Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

qPCRTag Analys - En hög genomströmning, Realtid PCR-analys för Sc2.0 Genotypning

doi: 10.3791/52941 Published: May 25, 2015

Abstract

Den Syntetisk Jäst Genome Project (Sc2.0) syftar till att bygga 16 designade jästkromosomer och kombinera dem till en enda jästcell. Hittills en syntetisk kromosom, synIII 1, och en syntetisk kromosom arm, synIXR 2, har byggts och deras in vivo-funktionen valideras i frånvaro av motsvarande vildtyp kromosomer. En viktig utformning inslag i Sc2.0 kromosomer är införandet av PCRTags, som är korta, återkodade sekvenser inom öppna läsramar (ORF) som möjliggör differentiering av syntetiska kromosomer från deras vildtyp motsvarigheter. PCRTag primers glödgning selektivt till antingen syntetiska eller vildtyp kromosomer och närvaro / frånvaro av varje typ av DNA kan testas med hjälp av en enkel PCR-analys. Standarden avläsning av PCRTag analysen är att bedöma närvaro / frånvaro av amplikoner med agarosgelelektrofores. Emellertid, med en genomsnittlig PCRTag amplikon täthet av en per 1,5 kb och agenome storlek ~ 12 Mb, kommer den färdiga Sc2.0 genomet kodar cirka 8.000 PCRTags. För att förbättra genomströmningen, har vi utvecklat en realtids-PCR-analys för PCRTag genotypning som vi kallar qPCRTag analys detektion. Arbetsflödet anger 500 nl reaktioner i en 1.536 flerkällsplatta, vilket tillåter oss att testa upp till 768 PCRTags med både syntetiska och vilda typ primerpar i ett enda experiment.

Introduction

Sc2.0, eller syntetisk Jäst Genome Project ( www.syntheticyeast.org ), har satt som mål att designa och bygga en helt syntetisk eukaryot genomet. Använda mycket curerad genomsekvensen av Saccharomyces cerevisiae 3 som utgångspunkt, var och en av de sexton linjära kromosomer har fått en ny utformning för att möta en uppsättning designprinciper som anger att upprätthålla cell fitness, förbättra genomet stabilitet och ökad genetisk flexibilitet. Exempelvis är destabiliserande element såsom upprepningar raderas från Sc2.0 kromosomer. Alla förekomster av TAG stoppkodon återkodade för att TAA att "frigöra" en kodon i den slutliga stammen för införandet av en icke-genetiskt kodad aminosyra. Dessutom ett inducerbart evolution system Scramble, vilket möjliggörs genom Cre-lox systemet tillåter oöverträffad förmåga att generera derivat genomen med nya strukturer 4.

(Figur 1A). PCRTag konstruktion utförs med användning av "mest olika" algoritm i GeneDesign 5,6, vilket gav omkodas syntetiska sekvenser som normalt ~ 60% annorlunda än de nativa sekvenserna (minst 33%) med smälttemperaturer mellan 58 ° C och 60 ° C och amplikon längder mellan 200-500 baspar 2. Omkodning är inte tillåtet inom de första 100 bp av varje ORF, eftersom dessa regioner är kända förhar speciella önskemål när det gäller kodonanvändning 7. Tillsammans utgör dessa konstruktionsregler gynnar höga prestanda nästan alla PCRTags under en enda uppsättning PCR-betingelser, varvid syntetiska och vilda typ PCRTag primerpar enbart binder och förstärker syntetiska och nativa DNA, respektive (Figur 1B).

Figur 1
Figur 1:. PCRTag schema (A) PCRTags återkodade sekvenser inom öppna läsramar (ORF) av gener på Sc2.0 kromosomer. (B) Syntetisk (SYN) och vildtyp (WT) PCRTag primers enbart binder och förstärker syntetiska och vildtyp genomisk DNA (gDNA), respektive. Visat här är en analys av en ~ 30 kb segment av den vänstra armen av kromosom sex, provning tretton PCRTag primerpar med användning av antingen WT eller halv synVIL2 gDNA som mall. I många fall en enda ORF kodar mer än en PCRTag. Närvaro / frånvaro av PCRTag amplikoner bedöms genom agarosgelelektrofores. PCRTag amplicons varierar i storlek från 200 bp till 500 bp. Ju snabbare migrerande arter i botten av panelerna är primerdimerer.

PCRTag analys har visat sig vara ett viktigt verktyg i monteringen av Sc2.0 kromosomer. I ett typiskt experiment 30-50 kb av syntetisk DNA, som kodar för 20-30 PCRTags, transformeras in i jästceller för att ersätta den motsvarande vildtyp DNA-1,2,8. PCRTag analys används sedan för att identifiera transformanter som kodar syntetiska men inte vildtyp PCRTags spänner detta segment av DNA, eller så kallade "vinnare". Det är vanligtvis nödvändigt att testa flera transformanter att identifiera "vinnare", så genomströmning och kostnaden för PCRTag analys är viktiga faktorer. För närvarande två Sc2.0 kromosomer har avslutats (synIII 1 och synIXR 2), vilket motsvarar mindre än 10% av Sc2.0 genomet, altHough mer än hälften av de återstående kromosomerna genomgår för närvarande syntes och montering. Omfattningen av PCRTag analys som krävs för detta projekt snabbt snabbare än förmågan att köra geler och manuellt poäng närvaron av syntetiska DNA och frånvaro av vildtyp-DNA.

För att förbättra genomströmningen i PCRTag analysen har vi utvecklat ett arbetsflöde genom att använda realtids-PCR för att kringgå användningen av agarosgelelektrofores. Arbetsflödet använder sig av en bulk vätskedoserare att distribuera qPCR mastermix i varje brunn i en 1.536 flerkällsplatta, en nanoskala akustisk vätska dispenser för att överföra mall-DNA och primers, och en 1.536 qPCR termocykler, vilket tillåter oss att miniatyrisera reaktioner till 500 nl och maximera genomströmningen. Vidare analys kan automatiseras. Denna typ av hög genomströmning genotypning protokoll bör vara generaliserbara till alla projekt som kräver analys av många kloner på flera ställen.

Protocol

1. Förbered jäst genomiskt DNA (gDNA)

  1. Förbered ett lager av jäst lyseringsbuffert 9 som innehåller 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 1% SDS (vikt / volym), 2% Triton X-100 (volym / volym), 1 mM EDTA, pH 8,0.
  2. Som utgångsmaterial använder ~ 2 x 10 6 celler, som normalt motsvarar ~ 100 | il mättad kultur för labb stammar av BY4741 10 bakgrunden. Odlade celler bör uppsamlas genom centrifugering vid 1000 x g under 3 minuter vid rumstemperatur i en 1,5 ml mikrofugrör. Aspirera supernatanten.
  3. Lägg 200 pl av Jäst Lysis Buffer och resuspendera cellpelleten genom pipettering.
  4. Lägg ~ 300 | il av syratvättade glaspärlor så att nivån av pärlor är omkring 1 mm under nivån för celluppslamningen.
  5. I ett dragskåp till 200 | il fenol / kloroform / isoamylalkohol (25: 24: 1). Förslut mikrofugrör och kontrollerar att inga pärlor har fastnat mellan locket och röret, eftersom detta kommer att resultera i läckage under skakning(Steg 1,6). Vänd 3 gånger för att blanda och kontrollera locket är förseglad.
  6. Skaka röret i 10 min vid rumstemperatur med användning av en bordsblandare såsom en Eppendorf 5432.
  7. Centrifugera vid 20.800 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
  8. Överföring 75 pl av den vattenhaltiga fasen till ett nytt mikrofugrör innehållande 1 ml 100% etanol. Vänd 10 gånger för att blanda.
  9. Pellets DNA genom centrifugering vid 20.800 xg under 20 minuter vid 4 ° C.
  10. Aspirera supernatanten utan att rubba DNA-pelleten. Tvätta pelleten med 500 | il av 70% etanol.
  11. Centrifugera vid 20.800 xg under 5 min vid 4 ° C.
  12. Aspirera supernatanten utan att rubba DNA-pelleten och lufttorka pelleten med mikrofugen locket öppet till överskott av etanol har avdunstat, som vanligtvis är cirka 10 minuter.
  13. Resuspendera DNA-pelleten i 75 | il 10 mM Tris, pH 7,4 och virvel för att blanda. Förvara provet vid -20 ° C på obestämd tid. Mät koncentrationen av DNA i provet med hjälp av enbänkskiva fluorimeter såsom kvantbiten, vilket skiljer DNA från RNA. Se till att den slutliga koncentrationen av gDNA är ~ 1-2 ng / l.
  14. Bered en 1:10 utspädning av genomiskt DNA med användning av vatten och virvel för att blanda.
  15. Alikvot 30 pl av utspätt gDNA till den lämpliga brunnen i en källplatta som är kompatibel med en nanoskala akustisk vätskedispenser (steg 3). Om du använder en Labcyte Echo 550, använder en 384 väl polypropylen platta (384PP platta).
    OBS: När förseglas på lämpligt sätt denna platta kan lagras i minst en månad vid -20 ° C.

2. Förbered och fördela qPCR Master Mix till en 1.536 flerkällsplatta

  1. Bered 850 pl qPCR Master Mix, såsom LightCycler 1536 DNA Grön Mästare, i en 1,5 ml mikrofugrör och skaka för att blanda. Centrifugera qPCR Master Mix för 2 min vid 20.800 xg vid rumstemperatur för att avlägsna eventuella bubblor. Komponenterna i qPCR huvudblandning som erfordras för en enda 1536 flerkällsplatta är följandes:
    1. Kombinera 170 il enzym Master Mix (Grön Mästare Tube 1, 5x koncentrerad), 42.5 il SYBR (grön Mästare Tube 4, 20x koncentrerad) och 637,5 il vatten.
  2. Fördela 500 nl / brunn i en 1.536 flerkällsplatta med hjälp av en bulk vätskedoserare såsom Art Robbins Cobra. (Notera att steg 2.2.1-2.2.4 hänvisar specifikt till Cobra.)
    1. Skapa en dispenseringsprogram med följande inställningar: flytande klass, vatten; aspirera volym, 800 pl; avstå volym, 500 nl; tvätta tid, 20 sek. I doseringsinställningar, kontrollera dispenseringshastigheten är inställd på 49,6 mm / sekund, är dispenserings offset 0,25 mm, och överskott aspirerade vätskan dispenseras tillbaka till källan väl.
    2. Placera mikrofugrör innehållande qPCR Master Mix väl A1 i mikrofugrör hållaren, som ligger i däck läge 1. Skär bort locket på mikrofugrör eller helt enkelt lämna det öppet. Ställ in "Sug väl" A1 genom att redigera Aspirate inställningar.
    3. Utför ett tvättsteg före dispensering qPCR Master Mix genom att först avmarkera aspirations och fördela steg i programmet inrättades i steg 2.2.2 och sedan slå "kör". När du är klar, åter välj aspirera och befria åtgärder innan du kör hela programmet att fördela qPCR Master Mix. Om Cobra har suttit inaktiv under mindre än 10 minuter den initiala tvättsteget, som tjänar till att fylla systemet, är onödigt.
    4. Hit "kör" att fördela qPCR Master Mix till varje brunn.
  3. Samla qPCR Master Mix i botten av varje brunn med kort centrifugering av 1536 flerkällsplatta (30 sek med hjälp av en låg hastighet PCR-plattan spinner).

3. Fördela mall DNA och Primers in i 1.536 flerkällsplatta

  1. Fördela 5 nl utspädd gDNA (steg 1,3) till de önskade brunnarna i 1536 flerkällsplatta med hjälp av ett akustiskt system vätskeöverföring, såsom Echo 550.
    1. För Echo 550 använder Plate Formatera programvara eller alternativt ge en anpassad Excel-ark för att programmera överföringen. Se den valda källan bra för gDNA i programmet matchar källan långt in som du har fysiskt dispens den gDNA (steg 1,3). Välj käll plattyp '384PP_AQ_BP2 ", vilket indikerar att vätskan i 384PP plattan är en buffert utan ytaktiva medel.
  2. Fördela 10 nl av primers, färdigblandade framåt och bakåt till en slutlig koncentration av 50 ^ M vardera, till de önskade brunnarna i 1536 flerkällsplatta med hjälp av ett akustiskt system vätskeöverföring, såsom Echo 550.
    1. För att systemet vätskeöverförings använder Plate Formatera programvara eller alternativt ge en anpassad Excel-ark för att programmera överföringen.
      OBS: Här är det möjligt att avstå primers så att layouten på 1.536 flerkällsplatta matchar kromosomala ordning primers så det är lätt att visuellt inspektera realtid PCR-resultatsenare (steg 6).
    2. Premix primrarna i en platta som är kompatibel med den akustiska vätskeframmatare. För Echo 550, använda en Labcyte 384LDV (låg dödvolym) platta och välja källa plattyp '384LDV_AQ_B' vid programmering Echo att indikera vätskan är en enkel buffert utan proteiner.

4. Seal och centrifugera 1536 flerkällsplatta

  1. Med användning av en mikroplatta sealer system, såsom Plateloc Termisk Microplate Sealer, omedelbart försegla 1536 flerkällsplatta med användning av optiskt klar tätning som är kompatibel med värmeförseglaren instrumentet. Rör inte ytan på tätningen för att undvika Smeta ut märken.
    1. Om du använder Plateloc Thermal Micro Sealer, använd följande inställningar: försegla tid 2,0 sek, förseglingstemperatur 162 ° C, lufttryck 82 psi. Detta instrument tar ~ 5 minuter för att värma upp och så bör vara påslagen i förväg.
    2. Om du använder Plateloc Thermal Mikro Sealer, en ADAPTEr måste användas för att öka höjden på 1536 flerkällsplatta på scenen av instrumentet för att säkerställa god tätning.
      OBS: Även om det är att föredra att köpa en Stage tavla för Plateloc Thermal Mikro Sealer, är en alternativ lösning för att infoga fyra ~ 2 mm tjocka standardbrickor till någon järnaffär i hörnen för att höja höjden på 1.536 flerkällsplatta.
  2. Centrifugera omedelbart den förseglade 1536 flerkällsplatta vid 2000 xg under 3 min vid rumstemperatur för att samla alla reagens vid botten av varje brunn.

5. Real Time PCR

  1. Programmera en 1.536 qPCR instrument, såsom LightCycler 1536, med en två-steg förstärkning protokollet följt av en smältkurva analys. Använda LightCycler 1,536 programvara inrätta ett program på följande sätt:
    1. Förinkubation: 95 ° C, 1 minut håll, ramphastighet 4,8 ° C / sekund, ingen förvärv.
    2. Två Steg Förstärkning: 30 cykler av [95 ° C, ingen hold,ramp hastighet 4,8 ° C / sekund, ingen förvärv; 64 ° C, 30 sek håll, ramphastighet 2,5 ° C / sek, enskilda förvärvet].
    3. Smält kurva: 95 ° C, 10 sek, ramphastighet 4,8 ° C / sek, något förvärv; 60 ° C, 1 min, ramphastighet 2,5 ° C / sek, något förvärv; 97 ° C, ramphastighet 0,1 ° C / sek, 5 förvärv / ° C (kontinuerlig).
    4. Kall: 40 ° C, 30 sek, ramphastighet 2,5 ° C / sek, något förvärv.
  2. Ställ Detection Format till "gröna interkalerande färg" på fliken Kör Definition.
  3. Ställ pipettering kontrollen till "Master Control" på fliken Kör Definition. Den här funktionen fungerar som en intern kontroll och detekterar närvaron av qPCR Master Mix i varje brunn i 1.536 flerkällsplatta, som är användbara för att identifiera förmodade falskt negativa resultat.
  4. Sätt 1536 flerkällsplatta framställd i steg 2-4 till 1.536 qPCR instrumentet och kör programmet.

6. Dataanalys

  1. PerfOrm visuell inspektion av data inom qPCR programvaran.
    OBS: 1.536 programvara gör det möjligt visualisering av både förstärkning och smältkurvor, samt en värmekarta som visar samtalet (positiv, negativ, ogiltiga, N / A, Figur 2), korsningspunkten värdet (glidande färgskala för positiv eller grå för negativ, Figur 3), eller en slutpunkt fluorescens (EPF) värde (glidande färgskala).
  2. Exportera data från 1536 Software i form av en .txt-fil (resultattabell) eller XML-fil med antingen rådata eller beräknade data för behandling offline från instrumentet.
    OBS: Den egen automatiserade övergången (Cp) som ringer algoritm inbyggd i 1536 mjukvaran tar hänsyn till formen och lutningen hos förstärkningskurvan vid fastställande positiva / negativa och Cp samtal värde med hög tillförlitlighet, vid låg sub mikroliter reaktionsvolymer med förhållandevis låg fluorescensvärdena.
  3. Om LightCycler DNA gröna Mästaren var användningend för qPCR, kontrollera att alla brunnar passerade "master control". En underkänd indikerar väl inte fick qPCR Master Mix och saknade datapunkt bör betraktas som en potentiell falskt negativt. Kontrollera att alla brunnar passerade "master control". En underkänd indikerar brunnen inte får DNA mastermix och överväga den saknade datapunkt en potentiell falskt negativt.

Representative Results

Vi testade syntetiska och vildtyp kromosom 3 PCRTag primerpar 1 med jäst genomiskt DNA (gDNA) utvinns ur fyra olika stammar. Kromosom 3 har 186 PCRTag primerpar som spänner över längden på kromosom (synIII är ~ 270 kb och vildtyp kromosom 3 är ~ 315 kb). För att testa var och en av de fyra stammarna med båda uppsättningarna av primersekvenser, vi delat flerkällsplatta in i fyra kvadranter, en för varje typ av gDNA, tilldela syntetiska PCRTag primrar till den övre halvan av varje kvadrant och vildtyp till den nedre halvan. Genomiskt DNA extraherades från jäststammarna, två av vilka kodar vildtyp kromosom 3 (vildtyp, synIXR 2), medan de återstående två koda syntetisk kromosom 3 (synIII 1, synIII synIXR). qPCR huvudblandning fördelades i varje brunn i en 1536 flerkällsplatta med användning av en bulkvätskedispenser, följt av gDNA och PCRTag primrar med användning av de Echo 550. Primrar klädd identiskt ivarje kvadrant av flerkällsplatta för enkel visuell jämförelse. Den flerkällsplatta därefter värmeförseglas med optiskt klar tätning och utsattes för realtids-PCR-analys.

I detta qPCRTag experiment observerade vi, för det mesta, förstärkning som förväntat, varvid syntetiska primers enbart förstärkt syntetiskt DNA och vice versa (figurerna 2 och 3). Men noterade vi också flera avvikelser från den förväntade mönstret, vilket tyder på falska negativa och falska positiva i datamängden. I detta experiment var den masterstyr detekteras i 100% av brunnarna, vilket indikerar bulk vätskeframmatare framgångsrikt dispense mastermix in i varje brunn på plattan (data ej visade). Detta utesluter en potentiell källa till falskt negativa resultat. Dessutom är vissa kromosom 3 PCRTags kända för att misslyckas (visas i figurerna S6 och S7 av Annaluru et al. 1), varav minst 2 SYN och 1 WTprimerpar; alltså dessa brunnar kan ignoreras i varje kvadrant. Sant falskt negativa kan uppstå brist på överföring av mall gDNA eller primers, men vår erfarenhet, med tanke på den korrekta kalibreringen av Echo 550 samt förbereda gDNA och primers som beskrivits, har det inte varit en stor felkälla. Totalt i detta experiment den falska negativa hastigheten var extremt låg för WT primers med WT mall (~ 2%) men något högre för SYN primers med SYN-DNA (~ 8%).

Falska positiva, detektering av signalen i brunnar där SYN primers blandas med WT gDNA (och vice versa), kan uppstå från kors förstärkning eller primerdimerer. Faktum primerdimerer är ofta synligt genom gelelektrofores (Figur 1B) och representerar en rimlig felkälla. Vid tillämpningen av qPCR kan granskningen av smältkurvor vara användbart för att avgöra om olika arter, såsom primerdimerer, kan bidra till en signal. Vidare, performing ett kontrollexperiment varvid primrar dispenseras i frånvaro av mall-DNA kan bidra till att identifiera primrar med en benägenhet att dimerisera. Cross förstärkning kan observeras med gelelektrofores, i synnerhet om alltför många PCR-cykler utförs eller om härdningstemperaturen är för låg. Vi har försökt att minimera antalet falska positiva på grund av kors amplifiering genom att optimera båda dessa parametrar för qPCRTag protokollet. Slutligen undersöker övergången (Cp) värden för varje brunn kan hjälpa till att identifiera primers som inte är anpassade till realtid baserad detektering (Figur 3, till exempel, BB22, Fb22, Bb46, Fb46). Totalt i detta experiment falska positiva hastigheten var låg för SYN primers med WT mall (~ 5%) och högre för WT primers med SYN mall (~ 10%).

Figur 2
Figur 2: Plate värmekartan visar närvaro / absinne kräver en qPCRTag experiment. Fyra olika typer av genomiskt DNA (kvadranter separeras av fasta, vita linjer) underkastades PCRTag analys med användning av syntetisk (SYN) och vildtyp (WT) kromosom 3 PCRTag primers (streckade vita linjer för att separera SYN (överst ) och WT (botten) i varje kvadrant). WT och synIXR gDNA kodar vildtyp kromosom 3, vilket gav amplifiering med WT PCRTag primrar. SynIII och synIII synIXR gDNA kodar syntetiska kromosom 3, vilket gav amplifiering med SYN PCRTag primrar. Primers är klädd enligt deras vänster till höger kromosom positionering och placeras på samma sätt i de fyra kvadranter för jämförelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Plattvärmeväxlarekarta visar korsningspunkt (Cp) värde för en qPCRTag experiment. Detta är samma dataset som i figur 2 och plattan layouten är därför identiska. N / A hänvisar till "ingen förstärkning". Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Införlivandet av realtids-PCR detektion i PCRTag genotypning analysen är en viktig utveckling för Sc2.0 projektet eftersom det gör betydligt högre genomströmning. Den tidigare arbetsflöde angivna 2,5 pl reaktioner i 384 väl PCR-plattor, 1,5 h termisk cykling körtid, agarosgelelektrofores, och manuell anteckning av gelén.

Arbetsflödet presenteras här, som kallas qPCRTag analys, övervinner flera stora flaskhalsar. Först kondenserar en qPCRTag köra 4 x 384 brunnsplattor till ett enda experiment som kan bearbetas, början till slut (platta inrätta plus kör tid), i ungefär en timme. Det är viktigt att notera att reagenskostnaden per brunn för qPCRTag analys är i nivå med den nedre genomströmning agarosgel baserat tillvägagångssätt. Men genom att kringgå gelelektrofores och manuell anteckning, ger qPCRTag arbetsflöde stora besparingar i tid och arbete, som är de stora fördelarna. Viktigt den qPCRTag arbetsflöde är enhade fullt kompatibla med automatisering.

Ett stort problem med användningen av realtidsdetektering som utsignalen från PCRTag analysen är graden av falska positiva och falska negativa. Eftersom PCRTag primers inte var ursprungligen avsedd för användning i realtid PCR, förväntas det att inte alla primerpar kommer att vara lämpliga för användning med denna utgång. För detta ändamål är det viktigt att validera funktionen och specificiteten hos alla PCRTag primerpar att utesluta delmängd som inte fungerar i den verkliga tidsbaserad analys på framsidan. Exempelvis kromosom 3 PCRTag falska positiva och negativ är för-och-stor reproducerbar i realtid PCR data (fig 2 och 3) och dessa kan uteslutas från vidare analyser. Vidare primerpar är kända för att misslyckas (bedömas genom gelelektrofores och visas i figurerna S6 och S7 av Annaluru et al. 1) kan också uteslutas. Detta kan lätt åstadkommas helt enkelt excluding de felaktiga primerparen när du ställer in den akustiska överföringsprotokollet.

Liksom de flesta high throughput analyser har vi för avsikt att använda i realtid PCRTag upptäckt som en primär screening för att identifiera transformanter som förtjänar längre nedströms validering. Därefter kommer den gyllene standarden för sekundär screening förbli PCRTag analys med gelelektrofores som avläsning. Utöver tillämpningen av PCRTag analys för Sc2.0 kombinerar state-of-the-art nanovätska hanteringssystem med hög genomströmning realtids-PCR-teknik möjliggör snabb och automatiserad analys och har potential att påverka många områden. Till exempel kan detta arbetsflöde tillämpas på hög genomströmning biblioteksscreening, infektionssjukdomar diagnos, microbiome analys och banbrytande genomet redigering strategier försöker ändra flera ställen samtidigt.

Disclosures

LAM, NAP, JAM och JDB har inget att lämna ut. RC och AL är anställda av Roche Life Science, USA och arbetat med att utveckla programmet med LAM som en del av en proof of principle experiment.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes delvis av National Science Foundation Grant MCB-0718846 och Defense Advanced Research Projects Agency kontrakt N66001-12-C-4020 (till JDB). LAM har finansierats av ett postdoktorsstipendium från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada. Publicering av denna artikel är sponsrad av Roche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast gDNA prep
yeast gDNA custom custom template for real time PCR
Acid-washed glass beads (0.5 mm) Sigma G8772 yeast cell lysis
Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Invitrogen 15593-031 yeast cell lysis
5432 Mixer Eppendorf 5432 yeast cell lysis
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807 yeast cell lysis
Qubit 3.0 Fluorometer Life Technologies Q33216 gDNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit Life Technologies Q32850 gDNA quantification
Labcyte 384PP plate Labcyte P-05525 gDNA source plate
DNA Green Mastermix prep and dispensing
LightCycler 1536 DNA Green Roche 5573092001 real time PCR mastermix
1.5 ml Microfuge Tube Holder ARI EST BD060314-1 microfuge tube holder for deck of Cobra
LightCycler 1536 Multiwell Plate Roche 5358639001
Cobra liquid handling system Art Robbins Instruments 630-1000-10 dispense qPCR master mix into 1536 plate
PCR Plate Spinner VWR 89184-608 cenrifugation of 1536 plate
Template and primer dispensing
PCRTag primers IDT custom premixed forward and reverse, 50 μM each
TempPlate pierceable sealing foil, sterile USA Scientific 2923-0110 temporary seal for PCRTag primer plates
Labcyte LDV 384 well plate Labcyte LP-0200 pre-mixed primer source plate
Echo 550 Liquid Handler Labcyte transfer 2.5 nl drops of primer and template DNA into 1536 plate
Plateloc Thermal Microplate Sealer Agilent G5402-90001 heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run
Clear Permanent Seal Agilent 24212-001 optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage Agilent G5402-20008 can substitute ~2 mm thick washers
Sorvall Legend XTR Thermo Scientfic 75-004-521 centrifuge heat sealed 1536 plate
Industrial Air Compressor Jun Air 1795011 to run the Echo and Heat Sealer
Real Time PCR
LightCycler 1536 Roche requires 220 V outlet

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344, (6179), 55-58 (2014).
  2. Dymond, J. S., et al. Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design. Nature. 477, (7365), 471-476 (2011).
  3. Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274, (5287), 546-547 (1996).
  4. Dymond, J., Boeke, J. The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization. Bioeng Bugs. 3, (3), 168-171 (2012).
  5. Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit. Nucleic Acids Res. 38, (8), 2603-2606 (2010).
  6. Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. Design-A-Gene with GeneDesign. Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).
  7. Lajoie, M. J., et al. Probing the limits of genetic recoding in essential genes. Science. 342, (6156), 361-363 (2013).
  8. Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast. Bioessays. 36, (9), 855-860 (2014).
  9. Dymond, J. S. Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).
  10. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, (2), 115-132 (1998).
qPCRTag Analys - En hög genomströmning, Realtid PCR-analys för Sc2.0 Genotypning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mitchell, L. A., Phillips, N. A., Lafont, A., Martin, J. A., Cutting, R., Boeke, J. D. qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping. J. Vis. Exp. (99), e52941, doi:10.3791/52941 (2015).More

Mitchell, L. A., Phillips, N. A., Lafont, A., Martin, J. A., Cutting, R., Boeke, J. D. qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping. J. Vis. Exp. (99), e52941, doi:10.3791/52941 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter