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Biology

qPCRTag विश्लेषण - एक उच्च Throughput, Sc2.0 जीनोटाइपिंग के लिए वास्तविक समय पीसीआर परख

doi: 10.3791/52941 Published: May 25, 2015

Abstract

सिंथेटिक खमीर जीनोम परियोजना (Sc2.0) 16 डिजाइनर खमीर गुणसूत्रों का निर्माण और एक एकल खमीर सेल में उनके गठबंधन को करना है। एक कृत्रिम गुणसूत्र, synIII 1, और एक कृत्रिम गुणसूत्र हाथ, synIXR 2 तारीख को, निर्माण और उनके vivo समारोह इसी जंगली प्रकार गुणसूत्रों के अभाव में मान्य किया गया है। Sc2.0 गुणसूत्रों का एक महत्वपूर्ण डिजाइन सुविधा उनके जंगली प्रकार समकक्षों से सिंथेटिक क्रोमोसोम के भेदभाव है कि सक्षम खुला पढ़ने फ्रेम (ORFs) के भीतर कम, फिर से कोडित दृश्य हैं जो PCRTags की शुरूआत है। PCRTag सिंथेटिक या जंगली प्रकार गुणसूत्रों और एक साधारण पीसीआर परख का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता डीएनए के प्रत्येक प्रकार की उपस्थिति / अनुपस्थिति या तो चुनिंदा पानी रखना प्राइमरों। PCRTag परख के मानक readout के agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा amplicons की उपस्थिति / अनुपस्थिति का आकलन करना है। हालांकि, 1.5 केबी और एजी के प्रति एक के एक औसत PCRTag amplicon के घनत्व के साथ~ 12 एमबी की enome आकार, पूरा Sc2.0 जीनोम लगभग 8,000 PCRTags सांकेतिक शब्दों में बदलना होगा। थ्रूपुट में सुधार करने के लिए, हम हम qPCRTag विश्लेषण कहते हैं कि PCRTag जीनोटाइपिंग के लिए एक वास्तविक समय पीसीआर आधारित पता लगाने परख विकसित किया है। कार्यप्रवाह हमें एक ही प्रयोग में सिंथेटिक और जंगली प्रकार प्राइमर जोड़े दोनों के साथ 768 PCRTags अप करने के लिए परीक्षण करने के लिए अनुमति देता है, एक 1536 multiwell थाली में 500 nl प्रतिक्रियाओं निर्दिष्ट करता है।

Introduction

Sc2.0, या कृत्रिम खमीर जीनोम परियोजना ( www.syntheticyeast.org ), डिजाइन और एक पूरी तरह से सिंथेटिक यूकेरियोटिक जीनोम के निर्माण का लक्ष्य निर्धारित किया है। एक प्रारंभिक बिंदु के रूप Saccharomyces cerevisiae 3 की अत्यधिक क्यूरेट जीनोम अनुक्रम का उपयोग करना, सोलह रेखीय गुणसूत्रों में से प्रत्येक कोशिका फिटनेस बनाए रखने के जीनोम की स्थिरता में सुधार, और आनुवंशिक लचीलापन बढ़ रही द्वारा निर्दिष्ट डिजाइन सिद्धांतों का एक सेट को पूरा करने के लिए फिर से तैयार किया गया है। उदाहरण के लिए, ऐसे दोहराता के रूप में अस्थिर तत्व Sc2.0 गुणसूत्रों से नष्ट हो जाती हैं। टैग रोक codons के सभी उदाहरणों में एक गैर आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग अमीनो एसिड की शुरूआत के लिए अंतिम तनाव में एक कोडोन 'मुक्त' करने के लिए TAA करने के लिए फिर से कोडित रहे हैं। इसके साथ ही रचनात्मक-Lox प्रणाली द्वारा सक्षम एक inducible विकास प्रणाली, हाथापाई, उपन्यास संरचनाओं 4 के साथ व्युत्पन्न जीनोम उत्पन्न करने के लिए अभूतपूर्व क्षमता परमिट।

(चित्रा 1 ए) की सुविधा के लिए प्राइमर बाध्यकारी साइटों के रूप में तैयार कर रहे हैं। PCRTag डिजाइन आम तौर पर 58 डिग्री सेल्सियस और 60 डिग्री सेल्सियस के बीच पिघलने तापमान के साथ देशी दृश्यों (न्यूनतम 33%) की तुलना में ~ 60% अलग हैं कि कृत्रिम दृश्यों recoded उपज GeneDesign 5,6 में 'सबसे अलग' कलन विधि का उपयोग किया जाता है amplicon 200-500 आधार जोड़े 2 के बीच लंबाई। इन क्षेत्रों के लिए जाना जाता है के रूप में recoding, प्रत्येक ओआरएफ के पहले 100 बीपी के भीतर की अनुमति नहीं हैकोडोन उपयोग 7 के मामले में विशेष पसन्द है। साथ में, इन डिजाइन नियम सिंथेटिक और जंगली प्रकार PCRTag प्राइमर जोड़े को विशेष रूप से सिंथेटिक और देशी डीएनए, क्रमशः (चित्रा 1 बी) बाँध और बढ़ाना जिससे पीसीआर स्थितियों का एक सेट के तहत लगभग सभी PCRTags के उच्च प्रदर्शन के पक्ष में।

चित्र 1
चित्रा 1:। PCRTag योजनाबद्ध (ए) PCRTags Sc2.0 गुणसूत्रों पर जीनों का खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) के भीतर दृश्यों को फिर से कोडित रहे हैं। (बी) सिंथेटिक (SYN) और जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) PCRTag प्राइमरों विशेष रूप से क्रमशः, बाँध और (gDNA) सिंथेटिक और जंगली प्रकार जीनोमिक डीएनए बढ़ाना। टेम्पलेट के रूप में गुम्मट या अर्द्ध synVIL2 gDNA उपयोग कर या तो तेरह PCRTag प्राइमर जोड़े का परीक्षण गुणसूत्र छह की बाएं हाथ की एक ~ 30 केबी खंड के एक विश्लेषण, यहाँ दिखाया गया है। कई मामलों में एक भी ओआरएफ एक से अधिक पी encodesCRTag। PCRTag amplicons की उपस्थिति / अनुपस्थिति agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से मूल्यांकन किया है। PCRTag amplicons के 200 बीपी से 500 बीपी को आकार में सीमा। पैनल के निचले भाग में तेजी से पलायन प्रजातियों प्राइमर dimers हैं।

PCRTag विश्लेषण Sc2.0 गुणसूत्रों की विधानसभा में एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हो गया है। 20-30 PCRTags एन्कोडिंग सिंथेटिक डीएनए के एक ठेठ प्रयोग 30-50 KB, में, इसी जंगली प्रकार डीएनए 1,2,8 को बदलने के लिए खमीर कोशिकाओं में तब्दील हो जाता है। PCRTag विश्लेषण तो डीएनए के उस खंड में फैले सिंथेटिक नहीं बल्कि जंगली प्रकार PCRTags सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि transformants की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है, या '' विजेताओं तथाकथित। यह '' विजेताओं की पहचान है, इसलिए throughput और PCRTag विश्लेषण की लागत महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं करने के लिए कई transformants के परीक्षण करने के लिए आम तौर पर आवश्यक है। वर्तमान में दो Sc2.0 गुणसूत्रों Sc2.0 जीनोम का कम से कम 10% का प्रतिनिधित्व (synIII 1 और synIXR 2) पूरा हो चुका है, ऑल्टHough अधिक शेष गुणसूत्रों के आधे से अधिक वर्तमान में संश्लेषण और विधानसभा के दौर से गुजर रहे हैं। इस परियोजना के लिए आवश्यक PCRTag विश्लेषण के पैमाने तेजी से सिंथेटिक डीएनए और जंगली प्रकार डीएनए के अभाव की उपस्थिति जैल चलाने के लिए और मैन्युअल रूप में स्कोर करने की क्षमता outpacing है।

हम agarose जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग नाकाम करने के लिए वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग कर एक कार्यप्रवाह विकसित किया है PCRTag परख के throughput में सुधार करना। कार्यप्रवाह एक 1536 multiwell थाली, टेम्पलेट डीएनए और प्राइमरों स्थानांतरित करने के लिए एक nanoscale ध्वनिक तरल निकालने की मशीन के प्रत्येक कुएं में qPCR के mastermix वितरित करने के लिए एक थोक तरल निकालने की मशीन का उपयोग करता है, और एक 1536 qPCR के थर्मल cycler, हमें 500 nl करने के लिए प्रतिक्रियाओं miniaturize करने की इजाजत दी और throughput को अधिकतम। इसके अलावा विश्लेषण स्वचालित किया जा सकता है। उच्च throughput जीनोटाइपिंग प्रोटोकॉल के इस प्रकार के कई loci में कई क्लोन के विश्लेषण की आवश्यकता होती है किसी भी परियोजना के लिए generalizable होना चाहिए।

Protocol

1. (gDNA) खमीर जीनोमिक डीएनए तैयार

  1. 50 मिमी Tris पीएच 8.0, 100 मिमी NaCl, 1% एसडीएस जिसमें खमीर lysis बफर 9 के एक शेयर की तैयारी (w / v), 2% ट्राइटन X-100 (वी / वी), 1 मिमी EDTA 8.0 पीएच।
  2. आम तौर पर BY4741 10 पृष्ठभूमि की प्रयोगशाला उपभेदों के लिए संतृप्त संस्कृति के 100 ~ को μl मेल खाती है जो सामग्री का उपयोग ~ 2 x 10 6 कोशिकाओं, के रूप में शुरू। संवर्धित कोशिकाओं को एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 1,000 XG पर centrifugation द्वारा एकत्र किया जाना चाहिए। सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  3. खमीर lysis बफर के 200 μl जोड़ें और pipetting द्वारा सेल गोली resuspend।
  4. एसिड मोती के स्तर सेल घोल के स्तर से नीचे के बारे में 1 मिमी है कि इस तरह के कांच के मोती धोया की ~ 300 μl जोड़ें।
  5. एक धूआं हुड में isoamyl शराब फिनोल / क्लोरोफॉर्म के 200 μl जोड़ें / (: 24: 25: 1)। Microfuge ट्यूब टोपी और इस झटकों के दौरान लीक में परिणाम देगा के रूप में कोई मोती कैप और ट्यूब के बीच फंस रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के(कदम 1.6)। मिश्रण और टोपी सील है सत्यापित करने के लिए 3 बार पलटना।
  6. इस तरह के एक Eppendorf 5432 के रूप में एक benchtop मिक्सर का उपयोग कर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ट्यूब हिला।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,800 XG पर अपकेंद्रित्र।
  8. स्थानांतरण 100% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर युक्त एक नया microfuge ट्यूब जलीय चरण के 75 μl। मिश्रण करने के लिए 10 बार पलटना।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,800 XG पर centrifugation द्वारा डीएनए गोली।
  10. डीएनए गोली dislodging बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate। 70% इथेनॉल के 500 μl के साथ गोली धो लें।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 20,800 XG पर अपकेंद्रित्र।
  12. डीएनए गोली dislodging और आमतौर पर लगभग 10 मिनट है जो अतिरिक्त इथेनॉल सुखाया गया है जब तक खुला microfuge टोपी, साथ गोली हवा शुष्क बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  13. 75 10mM Tris 7.4 पीएच के μl और मिश्रण करने के भंवर में डीएनए गोली Resuspend। अनिश्चित काल के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना संग्रहीत करें। एक का उपयोग कर नमूने में डीएनए की एकाग्रता उपायशाही सेना से डीएनए जो अलग qubit, जैसे fluorimeter benchtop। GDNA के अंतिम एकाग्रता ~ 1-2 एनजी / μl है कि सुनिश्चित करें।
  14. मिश्रण करने के लिए पानी और भंवर का उपयोग कर जीनोमिक डीएनए के 1:10 कमजोर पड़ने को तैयार है।
  15. विभाज्य एक nanoscale ध्वनिक तरल निकालने की मशीन (चरण 3) के साथ संगत है कि एक स्रोत थाली की उचित कुएं में पतला gDNA के 30 μl। एक Labcyte इको 550 का उपयोग करते हैं, एक 384 अच्छी तरह से polypropylene के प्लेट (384PP प्लेट) का उपयोग करें।
    नोट: उचित सील जब इस प्लेट -20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम एक महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है।

2. एक 1536 multiwell थाली में तैयार है और बग़ैर qPCR के मास्टर मिक्स

  1. मिश्रण करने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब और भंवर में इस तरह के LightCycler 1536 डीएनए ग्रीन मास्टर के रूप में qPCR के मास्टर मिश्रण के 850 μl, तैयार करें। किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए कमरे के तापमान पर 20,800 XG पर 2 मिनट के लिए qPCR के मास्टर मिश्रण अपकेंद्रित्र। एक भी 1536 multiwell थाली के लिए आवश्यक qPCR के मास्टर मिश्रण के घटकों के रूप में अनुसरण कर रहे हैंS:
    1. एंजाइम मास्टर मिश्रण (केंद्रित ग्रीन मास्टर ट्यूब 1, 5x), SYBR की 42.5 μl (20x केंद्रित ग्रीन मास्टर ट्यूब 4) के 170 μl, और पानी के 637.5 μl जुडा है।
  2. बांटना अच्छी तरह से इस तरह के कला रॉबिंस कोबरा के रूप में एक थोक तरल निकालने की मशीन का उपयोग कर एक 1536 multiwell थाली में / 500 nl। (2.2.1-2.2.4 कोबरा के लिए विशेष रूप से उल्लेख कदमों ध्यान दें।)
    1. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक वितरण कार्यक्रम बनाएं: तरल वर्ग, पानी; महाप्राण मात्रा 800 μl; मात्रा 500 nl बग़ैर; समय, 20 सेकंड धो लें। बग़ैर सेटिंग्स में, बग़ैर गति 49.6 मिमी / सेकंड के लिए सेट है सत्यापित, ऑफसेट बग़ैर 0.25 मिमी है, और अधिक से aspirated तरल अच्छी तरह से वापस स्रोत में तिरस्कृत किया जाएगा।
    2. Microfuge ट्यूब की टोपी कट या बस इसे खुला छोड़ डेक स्थिति 1 में स्थित है जो microfuge ट्यूब धारक, की अच्छी तरह से A1 में qPCR के मास्टर मिश्रण युक्त microfuge ट्यूब रखें। Aspirat संपादन करके A1 के लिए 'अच्छी तरह से महाप्राण' सेटई सेटिंग्स।
    3. पूर्व 'रन' मार तो कदम 2.2.2 में स्थापित कार्यक्रम के पहले डे का चयन महाप्राण और बांटना कदमों से qPCR के मास्टर मिक्स वितरण करने के लिए और एक धोने कदम प्रदर्शन करते हैं। एक बार पूरी, महाप्राण फिर से चयन और qPCR मास्टर मिश्रण वितरित करने के लिए पूरा कार्यक्रम चलाने के लिए पूर्व चरणों के बग़ैर। कोबरा प्रधानमंत्री व्यवस्था करने के लिए कार्य करता है जो कम से कम 10 मिनट के प्रारंभिक धोने कदम है, के लिए हाथ पर हाथ धरे बैठा दिया गया है, तो अनावश्यक है।
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से qPCR के मास्टर मिश्रण वितरित करने के लिए 'रन' मारो।
  3. अच्छी तरह से 1536 multiwell प्लेट (एक कम गति पीसीआर प्लेट स्पिनर का उपयोग कर 30 सेकंड) का संक्षिप्त centrifugation द्वारा प्रत्येक के तल पर qPCR के मास्टर मिश्रण लीजिए।

3. बग़ैर टेम्पलेट डीएनए और 1536 multiwell थाली में प्राइमर

  1. ऐसे इको 550 के रूप में एक ध्वनिक तरल हस्तांतरण प्रणाली का इस्तेमाल करते हुए 1536 multiwell थाली के वांछित कुओं में पतला gDNA के 5 NL (1.3 चरण) बांटना।
    1. Ech के लिए550 हे, प्लेट Reformat सॉफ्टवेयर का उपयोग करें या वैकल्पिक रूप से हस्तांतरण कार्यक्रम के लिए एक कस्टम एक्सेल स्प्रेडशीट प्रदान करते हैं। कार्यक्रम आप शारीरिक रूप से gDNA (1.3 चरण) तिरस्कृत किया है अच्छी तरह से जो में स्रोत से मेल खाता में gDNA के लिए अच्छी तरह से चयनित स्रोत सुनिश्चित करें। 384PP थाली में तरल surfactants के बिना एक बफर है जो इंगित करता है स्रोत थाली प्रकार '384PP_AQ_BP2', चुनें।
  2. प्राइमरों, आगे पूर्व मिश्रित और इस तरह के इको 550 के रूप में एक ध्वनिक तरल हस्तांतरण प्रणाली का इस्तेमाल करते हुए 1536 multiwell थाली के वांछित कुओं में 50 माइक्रोन से प्रत्येक की एक अंतिम एकाग्रता के लिए रिवर्स के 10 nl बांटना।
    1. तरल हस्तांतरण प्रणाली के लिए, प्लेट Reformat सॉफ्टवेयर का उपयोग करें या वैकल्पिक रूप से हस्तांतरण कार्यक्रम के लिए एक कस्टम एक्सेल स्प्रेडशीट प्रदान करते हैं।
      नोट: यहाँ यह है कि यह आसान है ताकि 1536 multiwell प्लेट पर लेआउट नेत्रहीन वास्तविक समय पीसीआर परिणाम का निरीक्षण करने के लिए प्राइमरों के गुणसूत्र आदेश से मेल खाता है कि इस तरह के प्राइमरों बांटना संभव हैबाद में (6.)।
    2. ध्वनिक तरल निकालने की मशीन के साथ संगत है कि एक थाली में प्राइमरों Premix। इको 550 के लिए, एक Labcyte 384LDV (कम मृत मात्रा) प्लेट का उपयोग करें और स्रोत थाली प्रकार '384LDV_AQ_B' तरल कोई प्रोटीन के साथ एक साधारण बफर है इंगित करने के लिए इको जब प्रोग्रामिंग का चयन करें।

4. सील और अपकेंद्रित्र 1536 multiwell प्लेट

  1. ऐसे Plateloc थर्मल Microplate मुहर के रूप में एक microplate मुहर प्रणाली का प्रयोग, तुरंत गर्मी मुहर साधन के साथ संगत है कि ऑप्टिकली स्पष्ट मुहर का उपयोग कर 1536 multiwell थाली सील। धब्बा निशान से बचने के लिए सील की सतह को छूने मत करो।
    1. Plateloc थर्मल Microplate मुहर का उपयोग करते हुए, तो निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें: समय 2.0 सेकंड, सील तापमान 162 डिग्री सेल्सियस, हवा का दबाव 82 साई सील। इस उपकरण को गर्म करने के ~ 5 मिनट लगते हैं और इसलिए अग्रिम में चालू किया जाना चाहिए।
    2. Plateloc थर्मल Microplate मुहर का उपयोग अगर, एक adapteआर अच्छा सील सुनिश्चित करने के लिए साधन के मंच पर 1536 multiwell प्लेट की ऊंचाई बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
      नोट: यह Plateloc थर्मल Microplate मुहर के लिए एक स्टेज प्लेट की खरीद करने के लिए बेहतर है, एक वैकल्पिक समाधान 1536 multiwell प्लेट की ऊंचाई बढ़ाने के लिए कोनों में किसी भी हार्डवेयर की दुकान पर उपलब्ध चार ~ 2 मिमी मोटी मानक वाशर डालने के लिए है।
  2. इसके तत्काल बाद अच्छी तरह से प्रत्येक के नीचे स्थित सभी अभिकर्मकों इकट्ठा करने के लिए कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 2,000 XG पर सील 1536 multiwell थाली अपकेंद्रित्र।

5. रीयल टाइम पीसीआर

  1. कार्यक्रम के एक पिघल वक्र विश्लेषण के बाद एक दो कदम प्रवर्धन प्रोटोकॉल के साथ इस तरह LightCycler 1536 के रूप में एक 1536 qPCR के साधन,। इस प्रकार के रूप LightCycler 1536 सॉफ्टवेयर के लिए एक कार्यक्रम की स्थापना का प्रयोग:
    1. पूर्व ऊष्मायन: 95 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट पकड़, रैंप दर 4.8 डिग्री सेल्सियस / सेक, कोई अधिग्रहण।
    2. दो कदम प्रवर्धन: [95 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, कोई पकड़,दर 4.8 डिग्री सेल्सियस / सेकंड रैंप, कोई अधिग्रहण; 64 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड पकड़, रैंप दर 2.5 डिग्री सेल्सियस / सेक, एकल अधिग्रहण]।
    3. पिघल वक्र: 95 डिग्री सेल्सियस, 10 सेकंड, रैंप दर 4.8 डिग्री सेल्सियस / सेक, कोई अधिग्रहण; 60 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट, रैंप दर 2.5 डिग्री सेल्सियस / सेक, कोई अधिग्रहण; 97 डिग्री सेल्सियस, रैंप दर 0.1 डिग्री सेल्सियस / सेक, 5 अधिग्रहण / (निरंतर) डिग्री सेल्सियस।
    4. कूल: 40 ​​डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड, रैंप दर 2.5 डिग्री सेल्सियस / सेक, कोई अधिग्रहण।
  2. भागो परिभाषा टैब में 'ग्रीन intercalating डाई' का पता लगाने प्रारूप तैयार।
  3. भागो परिभाषा टैब में 'मास्टर कंट्रोल' के लिए pipetting के नियंत्रण सेट करें। यह सुविधा एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है और ख्यात झूठी नकारात्मक की पहचान के लिए उपयोगी है, जो 1536 multiwell थाली के प्रत्येक कुएं में qPCR के मास्टर मिश्रण की उपस्थिति का पता लगाता है।
  4. 1536 qPCR के साधन में चरणों 2-4 में तैयार 1536 multiwell थाली डालें और कार्यक्रम चलाते हैं।

6. डेटा विश्लेषण

  1. PerfqPCR के सॉफ्टवेयर के भीतर डेटा का दृश्य निरीक्षण ORM।
    नोट: 1536 सॉफ्टवेयर दोनों प्रवर्धन के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है और कॉल (सकारात्मक, नकारात्मक, अवैध, एन / ए, चित्रा 2) दिखा एक गर्मी नक्शे के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, घटता पिघल (सकारात्मक या भूरे रंग के लिए रंग पैमाने रपट, बिंदु को पार मूल्य नकारात्मक के लिए, चित्रा 3), या एक समापन बिंदु प्रतिदीप्ति (ईपीएफ) मूल्य () रंग पैमाने फिसलने।
  2. कच्चे डेटा या साधन से ऑफ़लाइन प्रसंस्करण के लिए गणना डेटा के साथ या तो 1536 के रूप में सॉफ्टवेयर एक .txt फ़ाइल (परिणाम तालिका) या .xml फ़ाइल से निर्यात डेटा।
    नोट: उच्च विश्वास के साथ सकारात्मक / नकारात्मक और वाणिज्यिक पत्र के मूल्य के कॉल का निर्धारण करते समय 1536 सॉफ्टवेयर में निर्मित मालिकाना स्वचालित पार बिंदु (सीपी) बुला एल्गोरिथ्म तुलनात्मक रूप से कम से कम उप माइक्रोलीटर प्रतिक्रिया मात्रा में खाते में आकार और प्रवर्धन वक्र के ढलान लेता है प्रतिदीप्ति मूल्यों।
  3. LightCycler डीएनए ग्रीन मास्टर उपयोग किया गया था, तोqPCR के लिए विकास, सभी कुओं 'मास्टर नियंत्रण' पारित किया कि सत्यापित करें। एक असफल अच्छी तरह से qPCR के मास्टर मिश्रण और लापता डेटा बिंदु एक संभावित नकारात्मक झूठी विचार किया जाना चाहिए प्राप्त नहीं किया है इंगित करता है। सभी कुओं 'मास्टर कंट्रोल' से पारित कर दिया है कि जाँच करें। एक असफल अच्छी तरह से डीएनए mastermix प्राप्त करने और लापता डेटा बिंदु एक संभावित नकारात्मक झूठी विचार नहीं किया इंगित करता है।

Representative Results

हम चार विभिन्न प्रकारों से निकाले खमीर जीनोमिक डीएनए (gDNA) के साथ सिंथेटिक और जंगली प्रकार गुणसूत्र 3 PCRTag प्राइमर जोड़े 1 का परीक्षण किया। क्रोमोजोम 3 गुणसूत्र की लंबाई है कि अवधि 186 PCRTag प्राइमर जोड़े (synIII है ~ 270 KB और जंगली प्रकार गुणसूत्र 3 ~ 315 KB) है। प्राइमरों के दोनों सेट के साथ चार उपभेदों के प्रत्येक परीक्षा के लिए, हम नीचे आधा करने के लिए प्रत्येक वृत्त का चतुर्थ भाग के शीर्ष आधा और जंगली प्रकार के लिए सिंथेटिक PCRTag प्राइमरों बताए, चार quadrants, gDNA के प्रत्येक प्रकार के लिए एक में multiwell थाली विभाजित। जीनोमिक डीएनए, जंगली प्रकार गुणसूत्र 3 (जंगली प्रकार, synIXR 2) सांकेतिक शब्दों में बदलना, जिनमें से दो खमीर उपभेदों से निकाला गया था शेष दो सांकेतिक शब्दों में सिंथेटिक गुणसूत्र 3 (synIII 1, synIII synIXR) है। qPCR के मास्टर मिश्रण में हूबहू arrayed थे इको 550 प्राइमरों का उपयोग gDNA और PCRTag प्राइमरों के बाद थोक तरल निकालने की मशीन, एक का उपयोग कर 1536 multiwell थाली के प्रत्येक कुएं में तिरस्कृत किया गया थाआसान दृश्य तुलना के लिए multiwell थाली के प्रत्येक वृत्त का चतुर्थ भाग। multiwell थाली तो ऑप्टिकली स्पष्ट मुहर के साथ सील कर दिया है और वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण के अधीन गर्मी थी।

उम्मीद के रूप में इस qPCRTag प्रयोग में हम सिंथेटिक प्राइमरों विशेष रूप से कृत्रिम डीएनए और इसके विपरीत प्रवर्धित, जिससे अधिकांश हिस्सा है, प्रवर्धन के लिए मनाया (आंकड़े 2 और 3)। हालांकि, हम भी डाटासेट में झूठी नकारात्मक और झूठी सकारात्मक सुझाव है, उम्मीद की परिपाटी से कई विचलन मनाया। इस प्रयोग में, मास्टर नियंत्रण सफलतापूर्वक अच्छी तरह से थाली पर हर में mastermix तिरस्कृत थोक तरल निकालने की मशीन का संकेत है, कुओं की 100% में पाया गया था (डेटा) नहीं दिखाया। इस झूठी नकारात्मक से एक संभावित स्रोत के नियमों के बाहर। साथ ही, कुछ गुणसूत्र 3 PCRTags कम से कम 2 SYN और 1 गुम्मट सहित (आंकड़े S6 में दिखाया गया है और Annaluru एट अल के S7 है। 1) विफल करने के लिए जाना जाता हैप्राइमर जोड़े; इस प्रकार इन कुओं प्रत्येक चक्र में ध्यान नहीं दिया जा सकता है। यह सच है कि झूठी नकारात्मक सही इको 550 की जांच के साथ-साथ gDNA की तैयारी के रूप में वर्णित प्राइमरों दिया, हमारे अनुभव में हालांकि, टेम्पलेट gDNA या प्राइमरों के हस्तांतरण की कमी से पैदा हो सकता है, इस त्रुटि का एक प्रमुख स्रोत नहीं किया गया है। कुल मिलाकर इस प्रयोग में झूठी नकारात्मक दर गुम्मट टेम्पलेट (~ 2%) SYN के डीएनए (~ 8%) के साथ SYN प्राइमरों के लिए कुछ हद तक उच्च हालांकि साथ गुम्मट प्राइमरों के लिए बेहद कम था।

झूठी सकारात्मक, syn प्राइमरों गुम्मट gDNA (और इसके विपरीत) के साथ मिश्रित कर रहे हैं, जहां कुओं में संकेत का पता लगाने, पार प्रवर्धन या प्राइमर dimers से पैदा कर सकते हैं। दरअसल, प्राइमर dimers जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 1 बी) द्वारा अक्सर दिखाई दे रहे हैं और त्रुटि के एक उचित स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं। QPCR के आवेदन के लिए, पिघल घटता की परीक्षा ऐसे प्राइमर dimers के रूप में विभिन्न प्रजातियों, एक संकेत के लिए योगदान किया जा सकता है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए उपयोगी हो सकता है। इसके अलावा, perfप्राइमरों dimerize करने के लिए एक प्रवृत्ति के साथ प्राइमरों की पहचान में मदद कर सकते हैं टेम्पलेट डीएनए के अभाव में तिरस्कृत कर रहे हैं जिसके तहत एक नियंत्रण प्रयोग orming। भी कई पीसीआर चक्र प्रदर्शन कर रहे हैं या यदि annealing तापमान बहुत कम है क्रॉस प्रवर्धन विशेष रूप से, जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा मनाया जा सकता है। हम qPCRTag प्रोटोकॉल के लिए इन मानकों के दोनों अनुकूलन के द्वारा की वजह से पार प्रवर्धन करने के लिए झूठी सकारात्मक की संख्या को कम करने की कोशिश की है। अंत में, वास्तविक समय के आधार पर पता लगाने के लिए उपयुक्त नहीं हैं कि प्राइमरों की पहचान में मदद कर सकते हैं अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए पार बिंदु (सीपी) मूल्यों का परीक्षण (जैसे चित्रा 3, Bb22, Fb22, Bb46, Fb46)। कुल मिलाकर इस प्रयोग में झूठी सकारात्मक दर SYN टेम्पलेट (~ 10%) के साथ गुम्मट प्राइमरों के लिए WT टेम्पलेट (~ 5%) और उच्चतर के साथ SYN प्राइमरों के लिए कम था।

चित्र 2
चित्रा 2: उपस्थिति / अब प्रदर्शित कर प्लेट गर्मी के नक्शेएक qPCRTag प्रयोग के लिए समझ में कॉल। SYN अलग करने के लिए सफेद लाइनें धराशायी जीनोमिक डीएनए (चतुर्भागों ठोस सफेद लाइनों से विभाजित) सिंथेटिक (SYN) का उपयोग PCRTag विश्लेषण के अधीन थे और जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) गुणसूत्र 3 PCRTag प्राइमरों (के चार अलग अलग प्रकार के (ऊपर प्रत्येक चक्र में) और WT (नीचे))। WT और synIXR gDNA। SynIII और synIII synIXR gDNA SYN PCRTag प्राइमरों के साथ प्रवर्धन उपज, सिंथेटिक गुणसूत्र 3 सांकेतिक शब्दों में बदलना गुम्मट PCRTag प्राइमरों के साथ प्रवर्धन उपज, जंगली प्रकार गुणसूत्र 3 सांकेतिक शब्दों में बदलना। प्राइमर उनके बाएँ-से-दाएँ गुणसूत्र स्थिति के अनुसार arrayed और तुलना के लिए चार quadrants में हूबहू स्थान दिया जाता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: प्लेट गर्मीएक qPCRTag प्रयोग के लिए पार बिंदु (सीपी) मूल्य प्रदर्शित करने के मानचित्र। यह आंकड़ा 2 के रूप में एक ही डाटासेट है और थाली लेआउट इसलिए समान है। एन / ए 'नहीं प्रवर्धन' को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह काफी उच्च throughput के लिए सक्षम बनाता है के रूप में PCRTag जीनोटाइपिंग परख में वास्तविक समय पीसीआर का पता लगाने के निगमन Sc2.0 परियोजना के लिए एक महत्वपूर्ण विकास है। पिछले कार्यप्रवाह 384 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट, 1.5 घंटा थर्मल साइकिल चलाते समय, agarose जेल वैद्युतकणसंचलन, और जेल के मार्गदर्शन एनोटेशन में 2.5 μl प्रतिक्रियाओं निर्दिष्ट।

qPCRTag विश्लेषण कहा जाता है यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रवाह, कई प्रमुख बाधाओं पर काबू। सबसे पहले, एक qPCRTag चलाने के बारे में एक घंटे में खत्म (प्लेट की स्थापना के साथ साथ समय चलाने के लिए) के लिए शुरू, कार्रवाई की जा सकती है कि एक ही प्रयोग में 4 एक्स 384 अच्छी तरह प्लेटें संघनित। यह qPCRTag विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से प्रति अभिकर्मक लागत कम throughput agarose जेल आधारित दृष्टिकोण के साथ बराबर है कि नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, जेल वैद्युतकणसंचलन और मैनुअल एनोटेशन circumventing द्वारा, qPCRTag कार्यप्रवाह प्रमुख लाभ कर रहे हैं, जो समय और श्रम में काफी बचत, परमिट। महत्वपूर्ण बात qPCRTag कार्यप्रवाह एन हैस्वचालन के साथ tirely संगत।

PCRTag परख के उत्पादन के रूप में वास्तविक समय का पता लगाने के उपयोग के साथ एक प्रमुख चिंता का विषय झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी की दर है। PCRTag प्राइमरों मूल रूप से वास्तविक समय पीसीआर में उपयोग के लिए तैयार नहीं थे के बाद से, यह नहीं है कि सभी प्राइमर जोड़े इस निर्गम के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त हो जाएगा कि उम्मीद है। यह अंत करने के लिए यह सामने तक वास्तविक समय आधारित परख में काम नहीं करते कि सबसेट बाहर करने के लिए सभी PCRTag प्राइमर जोड़े के समारोह और विशिष्टता को मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, गुणसूत्र 3 PCRTag झूठी सकारात्मक और नकारात्मक हैं दर-और-बड़े पीसीआर डेटा (आंकड़े 2 और 3) वास्तविक समय में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और इन आगे के विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है। इसके अलावा, विफल करने के लिए जाना जाता है प्राइमर जोड़े (जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा मूल्यांकन और आंकड़े S6 और एट अल। 1 Annaluru की S7 में दिखाया गया है) भी बाहर रखा जा सकता है। यह आसानी से exclu बस पूरा किया हैडिंग ध्वनिक ट्रांसफर प्रोटोकॉल दोषपूर्ण प्राइमर जोड़े को स्थापित करते समय।

सबसे उच्च throughput assays के तरह, हम आगे बहाव के सत्यापन मिलने चाहिए transformants की पहचान करने के लिए एक प्राथमिक स्क्रीन के रूप में वास्तविक समय PCRTag पता लगाने का उपयोग करना चाहते हैं। बाद में, माध्यमिक स्क्रीनिंग के लिए स्वर्ण मानक readout के रूप में जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ PCRTag विश्लेषण रहेगा। उच्च throughput वास्तविक समय पीसीआर तकनीक के साथ राज्य के-कला के nanoscale तरल प्रणाली से निपटने के संयोजन Sc2.0 के लिए PCRTag विश्लेषण के आवेदन, परे तेजी से और स्वचालित विश्लेषण में सक्षम बनाता है और कई क्षेत्रों को प्रभावित करने की क्षमता है। उदाहरण के लिए, इस कार्यप्रवाह उच्च throughput पुस्तकालय स्क्रीनिंग, संक्रामक रोग निदान, microbiome विश्लेषण, और अत्याधुनिक जीनोम संपादन करने के लिए लागू किया जा सकता है एक साथ कई स्थलों को संशोधित करने के लिए प्रयास दृष्टिकोण।

Disclosures

लैम, झपकी, जाम और JDB खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है। आर सी और अल, रॉश लाइफ साइंस द्वारा अमेरिका कार्यरत हैं और सिद्धांत प्रयोग का एक सबूत के रूप में भाग लैम के साथ आवेदन को विकसित करने पर काम कर रहे हैं।

Acknowledgments

इस काम के द्वारा समर्थित किया गया था राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान एमसीबी-0718846 और (JDB तक) रक्षा एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी के अनुबंध N66001-12-सी-4020। लैम प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल से एक postdoctoral फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया। इस लेख के प्रकाशन रॉश द्वारा प्रायोजित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast gDNA prep
yeast gDNA custom custom template for real time PCR
Acid-washed glass beads (0.5 mm) Sigma G8772 yeast cell lysis
Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Invitrogen 15593-031 yeast cell lysis
5432 Mixer Eppendorf 5432 yeast cell lysis
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807 yeast cell lysis
Qubit 3.0 Fluorometer Life Technologies Q33216 gDNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit Life Technologies Q32850 gDNA quantification
Labcyte 384PP plate Labcyte P-05525 gDNA source plate
DNA Green Mastermix prep and dispensing
LightCycler 1536 DNA Green Roche 5573092001 real time PCR mastermix
1.5 ml Microfuge Tube Holder ARI EST BD060314-1 microfuge tube holder for deck of Cobra
LightCycler 1536 Multiwell Plate Roche 5358639001
Cobra liquid handling system Art Robbins Instruments 630-1000-10 dispense qPCR master mix into 1536 plate
PCR Plate Spinner VWR 89184-608 cenrifugation of 1536 plate
Template and primer dispensing
PCRTag primers IDT custom premixed forward and reverse, 50 μM each
TempPlate pierceable sealing foil, sterile USA Scientific 2923-0110 temporary seal for PCRTag primer plates
Labcyte LDV 384 well plate Labcyte LP-0200 pre-mixed primer source plate
Echo 550 Liquid Handler Labcyte transfer 2.5 nl drops of primer and template DNA into 1536 plate
Plateloc Thermal Microplate Sealer Agilent G5402-90001 heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run
Clear Permanent Seal Agilent 24212-001 optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage Agilent G5402-20008 can substitute ~2 mm thick washers
Sorvall Legend XTR Thermo Scientfic 75-004-521 centrifuge heat sealed 1536 plate
Industrial Air Compressor Jun Air 1795011 to run the Echo and Heat Sealer
Real Time PCR
LightCycler 1536 Roche requires 220 V outlet

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References

  1. Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344, (6179), 55-58 (2014).
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qPCRTag विश्लेषण - एक उच्च Throughput, Sc2.0 जीनोटाइपिंग के लिए वास्तविक समय पीसीआर परख
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Mitchell, L. A., Phillips, N. A., Lafont, A., Martin, J. A., Cutting, R., Boeke, J. D. qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping. J. Vis. Exp. (99), e52941, doi:10.3791/52941 (2015).More

Mitchell, L. A., Phillips, N. A., Lafont, A., Martin, J. A., Cutting, R., Boeke, J. D. qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping. J. Vis. Exp. (99), e52941, doi:10.3791/52941 (2015).

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