12 mm) og platen posisjonering (avstanden mellom kvele felles hulrom og den distale delen av platen = 2,65 ± 0,56 mm) var reproduserbar.

Anestesi relaterte dødeligheten var ca 5%.

Funksjonell utvinning av det opererte benet var utmerket på alle dyr og totalvekt bærende ble observert innen en dag etter operasjonen (Animated figur 1). Vekten av osteosyntese (plate og skruer) som brukes i pmisliker studien var omtrent 0,1% av musekroppsvekt. Ingen postoperative komplikasjoner (f.eks, sårinfeksjon, implantat svikt, bein pode migrasjon, etc.) skjedde. Ingen selvskading eller skader forårsaket av cagemates skjedde.

Når kirurgisk-induserte bein defekter var tomt, ble ingen signifikant bendannelse observert med konsekvent bein uorganiserte. I motsetning til dette, da de mangler som var fylt med enten en isograft eller en korall stillas, nydannede ben som strekker seg fra den proksimale og distale benet kanter ble observert. I tillegg, mens bendannelse tillates reetablering av ben kontinuitet i de fleste defekter behandlet med isografts (Figur 8), ble det bare observert på innsiden av koraller stillaset i defekter fylt med dette materiale. Faktisk ble det ikke observert ben i en avstand som er større enn 1 mm fra bein kantene. Fravær av brusk i alt histologiske analyser resultatene gitt bevis forStabiliteten av den oppnådde osteosyntese (Figur 9, Figur 10).

Røntgenbilder og microCT analyser gitt bevis for at bein union ikke forekomme i alle dyr av feilen venstre-tom-gruppen, 10 uker etter implantasjon. Volumet av mineralisert vev vurderes av microCT analyser var 0,8 ± 0,3 mm 3 og var representant for den nydannede-bein. I isograft og korallstillasgrupper, ble bein union oppnådd i 4 og 4 dyr hhv. Volumet av mineralisert vev vurderes av microCT analyser var 4,4 ± 0,9 mm 3 og 8,9 ± 0,7 mm 3. I disse gruppene, men fordi både isograft og koraller stillaset inneholdt mineraler, ny bendannelse kan ikke være helt atskilt fra det resterende implanterte materiale (isograft eller korall stillas). Både frekvensen av bon union og volumet av mineralisert vev hentet fra isograft gruppen ogfra koraller stillaset gruppe var signifikant (p <0,001) høyere enn de som oppnås fra det defekte-venstre-tom gruppe.

Figur 1
Figur 1:. Kirurgisk Eksponering for Opprettelse av Femoral Segment Defect En 15-17 mm langsgående snitt i huden, som strekker seg fra hofteleddet til kneleddet, ble gjort over anterolateralt av femur. Fascia lata ble radert; den muskelen vastus lateralis og biceps femoris muskler ble delt for å utsette hele lengden av femoral diaphysis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: PlatePosisjonering og Proximal Skrue Emisjonen. Platen ble brukt på fremre lår side. Den mest proksimale hullet på platen ble boret; den første skruen ble satt inn, og da låses. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Fig. 3: Distal skrue plasserings Den mest distale hull av platen ble boret og skruen ble innsatt og låst. (Gjengitt med tillatelse fra Tissue Eng del C, 2013, 19 (4), 271-280) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Gigli Saw Positioning. De to andre ytre skruene ble satt inn, men ikke låst og ledningen av 0,22 mm Gigli sager var knyttet tett rundt benet i en medio-lateral retning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Plassering Jig Jiggen var satt inn på stammen av de siste to skruer og påføres over platen og ledningen av sagen ble deretter satt inn i sporene i jiggen.. (Gjengitt med tillatelse fra Tissue Eng del C, 2013, 19 (4), 271-280) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"Figur Figur 6:. Ostectomy Ostectomy ble utført og Gigli sag ble trukket tilbake. (Gjengitt med tillatelse fra Tissue Eng del C, 2013, 19 (4), 271-280) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Fig. 7: Indre Skruer Låsing jiggen ble fjernet, og de siste to skruer låst. Segment defekter var da enten venstre tomt eller fylt med materialer som er testet. (Gjengitt med tillatelse fra Tissue Eng del C, 2013, 19 (4), 271-280) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

t = "Figur 8" src = "/ files / ftp_upload / 52940 / 52940fig8.jpg" />
Figur 8: Representant Postoperativ Røntgenbilder og sagittal μCT Rekonstruksjon av lårbenet hos mus Femoral bein med den respektive feilen enten venstre tom (AE), eller fylt med massive syngeniske bein pode (FJ), eller fylt med massive Acropora korall stillaser (KO. ); umiddelbart etter operasjonen (A, F, K) og 4 uker etter operasjonen (B, G, L), 6 uker etter operasjonen (C, H, M), og 10 uker etter operasjonen (D, E, I, J, N , O) (plate lengde = 10 mm). (Gjengitt med tillatelse fra Tissue Eng del C, 2013, 19 (4), 271-280) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

filer / ftp_upload / 52940 / 52940fig9.jpg "/>
. Figur 9: Representant Røntgen, μCT gjenoppbygging og Histologi på en Defekt Fylt med Coral Stillas Testet i denne studien En stor mengde nydannede benet ble observert i mellom de omkringliggende benete kantene og koraller stillas; i motsetning til dette lille ben var tilstede inne i stillaset. Flekker: Stevenel Blå og von Gieson picrofuchsin. Under disse betingelser, bein, celler, og korall farget rød, blå, brun og, respektivt. Scale bar = 500 mikrometer. ACS = Acropora koraller stillas; BN = bein. (Gjengitt med tillatelse fra Tissue Eng del C, 2013, 19 (4), 271-280) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 10
Figur 10: Repre representanten Histologi på en Defekt tomt (A), Fylt med Massive syngene Bone Graft (B), og fylt med Coral Stillas (C). I mangelen tomt, avrunding av den benete kanter med margkanalen fylling og rikelig bindevev dyp inn i det defekte ble observert. I mangelen fylt med massive syngeniske bein pode, ble observert bein kontinuitet mellom pode og de omkringliggende bein kanter; benmarg var til stede i hele det opprinnelige hulrom. I mangelen fylt med koraller stillaset ble det observert nydannede benet mellom de omkringliggende benete kantene og koraller stillaset, men lite bein var til stede inne i stillaset. Flekker: Stevenel Blå og von Gieson picrofuchsin. Under disse betingelser, bein, celler, og korall farget rød, blå, brun og, respektivt. Scale bar = 500 mm. ACS, korall stillas; BN, bein; BM, benmarg; FT, bindevev. (Gjengitt med tillatelse fra Tissue Eng del C, 2013, 19 (4), 271-280)OAD / 52940 / 52940fig10large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Animert Figur 11
Animert / video Figur 1: Representant video av gangart av en mus en dag postoperativ. Full vektbelastning ble observert. Klikk her for å se denne videoen.

Discussion

Ektopisk implantering av ortopediske-relatert materiale og enhet i mus er vanligvis utføres for å vurdere beinet forming kapasiteter på ulike stillaser 13,14. Viktige forskjeller likevel eksisterer mellom ektopiske og ortotopiske modeller, inkludert innfødte osteogene signalfaktorer og parakrine interaksjoner med vertsbeindannende celler.

Den foreliggende studien etablerer en reproduserbar murine stor segmental, kritisk størrelse femoral defekter (3,5 mm, omtrent 20-25% av femur lengde). Tatt i betraktning størrelsen på slike feil og stabilitet levert av resulterende plate osteosyntese, etterligner denne modellen den klinisk-støtt atrofisk bein uorganiserte.

Den postoperative perioden valgt i denne studien, er i tråd med tidligere beskrevet uorganiserte modeller mus, viser en mangel på tilstrekkelig helbredelse etter 8 til 12 uker 4,9,15,16.

Viktigst, reproducible og stabil osteosyntese, så vel som stabiliteten av de implanterte skjeletterstatninger ble oppnådd uten signifikant morbiditet og mortalitet 1,2 med bruk av både låseplate og en jigg for å utføre ostectomy. Dette resultatet står i kontrast også resultatene rapportert når enten en ekstern fixator eller en benmargsnagle ble brukt 4,5,17-24. For de ytre feste-midler potensielle ulempene omfatter: variabilitet i stivhet, infeksjoner av pinnene veiene, løsner av pinnene, potensialene skader på grunn av pinnene og vekten av det materiale (4 til 20% av musekroppsvekten). For benmargsnaglen potensielle ulempene omfatter: fylling av marghulen med neglen og feilbehandling- av artikulære flater.

Andre murine segmentell, kritisk størrelse femoral defekter stabilisert av plate osteosintese har blitt beskrevet med bein defekt skapt av en Burr og fra 1,5 til 2-mm lengde 16,25. i the liggende modell, bruk av en jigg og en sag ledning tillatt en nøyaktig 3,5 mm lange ostectomy uten betydelige muskler traume.

Men for å lykkes i å utføre prosedyren man bør ta på vederlags flere viktige punkter: Ikke bruk liten mus (Nude mus med enten en vekt under 25 g eller alder under 8 uker) ellers tallerkenen bør være for lang. Når du nærmer deg lårbenet, ta vare å bevare både isjiasnerven caudally og leddkapselen distalt. Påfør platen på den fremre side av lårbenet, og siden innretting av platen bestemmes ved anvendelse av denne første skrue, ta seg for å posisjonere platen parallelt med femur ved innføring av denne første skrue.

Før vi gjør ostectomy, ta vare å utføre en sirkulær disseksjon av femur ved midten av diaphysis å unngå muskel traumer. Når du utfører ostectomy, må kirurgen assistent holde fast guiden og surGeon må være forsiktig (i) ikke å floke sagen wire, (ii) å bruke de midterste to tredjedeler av ledningen, mens bruk av en konstant jevn spenning, og (iii) for å unngå for mye bevegelse for å oppnå en rett ben snitt.

Bentilheling er mulig i den foreliggende modellen gitt en benimplantatet benyttes. Dessuten, denne modellen gjør at videre studier av de mekanismene som er involvert i beinerstatnings strategier når enten menneske-opprinnelse grafts eller celler brukes i en godt standardisert, store, segmental, bein defekt.

I tillegg, i linje til dagens trender som krever raffinering og reduksjon av bruken av dyr i ortopedi rettet forskning denne modellen kan brukes sammen med in vivo imaging-teknikker slik som bioluminescens. Slike ikke-invasive teknikker tillate overvåkning både implantert celle overlevelse og vev healing uten at dyreoffer 26.

Store begrensninger av den foreliggende modell er bådebærende forhold og volumet av bendefekten skapt fordi de ikke fullt ut etterligne de som foreligger klinisk hos mennesker. Andre begrensninger i modellen er (i) den radio-opasitet av platen som kan kreve fjerning av platen før ex vivo μCT analyse og kan komplisere tolkningen av de langsgående radiografisk undersøkelse av resultatene, og (ii) den manglende evne til å modulere plate stivhet hvilken kan være en nøkkel mekanisk parameter i beindannelse 27-30.

Man må huske på også, ved bruk av enten ben isograft eller andre stillasene inneholdende en mineralkomponent (nærmere bestemt kalsiumkarbonat), som noen skjevhet er innført i segmenterfremgangsmåten i mikro-CT-analyse, fordi nydannede bentetthet delvis overlappet med enten isograft tetthet eller stillas tetthet. Av denne grunn benvolum oppnå ved mikro-CT-analyse hovedsakelig gjenspeile mengden av mineralisert vev (nydannede ben plusbensubstitutt) 11,26,31.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Rena Bizios for hennes verdifulle kommentarer til manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM , Minimum Essential Medium Eagle Sigma-Aldrich, France M4526 500 ml 
Acropora sp. coral exoskeleton cubes, Biocoral® Biocoral®, Inoteb, France 3 x 3 x 3 mm cubes, autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization
Buprenorphine, Buprecare® Axience, Pantin, France 0.3 mg/ml
Xylazine, Rompun® 2% Bayer HealthCare, Puteaux, France 20 mg/ml
Ketamine, Ketamine 500® Virbac, Carros, France 50 mg/ml
Isoflurane, Forène® Abbott, Arcueil, France
Enrofloxacine, Baytril® 5% Bayer HealthCare, Puteaux, France 50 mg/ml
Pentobarbital, Dolethal® Vétoquinol, Lure, France 182.2 mg/ml
Anesthetizing box Ugo Basile, Gemonio, Italy 7900/10
Plastic transparent sterile drape, BusterOpCover 30 x 45 cm Buster, Coveto, Montagu, France 613867
10% povidone iodine, Vétédine® Solution Vétoquinol, Lure, France 100 mg/ml
Titanium micro- locking plate, MouseFix Plate XL RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ RIS.401.120 6 holes, 10 mm long and 1.5 mm wide, autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide)
0.3 mm drill bit, Drill Bit 0.30 mm RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ RIS.592.200 autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide)
Engine power RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ AccuPen Cold sterilzation (ethylene oxide)
Screw driver, Handrill RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ RIS.390.130 autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide)
Self-tapping locking screws, MouseFix Screw 2 mm RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ RIS.401.100 2 mm long, 0.47 mm outer diameter and 0.34 mm core diameter, autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide)
Jig, MouseFix XL Drill and Saw Guide RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ RIS.301.103 3.5 mm between the slots, autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide)
0.22-mm Gigli saws (0.22 mm Saws) RISystem AG, Davos, Switzerland
5.0 glycomer 631, Biosyn Covidien, Vétoquinol, Lure, France Tapper-cut needle
4.0 glycomer 631, Biosyn Covidien, Vétoquinol, Lure, France Tapper-cut needle
X-ray, MX20 Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie
In vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1176 Skyscan, Aartselaar, Belgium
Ex vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1172 Skyscan, Aartselaar, Belgium
Resident software: Nrecon (v1.6.9) / Ctan (v.1.14.4) Skyscan, Aartselaar, Belgium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Auer, J. A., et al. Refining animal models in fracture research: seeking consensus in optimising both animal welfare and scientific validity for appropriate biomedical use. BMC Musculoskelet Disord. 8 (72), (2007).
  2. Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
  3. Horner, E. A., et al. Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice. Tissue Eng. Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).
  4. Srouji, S., et al. A model for tissue engineering applications: femoral critical size defect in immunodeficient mice. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (5), 597-606 (2011).
  5. Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Orthop Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
  6. Harris, J. S., Bemenderfer, T. B., Wessel, A. R., Kacena, M. A. A review of mouse critical size defect models in weight bearing bones. Bone. 55 (1), 241-247 (2013).
  7. Garcia, P., et al. The LockingMouseNail--a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. J. Surg. Res. 169 (2), 220-226 (2011).
  8. Garcia, P., Histing, T., Holstein, J. H., Pohlemann, T., Menger, M. D. Femoral non-union models in the mouse. Injury. 41 (10), 1093-1094 (2010).
  9. Garcia, P., et al. Development of a reliable non-union model in mice. J. Surg. Res. 147 (1), 84-91 (2008).
  10. Viateau, V., Logeart-Avramoglou, D., Guillemin, G., Petite, H. Animal Models for bone tisue enginering purposes. Sourcebook of models for biomedical research. Conn, P. M. , Humana Press. 725-738 (2008).
  11. Manassero, M., et al. A novel murine femoral segmental critical-sized defect model stabilized by plate osteosynthesis for bone tissue engineering purposes. Tissue Eng. Part C Methods. 19 (4), 271-280 (2013).
  12. Matthys, R., Perren, S. M. Internal fixator for use in the mouse. Injury. 40 Suppl 4, S103-S109 (2009).
  13. Becquart, P., et al. Ischemia is the prime but not the only cause of human multipotent stromal cell death in tissue-engineered constructs in vivo. Tissue Eng. Part A. 18 (19-20), 2084-2094 (2012).
  14. Deschepper, M., et al. Proangiogenic and prosurvival functions of glucose in human mesenchymal stem cells upon transplantation. Stem Cells. 31 (3), 526-535 (2013).
  15. Oetgen, M. E., Merrell, G. A., Troiano, N. W., Horowitz, M. C., Kacena, M. A. Development of a femoral non-union model in the mouse. Injury. 39 (10), 1119-1126 (2008).
  16. Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
  17. Zwingenberger, S., et al. Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice. J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).
  18. Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J. Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
  19. Claes, L., et al. Hyperhomocysteinemia is associated with impaired fracture healing in mice. Calcif. Tissue Int. 85 (1), 17-21 (2009).
  20. Drosse, I., et al. Validation of a femoral critical size defect model for orthotopic evaluation of bone healing: a biomechanical, veterinary and trauma surgical perspective. Tissue Eng. Part C Methods. 14 (1), 79-88 (2008).
  21. Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. J. Orthop. Trauma. 23 (5 Suppl), S31-S38 (2009).
  22. Johnson, K. D., August, A., Sciadini, M. F., Smith, C. Evaluation of ground cortical autograft as a bone graft material in a new canine bilateral segmental long bone defect model. J. Orthop. Trauma. 10 (1), 28-36 (1996).
  23. Meinig, R. P., Buesing, C. M., Helm, J., Gogolewski, S. Regeneration of diaphyseal bone defects using resorbable poly(L/DL-lactide) and poly(D-lactide) membranes in the Yucatan pig model. J. Orthop. Trauma. 11 (8), 551-558 (1997).
  24. Wu, J. J., Shyr, H. S., Chao, E. Y., Kelly, P. J. Comparison of osteotomy healing under external fixation devices with different stiffness characteristics. J. Bone Joint Surg. Am. 66 (8), 1258-1264 (1984).
  25. Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. J. Surg. Res. 192 (2), 454-463 (2014).
  26. Manassero, M., et al. Comparison of Survival and Osteogenic Ability of Human Mesenchymal Stem Cells in Orthotopic and Ectopic Sites in Mice. Tissue Eng. Part A. 22 (5-6), 534-544 (2016).
  27. Bos, R. R., et al. Degradation of and tissue reaction to biodegradable poly(L-lactide) for use as internal fixation of fractures: a study in rats. Biomaterials. 12 (1), 32-36 (1991).
  28. Oest, M. E., Dupont, K. M., Kong, H. J., Mooney, D. J., Guldberg, R. E. Quantitative assessment of scaffold and growth factor-mediated repair of critically sized bone defects. J.Orthop. Res. 25 (7), 941-950 (2007).
  29. Pihlajamaki, H., Bostman, O., Tynninen, O., Laitinen, O. Long-term tissue response to bioabsorbable poly-L-lactide and metallic screws: an experimental study. Bone. 39 (4), 932-937 (2006).
  30. Rai, B., et al. Combination of platelet-rich plasma with polycaprolactone-tricalcium phosphate scaffolds for segmental bone defect repair. J. Biomed. Mater Res. A. 81 (4), 888-899 (2007).
  31. Komlev, V. S., et al. Kinetics of in vivo bone deposition by bone marrow stromal cells into porous calcium phosphate scaffolds: an X-ray computed microtomography study. Tissue Eng. 12 (12), 3449-3458 (2006).

Tags

Medisin bein mus plate osteosyntese defekt bein isograft koraller tissue engineering bein konstruere dyremodeller beindannelse bein reparasjon
Etablering av en Segmental Femoral kritisk størrelse Defect Modell i Mus stabilisert av Plate osteosintese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manassero, M., Decambron, A., HuuMore

Manassero, M., Decambron, A., Huu Thong, B. T., Viateau, V., Bensidhoum, M., Petite, H. Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis. J. Vis. Exp. (116), e52940, doi:10.3791/52940 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter