Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

qPCRTag Analyse - En High Throughput, Real Time PCR-analysen for Sc2.0 Genotypebestemmelse

doi: 10.3791/52941 Published: May 25, 2015

Abstract

Den Syntetisk Gær Genome Project (Sc2.0) har til formål at bygge 16 designer gær kromosomer og kombinere dem til en enkelt gærcelle. Til dato en syntetisk kromosom, synIII 1, og en syntetisk kromosom arm, synIXR 2, er blevet konstrueret, og deres in vivo funktion valideret i fravær af de tilsvarende vildtype kromosomer. Et vigtigt træk i Sc2.0 kromosomer er indførelsen af ​​PCRTags, som er korte, re-kodede sekvenser i åbne læserammer (ORF'er), der muliggør differentiering af syntetiske kromosomer fra deres vildtype modstykker. PCRTag primere annealer selektivt til enten syntetiske eller vildtype kromosomer og tilstedeværelsen / fraværet af hver type DNA kan testes under anvendelse af en simpel PCR-assay. Standard udlæsningen af ​​PCRTag assayet er at vurdere tilstedeværelse / fravær af amplikoner ved agarosegelelektroforese. Men med en gennemsnitlig PCRTag amplicon densitet på en pr 1,5 kb og agenome størrelse ~ 12 Mb, vil den færdige Sc2.0 genom kode omkring 8.000 PCRTags. For at forbedre gennemløb, har vi udviklet et real time PCR-baseret detektion assay for PCRTag genotypebestemmelse, som vi kalder qPCRTag analyse. Arbejdsgangen specificerer 500 nl reaktioner i en 1536 flerbrøndsplade, giver os mulighed for at teste op til 768 PCRTags med både syntetiske og vilde typen primerpar i en enkelt eksperiment.

Introduction

Sc2.0 eller syntetiske Gær Genome Project ( www.syntheticyeast.org ), har sat det mål at designe og bygge en helt syntetisk eukaryot genom. Brug af stærkt curated genom-sekvensen af Saccharomyces cerevisiae 3 som udgangspunkt, idet hver af de seksten lineære kromosomer er blevet re-designet til at opfylde et sæt design principper, der angiver at opretholde celle fitness, forbedre genom stabilitet og øget genetisk fleksibilitet. For eksempel, er destabiliserende elementer som gentagelser slettet fra Sc2.0 kromosomer. Alle forekomster af TAG stopcodoner er re-kodet til TAA at "frigøre" en codon i den endelige belastning for indførelsen af ​​en ikke-genetisk kodet aminosyre. Derudover et inducerbart evolution-system, Scramble, muliggjort af Cre-lox-systemet, tillader hidtil uset evne til at skabe afledte genomer med nye strukturer 4.

(figur 1A). Design PCRTag udføres under anvendelse af "mest anderledes" algoritme i GeneDesign 5,6, hvor produktet er recoded syntetiske sekvenser, der typisk ~ 60% anderledes end de native sekvenser (minimum 33%) med smeltetemperaturer mellem 58 ° C og 60 ° C og amplikon længder mellem 200-500 basepar 2. Omkodning er ikke tilladt inden de første 100 bp af hver ORF, da disse regioner er kendt for athar særlige præferencer med hensyn til kodonanvendelse 7. Tilsammen udgør disse design regler favoriserer høje ydeevne næsten alle PCRTags under et enkelt sæt PCR betingelser, hvorved syntetiske og vilde typen PCRTag primerpar udelukkende binder og forstærke syntetisk og indfødte DNA, henholdsvis (figur 1B).

Figur 1
Figur 1:. PCRTag skematiske (A) PCRTags er re-kodede sekvenser i åbne læserammer (ORF) af gener på Sc2.0 kromosomer. (B) Syntetisk (SYN) og vildtype (WT) PCRTag primere udelukkende binde og forstærke syntetisk og genomisk vildtype-DNA (gDNA), henholdsvis. Vist her er en analyse af en ~ 30 kb segment af venstre arm af kromosom seks, teste tretten PCRTag primerpar ved hjælp af enten WT eller semi-synVIL2 gDNA som skabelon. I mange tilfælde et enkelt ORF koder mere end en PCRTag. Tilstedeværelse / fravær af PCRTag amplikoner vurderes via agarosegelelektroforese. PCRTag amplikoner varierer i størrelse fra 200 bp til 500 bp. De hurtigere migrerende arter på bunden af ​​pladerne er primerdimerer.

PCRTag analyse har vist sig at være et vigtigt redskab i samlingen af ​​Sc2.0 kromosomer. I et typisk forsøg 30-50 kb af syntetisk DNA, der koder 20-30 PCRTags, transformeres til gærceller til at erstatte det tilsvarende vildtype-DNA 1,2,8. PCRTag analyse anvendes derefter til at identificere transformanter, som koder for syntetiske, men ikke vildtype PCRTags spænder det segment af DNA, eller såkaldt "vindere". Det er normalt nødvendigt at teste flere transformanter for at identificere "vindere", så gennemløb og omkostningerne ved PCRTag analyse er vigtige overvejelser. Øjeblikket to Sc2.0 kromosomer er afsluttet (synIII 1 og synIXR 2), som repræsenterer mindre end 10% af Sc2.0 genomet, altHough mere end halvdelen af ​​de resterende kromosomer undergår i øjeblikket syntese og samling. Omfanget af PCRTag som kræves for dette projekt er hurtigt hurtigere end evnen til at køre geler og manuelt score tilstedeværelsen af ​​syntetisk DNA og fravær af vildtype-DNA.

For at forbedre gennemløb af PCRTag analysen har vi udviklet et workflow ved hjælp af real time PCR til at omgå anvendelsen af ​​agarosegelelektroforese. Arbejdsgangen gør brug af en bulk væskedispenser at distribuere qPCR mastermiksens i hver brønd i en 1.536 flerbrøndsplade, nanoskala akustisk væskedispenser at overføre template-DNA og primere og en 1.536 qPCR thermocycler, tillader os at miniaturisere reaktioner til 500 nl og maksimere throughput. Desuden analyse kan automatiseres. Denne type af high throughput genotyping protokol bør generaliseres til ethvert projekt, der kræver analyse af mange kloner ved multiple loci.

Protocol

1. Klargør Gær Genomisk DNA (gDNA)

  1. Forberede et lager af Gær Lysis Buffer 9, som indeholder 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCI, 1% SDS (w / v), 2% Triton X-100 (v / v), 1 mM EDTA, pH 8,0.
  2. Som udgangsmateriale anvender ~ 2 x 10 6 celler, der typisk svarer til ~ 100 pi mættet kultur for lab stammer af BY4741 10 baggrund. Dyrkede celler bør indsamles ved centrifugering ved 1000 x g i 3 minutter ved stuetemperatur i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Aspirere supernatanten.
  3. Tilsæt 200 pi Gær Lysis Buffer og resuspender cellepelleten ved pipettering.
  4. Tilføj ~ 300 pi af syrevaskede glasperler sådan at niveauet af perler er ca. 1 mm under niveauet af cellen opslæmning.
  5. I et stinkskab tilsættes 200 pi phenol / chloroform / isoamylalkohol (25: 24: 1). Cap mikrofugerøret og sikre, at ingen perler sidder fast mellem hætten og røret, da dette vil resultere i lækager under ryste(Trin 1.6). Vend 3 gange for at blande og kontrollere hætten er forseglet.
  6. Ryst røret i 10 minutter ved stuetemperatur under anvendelse af en bordplade mixer, såsom en Eppendorf 5432.
  7. Centrifuger ved 20.800 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
  8. Transfer 75 ul af den vandige fase til et nyt mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml 100% ethanol. Vend 10 gange for at blande.
  9. Pellettering af DNA ved centrifugering ved 20.800 xg i 20 minutter ved 4 ° C.
  10. Aspirer supernatanten uden at løsne DNA-pelleten. Vask pelleten med 500 pi 70% ethanol.
  11. Centrifuger ved 20.800 xg i 5 min ved 4 ° C.
  12. Aspirere supernatanten uden at løsne DNA pellet og lufttørre pillen med mikrofuge kasket åben indtil overskydende ethanol er fordampet, hvilket er normalt omkring 10 minutter.
  13. Resuspender DNA pellet i 75 pi 10 mM Tris pH 7,4 og vortex at blande. Opbevar prøven ved -20 ° C på ubestemt tid. Måle koncentrationen af ​​DNA i prøven ved anvendelse af enstationære fluorimeteret såsom qubit, hvilket adskiller DNA fra RNA. Sørg for, at den endelige koncentration af gDNA er ~ 1-2 ng / pl.
  14. Der fremstilles en 1:10 fortynding af genomisk DNA under anvendelse af vand og vortex at blande.
  15. Portion 30 pi fortyndet gDNA i den relevante brønd af en kilde plade, der er kompatibel med nanoskala akustisk væskedispenser (trin 3). Hvis du bruger en Labcyte Echo 550, skal du bruge en 384 brønd polypropylen plade (384PP plade).
    BEMÆRK: Når forseglet korrekt denne plade kan opbevares i mindst en måned ved -20 ° C.

2. Forbered og dispensere qPCR Master Mix til et 1536 flerbrøndsplade

  1. Forbered 850 ul qPCR Master mix, såsom LightCycler 1536 DNA Green Master, i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og vortex at blande. Centrifugeres qPCR masterblanding i 2 minutter ved 20.800 xg ved stuetemperatur for at fjerne eventuelle bobler. Komponenterne i qPCR masterblanding kræves for en enkelt 1.536 flerbrøndsplade er som følgers:
    1. Kombiner 170 pi enzym masterblanding (Grøn Master Tube 1, 5x koncentreret), 42,5 pi SYBR (Green Master Tube 4, 20x koncentreret), og 637,5 pi vand.
  2. Dispensere 500 nl / brønd i en 1.536 flerbrøndsplade anvendelse af en bulk-væske, såsom den art Robbins Cobra. (Bemærk, at trin 2.2.1-2.2.4 henviser specifikt til Cobra.)
    1. Opret en dispensering program med følgende indstillinger: flydende klasse, vand; aspirat volumen, 800 pi; dispensere volumen, 500 nl; vaske tid, 20 sek. I dispenseringsmanifolden indstillinger, kontrollere dispenseringsmanifolden er sat til 49,6 mm / sek, dispenseringsmanifolden offset er 0,25 mm, og overskydende indsugede væske vil blive dispenseret tilbage i kilden godt.
    2. Anbring mikrofugerøret der indeholder qPCR Master mix i brønd A1 for mikrofugerør holder, som er placeret i dæk position 1. Skær hætten på mikrofugerøret eller blot lade det åbne. Indstil "Aspirer godt" til A1 ved at redigere Aspirate-indstillinger.
    3. Udfør en vask skridt forud for dispensering qPCR Master Mix ved første de-vælge aspirer og dispensere trin i programmet oprettet i trin 2.2.2 og derefter trykke "run". Når du er færdig, re-markere aspirer og dispensere skridt forud for at køre det fulde program for at dispensere qPCR Master Mix. Hvis Cobra har siddet inaktiv i mindre end 10 min det indledende vasketrin, der tjener til at prime systemet, er unødvendig.
    4. Hit 'run' at dispensere qPCR Master Mix til hver brønd.
  3. Indsamle qPCR mastermix i bunden af ​​hver brønd ved kort centrifugering af 1536 flerbrøndspladen (30 sek ved anvendelse af en lav hastighed PCR-plade spinner).

3. Dispenser Template DNA og primere ind i 1.536 flerbrøndspladen

  1. Dispensere 5 nl fortyndet gDNA (trin 1.3) i de ønskede brønde i 1536 flerbrøndspladen anvendelse af et akustisk væske transfersystemet, såsom Echo 550.
    1. For Echo 550, bruge Plate Reformat software eller alternativt give en brugerdefineret Excel-regneark til at programmere overførslen. Sikre den valgte kilde godt for gDNA i programmet matcher kilde langt ind som du har fysisk dispenseret for gDNA (trin 1.3). Vælg kilden pladetype '384PP_AQ_BP2', som angiver væsken i 384PP pladen er en buffer uden overfladeaktive midler.
  2. Dispensere 10 nl af primere, forblandet frem og tilbage til en slutkoncentration på 50 uM hver, til de ønskede brønde i 1536 flerbrøndspladen anvendelse af et akustisk væske transfersystemet, såsom Echo 550.
    1. For væsken transfersystem bruge Plate Reformat software eller alternativt give en brugerdefineret Excel-regneark til at programmere overførslen.
      BEMÆRK: Her er det muligt at dispensere primere, således at layoutet på 1.536 flerbrøndspladen matcher kromosomale rækkefølge af primerne, så det er let at visuelt at undersøge real time PCR resultatersenere (trin 6).
    2. Premix primerne i en plade, der er kompatibel med den akustiske væskedispenser. For Echo 550, skal du bruge en Labcyte 384LDV (lav døde volumen) plade og vælge kilden plade type »384LDV_AQ_B ', når du programmerer Echo at angive væsken er en simpel buffer uden proteiner.

4. Seal og Centrifuger 1536 flerbrøndspladen

  1. Under anvendelse af et mikroplade sealer system som Plateloc Thermal Microplate Sealer, straks forsegle 1.536 flerbrøndspladen anvendelse af optisk klart forsegling, der er kompatibel med den varme sealer instrument. Rør ikke ved overfladen af ​​pakningen for at undgå plamage mærker.
    1. Hvis du bruger Plateloc Thermal Microplate Sealer Brug følgende indstillinger: forsegle tid 2,0 sek, sæl temperatur 162 ° C, lufttryk 82 psi. Dette instrument tager ~ 5 min at varme op, og så skal være tændt på forhånd.
    2. Hvis du bruger Plateloc Thermal Microplate Sealer, en adapter må anvendes til at hæve højden af ​​1536 flerbrøndsplade på scenen af ​​instrumentet for at sikre god tætning.
      BEMÆRK: Selv om det er at foretrække at købe en Stage Plate for Plateloc Thermal Microplate Sealer, en alternativ løsning er at indsætte fire ~ 2 mm tykke standard skiver til rådighed på enhver hardware butik i hjørnerne for at øge højden af ​​1536 flerbrøndspladen.
  2. Umiddelbart centrifugeres forseglede 1.536 flerbrøndspladen ved 2.000 xg i 3 minutter ved stuetemperatur til at indsamle alle reagenser ved bunden af ​​hver brønd.

5. Real Time PCR

  1. Program en 1.536 qPCR instrument, såsom LightCycler 1536 med en to-trins amplifikationsprotokol efterfulgt af en smelte kurve analyse. Brug af LightCycler 1536 softwaren oprette et program som følger:
    1. Præinkubering: 95 ° C, 1 min hold, rampe sats 4,8 ° C / sek, ingen købet.
    2. To Trin Amplifikation: 30 cykler af [95 ° C, ingen hold,rampe sats 4,8 ° C / sek, ingen erhvervelse 64 ° C, 30 sek hold, stigningsgrad 2,5 ° C / sek, enkelt erhvervelse].
    3. Smelt kurve: 95 ° C, 10 sek, rampe sats 4,8 ° C / sek, ingen erhvervelse 60 ° C, 1 min, stigningsgrad 2,5 ° C / sek, ingen erhvervelse; 97 ° C, rampe sats 0,1 ° C / sek, 5 akkvisitioner / ° C (kontinuerlig).
    4. Cool: 40 ° C, 30 sekunder, stigningsgrad 2,5 ° C / sek, ingen erhvervelsen.
  2. Sæt Detection Format til "Grøn indlejringsfarvestof 'i fanebladet Run Definition.
  3. Sæt pipettering kontrol til 'Master Control' på fanen Run Definition. Denne funktion tjener som en intern kontrol og detekterer tilstedeværelsen af ​​qPCR Master mix i hver brønd på 1.536 flerbrøndsplade, som er nyttig til at identificere formodede falske negative.
  4. Sæt 1536 flerbrøndspladen forberedt i trin 2-4 i 1536 qPCR instrument og køre programmet.

6. Data Analysis

  1. PerfOrm visuel inspektion af data inden for qPCR-softwaren.
    BEMÆRK: 1536-softwaren giver mulighed for visualisering af både forstærkning og smelte kurver, samt en varme kort, der viser opkaldet (positive, negative, ugyldig, N / A, figur 2), overgangsstedet værdi (glidende farveskala for positiv eller grå for negativ, figur 3), eller værdien af en endpoint fluorescens (EPF) (glidende farveskala).
  2. Eksport af data fra 1536 Software i form en .txt-fil (resultater tabel) eller .xml fil med enten de rå data eller beregnede data til behandling offline fra instrumentet.
    BEMÆRK: proprietære automatiserede overgangssted (Cp) kalder algoritme indbygget i 1536-softwaren tager hensyn til form og hældning af forstærkning kurven, mens fastlæggelsen positive / negative og CP værdi opkald med høj selvtillid, ved lav sub mikroliter reaktionsvolumener med forholdsvis lav fluorescensværdier.
  3. Hvis LightCycler DNA Green Master var brugd for qPCR, kontrollere, at alle brønde bestået "master kontrol«. Fail angiver brønden ikke modtog qPCR Master mix og den manglende datapunkt bør betragtes som en potentiel falsk negativ. Kontroller, at alle brønde bestået "master kontrol«. Fail angiver brønden ikke modtog DNA mastermiksens og overveje det manglende datapunkt en potentiel falsk negativ.

Representative Results

Vi testede syntetiske og vildtype kromosom 3 PCRTag primerpar 1 med gær-genomisk DNA (gDNA) ekstraheret fra fire forskellige stammer. Kromosom 3 har 186 PCRTag primerpar, der spænder over længden af kromosomet (synIII er ~ 270 kb og vildtype kromosom 3 er ~ 315 kb). For at teste hver af de fire stammer med begge sæt primere, vi delt flerbrøndspladen i fire kvadranter, en for hver type gDNA, tildele syntetiske PCRTag primere til den øverste halvdel af hver kvadrant og vildtype til den nederste halvdel. Genomisk DNA blev ekstraheret fra gærstammer, hvoraf to koder vildtype kromosom 3 (vildtype, synIXR 2), mens de resterende to koder syntetisk kromosom 3 (synIII 1, synIII synIXR). qPCR Master Mix blev dispenseret i hver brønd i en 1.536 flerbrøndsplade anvendelse af en bulk-væskedispenser, efterfulgt af gDNA og PCRTag primere ved hjælp af Echo 550. Primere blev opstillet på samme måde ihver kvadrant af flerbrøndspladen for nem visuel sammenligning. Flerbrøndspladen blev derefter varmeforseglet med optisk klare tætning og underkastes real time PCR-analyse.

I denne qPCRTag eksperiment observerede vi, for det meste, amplifikation som forventet, hvorved syntetiske primere udelukkende amplificerede syntetiske DNA og omvendt (figur 2 og 3). Vi har imidlertid også observeret flere afvigelser fra det forventede mønster, hvilket tyder falsk negative og falsk positive i datasættet. I dette forsøg blev masterkontrollen påvist i 100% af brønde, hvilket indikerer bulk væskedispenser held dispenseret mastermiksens i hver brønd på pladen (data ikke vist). Dette udelukker en potentiel kilde til falsk negative resultater. Derudover er nogle kromosom 3 PCRTags kendt at mislykkes (vist i figur S6 og S7 af Annaluru et al. 1), herunder mindst 2 SYN og 1 WTprimerpar; således disse brønde kan ignoreres i hver kvadrant. Ægte falsk negative kunne opstå en mangel på overførsel af template gDNA eller primere, men i vores erfaring, da den korrekte kalibrering af Echo 550 samt forberedelse af gDNA og primere som beskrevet, har det ikke været en væsentlig kilde til fejl. Samlet i dette eksperiment falsk negative været ekstremt lav for WT primere med WT skabelon (~ 2%) selvom noget højere for SYN primere med SYN DNA (~ 8%).

Falske positiver, påvisning af signalet i brønde, hvor SYN primere blandes med WT gDNA (og omvendt), kan skyldes cross amplifikation eller primerdimerer. Faktisk primerdimerer ofte er synlige ved gelelektroforese (figur 1 B) og udgør en rimelig fejlkilde. Ved anvendelse af qPCR, kan undersøgelsen af ​​smelte- kurver være nyttigt at bestemme, om forskellige arter, såsom primer-dimerer, kan bidrage til et signal. Yderligere, performing et kontrolforsøg, hvorved primerne dispenseres i fravær af template-DNA kan hjælpe med at identificere primere med en tilbøjelighed til at dimerisere. Cross amplifikation kan observeres ved gelelektroforese, især hvis for mange PCR-cykler udføres, eller hvis annealing temperaturen er for lav. Vi har forsøgt at minimere antallet af falske positiver grundet cross amplifikation ved at optimere begge disse parametre for qPCRTag protokollen. Endelig undersøger overgangssted (Cp) værdier for hver brønd kan hjælpe med at identificere primere, der ikke egner sig til real time-baseret detektion (Figur 3, f.eks BB22, Fb22, Bb46, Fb46). Samlet i dette eksperiment falsk positiv-raten var lav for SYN primere med WT skabelon (~ 5%) og højere for WT primere med SYN skabelon (~ 10%).

Figur 2
Figur 2: Plade zonekort viser tilstedeværelse / absence opfordring til en qPCRTag eksperiment. Fire forskellige typer af genomisk DNA (kvadranter adskilt af faste hvide linier) blev underkastet PCRTag analyse ved anvendelse af syntetisk (SYN) og vildtype (WT) kromosom 3 PCRTag primere (stiplede hvide linjer til at adskille SYN (top ) og WT (nederst) i hver kvadrant). WT og synIXR gDNA koder vildtype kromosom 3, hvilket gav amplifikation med WT PCRTag primere. SynIII og synIII synIXR gDNA koder syntetisk kromosom 3, hvilket gav amplifikation med SYN PCRTag primere. Primere er opstillet i henhold til deres venstre-til-højre kromosomal positionering og placeret identisk i de fire kvadranter til sammenligning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Plade varmekort visning (Cp) værdi grænseovergangssted for en qPCRTag eksperiment. Dette er det samme datasæt som i figur 2 og pladen layout er derfor identiske. N / A henviser til »ingen forstærkning". Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Inkorporering af real time PCR detektion i PCRTag genotypebestemmelsesassay er en vigtig udvikling for Sc2.0 projektet, da det giver væsentligt højere gennemløb. Den tidligere arbejdsgang angivne 2,5 pi reaktioner i 384 brønds PCR-plader, 1,5 timer termisk cykling køretid, agarosegelelektroforese, og manuel annotation af gelen.

Arbejdsgangen præsenteres her, kaldet qPCRTag analyse, overvinder flere store flaskehalse. Første, kondenserer en qPCRTag køre 4 x 384 brønds plader i en enkelt eksperiment, der kan behandles, start til slut (plade oprettet plus køretid), i omkring en time. Det er væsentligt at bemærke, at reagenset pris pr godt for qPCRTag analyse er på niveau med den nederste gennemløb agarosegel tilgang. Men ved at omgå gelelektroforese og manuel anmærkning, den qPCRTag workflow giver betydelige besparelser i tid og arbejdskraft, som er de store fordele. Vigtigere at qPCRTag workflow er entirely kompatibel med automatisering.

Et stort problem med brugen af ​​tidstro detektion som udgangssignalet fra PCRTag assayet er antallet af falske positive og falske negative. Da PCRTag primere ikke blev oprindeligt udviklet til brug i real time PCR, forventes det, at ikke alle primerpar vil være egnet til brug med denne udgang. Til dette formål er det vigtigt at validere funktionen og specificiteten af ​​alle PCRTag primerpar til at udelukke den delmængde, der ikke fungerer i realtid assay up front. For eksempel kromosom 3 PCRTag falske positiver og negativer er biprodukter og-large reproducerbar i real time PCR data (figur 2 og 3), og disse kan udelukkes fra yderligere analyser. Endvidere primerpar kendt for at svigte (vurderet ved gelelektroforese og vist i figur S6 og S7 af Annaluru et al. 1) kan også udelukkes. Dette opnås nemt blot excluding defekte primerpar ved oprettelsen af ​​akustiske transfer-protokollen.

Som de fleste analyser med høj kapacitet, vi agter at bruge realtid PCRTag detektion som en primær skærmen for at identificere transformanter, der fortjener yderligere downstream validering. Efterfølgende vil den gyldne standard for sekundær screening forblive PCRTag analyse med gelelektroforese som udlæsning. Ud over anvendelsen af ​​PCRTag analyse for Sc2.0, der kombinerer state-of-the-art nanoskala væske håndteringssystemer med højt gennemløb real time PCR-teknologi muliggør hurtig og automatiseret analyse og har potentiale til at påvirke mange områder. For eksempel kunne denne arbejdsgang anvendes til high throughput screening af biblioteket, infektiøs sygdomsdiagnose, microbiome analyse og banebrydende genom redigering tilgange forsøger at ændre flere loci samtidig.

Disclosures

LAM, NAP, JAM og JDB har intet at afsløre. RC og AL er ansat af Roche Life Science, USA og arbejdede på at udvikle programmet med LAM som en del af et bevis for princippet eksperiment.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet delvist af National Science Foundation Grant MCB-0718846 og Defense Advanced Research Projects Agency Contract N66001-12-C-4020 (til JDB). LAM blev finansieret af en postdoc stipendium fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada. Offentliggørelse af denne artikel er sponsoreret af Roche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast gDNA prep
yeast gDNA custom custom template for real time PCR
Acid-washed glass beads (0.5 mm) Sigma G8772 yeast cell lysis
Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Invitrogen 15593-031 yeast cell lysis
5432 Mixer Eppendorf 5432 yeast cell lysis
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807 yeast cell lysis
Qubit 3.0 Fluorometer Life Technologies Q33216 gDNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit Life Technologies Q32850 gDNA quantification
Labcyte 384PP plate Labcyte P-05525 gDNA source plate
DNA Green Mastermix prep and dispensing
LightCycler 1536 DNA Green Roche 5573092001 real time PCR mastermix
1.5 ml Microfuge Tube Holder ARI EST BD060314-1 microfuge tube holder for deck of Cobra
LightCycler 1536 Multiwell Plate Roche 5358639001
Cobra liquid handling system Art Robbins Instruments 630-1000-10 dispense qPCR master mix into 1536 plate
PCR Plate Spinner VWR 89184-608 cenrifugation of 1536 plate
Template and primer dispensing
PCRTag primers IDT custom premixed forward and reverse, 50 μM each
TempPlate pierceable sealing foil, sterile USA Scientific 2923-0110 temporary seal for PCRTag primer plates
Labcyte LDV 384 well plate Labcyte LP-0200 pre-mixed primer source plate
Echo 550 Liquid Handler Labcyte transfer 2.5 nl drops of primer and template DNA into 1536 plate
Plateloc Thermal Microplate Sealer Agilent G5402-90001 heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run
Clear Permanent Seal Agilent 24212-001 optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage Agilent G5402-20008 can substitute ~2 mm thick washers
Sorvall Legend XTR Thermo Scientfic 75-004-521 centrifuge heat sealed 1536 plate
Industrial Air Compressor Jun Air 1795011 to run the Echo and Heat Sealer
Real Time PCR
LightCycler 1536 Roche requires 220 V outlet

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344, (6179), 55-58 (2014).
  2. Dymond, J. S., et al. Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design. Nature. 477, (7365), 471-476 (2011).
  3. Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274, (5287), 546-547 (1996).
  4. Dymond, J., Boeke, J. The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization. Bioeng Bugs. 3, (3), 168-171 (2012).
  5. Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit. Nucleic Acids Res. 38, (8), 2603-2606 (2010).
  6. Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. Design-A-Gene with GeneDesign. Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).
  7. Lajoie, M. J., et al. Probing the limits of genetic recoding in essential genes. Science. 342, (6156), 361-363 (2013).
  8. Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast. Bioessays. 36, (9), 855-860 (2014).
  9. Dymond, J. S. Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).
  10. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, (2), 115-132 (1998).
qPCRTag Analyse - En High Throughput, Real Time PCR-analysen for Sc2.0 Genotypebestemmelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mitchell, L. A., Phillips, N. A., Lafont, A., Martin, J. A., Cutting, R., Boeke, J. D. qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping. J. Vis. Exp. (99), e52941, doi:10.3791/52941 (2015).More

Mitchell, L. A., Phillips, N. A., Lafont, A., Martin, J. A., Cutting, R., Boeke, J. D. qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping. J. Vis. Exp. (99), e52941, doi:10.3791/52941 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter