Abstract
嗅觉是高度保守性和所需的繁殖和生存。
在人类中，嗅觉也是受到影响与老化的感官之一，是神经退行性疾病的一个强有力的预测。因此，嗅觉测试是用来作为一种非创伤性诊断方法用于检测早期神经功能障碍。为了了解底层网络的嗅觉敏感性的机制，嗅觉研究啮齿动物已经获得的势头在过去的十年。
在这里，我们提出了一个非常简单的，时间效率和可重复的测试嗅觉与生俱来的感知气味的敏感性和小鼠的方法没有任何事先的食物或水限制的需要。所述测试是在一熟悉的环境中进行的小鼠，仅需要的气味和臭气物质的暴露2分钟会话。进行分析， 事后 ，使用上的ImageJ计算机辅助命令并且可以是，因此，开展从头至尾由一研究员结束。
该协议不需要任何特殊的硬件或设置并标明为有兴趣测试嗅觉的感知和灵敏度任何实验室。
Introduction
嗅觉是在哺乳动物中最不发达国家和重要的感觉功能之一。在嗅觉活性的任何损害可能影响食物摄取，社会行为和，在最坏的情况下，甚至存活。在人类中，嗅觉恶化是年龄依赖性1，被认为是神经系统疾病2的强预测- 6。由宾夕法尼亚大学开发的嗅觉鉴定试验目前代表了最常用的，非侵入性，可量化，诊断测试，可以评估早期神经功能缺损7和高概率预测老年痴呆症8,9的进展之一。
嗅觉系统和嗅觉的啮齿动物中突出的可访问性，引发了人们研究的一个强烈的线条解决机制基础嗅觉功能10。我们以前曾表明的信令RECEPT的功能丧失或Notch1的影响嗅觉回避11。在这个协议中，我们使用缺乏信号配体，小鼠Jagged1的，在神经元或神经胶质细胞来研究嗅觉的性能。
先天嗅觉是由三个参数作为感知，气味和嗅觉灵敏度4区分限定。嗅觉测试在啮齿类动物可以以多种方式来完成，一些行为研究利用olfactometers，它提供气味给动物在特定的蒸气浓度和在一精确的时间框架12 - 14。尽管如此，这种仪器是昂贵的，可能只在专门的设施是可用的。在我们的工作中，我们提供了一个简单，快速，可重复的测试嗅觉的协议，这是使用挥发性气味。测试说明措施的看法，以引诱或驱蚊气味和评估的气味和水11,15,16之间的歧视。使用相同的设置，瓦特E也可以测量不同浓度16,17的灵敏度的气味。在事后计算机辅助视频处理，灵感来自页和他的同事18的工作，提供公正的结果，而实验致盲，并允许单人进行整个实验的需要。
该协议的目的是为研究小鼠嗅觉行为提供一个起始点。
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Protocol
所有动物的程序是按照在用于科学目的的动物的保护与欧盟指令六十三分之二千○一十/欧盟和由当地动物保健委员会（广弗里堡，瑞士）的批准。
1.动物的制备
- 实验动物
- 执行对成年雄性野生型和3-5个月的婴儿转基因小鼠（C57BL / 6背景）的实验。三组小鼠的对应的野生型同窝对照组（A组，Jagged1处理FLOX / FLOX 19）和两个条件KO小鼠系（B组，Jagged1ncKO和C，Jagged1gcKO）。
- 家鼠标准实验室条件在通风的房间下，具有12小时控制黑暗/光照周期，并提供食物和水自由采食 。
2.实验装置
- 实验舞台
- 对于实验的舞台，用干净的消毒鼠笼（36厘米长×20.5厘米宽×13.5厘米高度）（ 图1A）。
- 将每个鼠标编号的笼子里新鲜的床上用品3厘米高。如果笼重用，如气味敏感试验，采取以下措施，以避免气味和老鼠之间的交叉污染。
- 马克在水一方。
- 清洁笼子的窄壁，用70％的乙醇，一为每侧的两个薄棉纸。
- 根据小鼠的基因型堆积笼和在层罩暂时储存。
- 相机
- 安装一个摄像头定制鼎在58厘米的笼（ 图1A）底部的目标。固定三脚架和笼子的位置，并用标记分隔，以便相机上笼的顶部居中。
- 记录视频在320像素×240像素，每秒15.08帧作为MOV文件。
- 气味
- 悬浮风光TS，时所指出的，在溶剂中，它们是可溶的。
- 对于偏好测试使用的花生酱。悬浮在花生油花生酱（10％重量/体积）。
- 为了避免测试使用纯2-甲基（2-MB）酸（98％）。
- 用于敏感性试验中，使用雌性尿液从同一小鼠菌落和背景（C57BL / 6）。
- 为了方便前1-2天收集尿液嗅觉测试。抑制并按住鼠标与它的肚子笼网格上方的引擎盖下。下的笼格放置一个塑料培养皿收集尿液的下降。
- 从在1.5ml管每个女性收集尿和混合所有尿样正常化动物间变异。储存在-20℃直到使用。
- 在实验的当天，解冻的尿，并执行4稀释在双蒸水以10:1的稀释因子（1:10，1：100; 1：1000 1：10,000）。
3.嗅觉测试
注：在这个协议中的气味已经有意选择这被认为是强有力的引诱（花生酱和女性尿液）或强驱蚊（2-MB酸）15。它之前进行的优先级和敏感性测试，以愉快的气味，以避免测试，以消除与嗅觉行为的任何干扰的可能性是非常重要的。然而，为简单起见，在本文中，偏好和回避试验将二者下的感知试验说明。每个行为会话开始于一个习惯阶段。
- 习惯相
- 将动物在清洁分配笼并让它探索5分钟（ 图1B）。由于实验笼子里的环境是熟悉的家笼，这么短的时间就足以允许习惯。
- 如果灵敏度测试在一天内完成，应用A之前执行习惯只有一次n中的最高稀释气味。如果灵敏度进行试验在不同的日子，在每一天，需要在一个新的干净笼子一个习惯相。
- 感知测试
- 习惯后，启动相机，并立即吸取60微升愉快的气味（花生酱）和60微升中性气味（自来水）的上保持器的相对壁以约10厘米的底部（ 图1C）。
- 让鼠标探索气味2分钟（ 图1D）。此后，关闭摄像头。
- 此时，继续进行从习惯相下一小鼠开始。通过施加60微升斥气味的（2 MB乙酸）和60微升水恰好执行回避试验中的方法相同。
- 药敏试验
- 评估雄性小鼠的吸引力阈增加以下顺序女性尿液浓度：1：10,000; 1：1000; 1：100; 1：10和纯尿。
- 习惯之后，暴露每只小鼠为先前在3.2.1描述的实验者吸管的最高稀释。
- 记录的尿与水的探索行为，在摄像机2分钟的时间范围内。之后所有小鼠队列被测试的最高稀释度（1：10,000），暴露于尿液浓度较高时，如上面所指出的。
4.事后的数据分析
注意：所述的所有行为试验在处理事后以下的数据分析的指令。
- 在ImageJ的打开MOV文件为Windows系统
- 使用自定义设置从http://www.apple.com/quicktime/download安装快速的时间为Java。
- 安装快速的时间插件从ImageJ的网站（http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html）。
- 进口QTJava.zip（C： Program Files文件 QuickTime的 QTSystem）到库EXTENSImageJ的离子（.ImageJ JRE lib目录分机）。
- 副本也将在QTJava.zip插件文件夹并将其重命名为QTJava.jar。
- 安装附加的宏文件夹中的六个脚本（ImageJ的插件宏）。
- 打开ImageJ的编译和运行快速时间插件，随后关闭ImageJ的。
- 重新打开ImageJ的使用文件>导入打开文件MOV>使用快速的时间。
- 视频调整
- 一旦视频文件中的ImageJ打开，以便获得恒定的2分钟的探索从时间实验者已经吸的气味物质入笼（T0）剪切视频。识别对应于T 0的帧，并删除利用增量为1（ImageJ的图片堆栈 ToolsSlice剂）的先前帧。使用相同的命令删除所有超过2分钟的探索帧。
- 确保笼中心并在必要时使用图像>变换>旋转命令对齐。
- 韦迪o处理
注：视频处理是完全计算机辅助并使用附带本文宏命令。- 为了在区域限制到一个127像素×218像素大小的笼子里运行插件>宏>运行命令第1步宏。移动固定矩形在笼（ 图2，步骤1）。
- 作物上的感兴趣区（ROI）的区域中的保持器的使用步骤2宏（ 图2，步骤2）的面积。
- 使用步骤3宏通过分配阈值信号，去除斑点和过滤该信号方差来提取从背景的小鼠图像。在Z轴情节的输出值表示的平均灰度值，对应于鼠标阴影的2分钟的探索过程中的“水室”的ROI中移动的强度。将结果复制到根据在一个电子表格文件在ROI（ 图2，步骤3）命名表。
- 使用第4步宏在ROI“气味室”提取鼠标的平均灰度值。将结果复制到根据在ROI中的相同的电子表格文件，如4.3.3（ 图2，步骤4）命名表。
- 为了进一步限制了投资回报率“水周”鼠标移动的分析，使用步骤5宏。结果复制到按投资回报率在同一个电子表格文件中4.3.3（ 图2，第5步）命名工作表。
- 要限制在投资回报率“气味外围”鼠标移动的分析使用步骤6宏。结果复制到根据ROI的电子表格文件，如4.3.3（ 图2，步骤6）命名的工作表。
- 过程中的所有视频和检查一致性每动物的帧数。这里，记录所有动物对于对应于一个2分钟的探索会话1,810帧。
- 对于每一个动物，并为每个投资回报率，平均灰色VA帧排序梅毒大于0除以相应帧由值的数量为1秒，将获得在每个ROI所经过的秒数。
5.统计分析
- 对于每个测试使用的http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/可用公式由巴特利特的试验验证组/基因型内方差齐性。
- 在吸引和回避试验，进行比较之间用水对气味的时间花费在一个组内使用一个非定向学生t检验，假设根据巴特利特的试验的结果相等或不等方差。比较用减去花费与水的基因型之间通过单向ANOVA和Bonferroni的事后检验时的气味所花费的时间。
- 在敏感性试验分析与来自时间中减去所述气味所花费的时间与水：花的比较在尿特定稀释液通过单向ANOVA和Bonferroni的事后测试组间河2路ANOVA和重复使用邦费罗尼的事后检验比较各组之间不断增长的气味浓度的敏感性。
- 基因型和治疗中的吸引和回避试验之间的相互作用是由双因子ANOVA调查和Bonferroni的事后检验。
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Representative Results
感知试验测量的吸引力的花生酱和回避到2 MB酸。三组小鼠进行试验，并作为与水相比，在“气味周长”所花费的时间被量化。在偏好的测试，相比于水（T 8 = 2.52，P <0.05）对照组显示显著偏好的气味。另一方面，B组不显示任何显著吸引力的花生酱和花费更多的时间以水（叔6 = 3.22，P <0.05）。因此，它的行为不同于对照组（F = 1,7 26.39，P <0.005）。此外，C组显示无歧视，花费大约在同一时间与水和花生酱（T 8 = 0.78，P = 0.45）。总体上，三组不同的表现（F = 2,9 19.83，P <0.005），有基因型与治疗（花生酱和水）之间的相互作用显著（F = 2,1 4.90，P <0.005） （ 响应于2 MB酸的对照组显示一个回避反应，结果花费更多的时间以水（叔8 = 2.67，P <0.05）。同样，B组显示了明显的回避反应到2 MB酸（T 6 = 3.71，P <0.01）。另一方面，C组没有两个气味区分并且花费可比的时间与2 MB乙酸和水（叔8 = 2.2，p值= 0.6）（ 图3B）。就整体而言，比较回避反应的三组不显示显著不同的行为（F 2,9 = 0.76，p值= 0.49），结果有治疗和基因型之间没有交互作用（F 1,2 = 0.52，对= 0.63）。 在嗅觉灵敏的测试尿液女性的曲线显示偏好尿在不同浓度的抗水（偏好指数=时间减去尿与水所花的时间花在）。在日是测试，我们观察到，对照组A以稀释1的吸引力门槛，尿常规：1000和显示增加吸引力尿浓度上升。 B和C组显示100倍更高的门槛，以吸引（1:10）相比，A组（F = 2,9 4.78，P <0.05）。 B组和C显示可比的灵敏度曲线（F 1,19 = 0.36，P = 0.55）。组间的灵敏度比较，似乎A组相比，B组和C（F 2,19 = 7.12，P <0.01）（ 图4）具有女性尿更高的灵敏度。 
图1：用于执行嗅觉测试设置的表示。 （ 一 ）相机笼上方。 （B）的小鼠被放置在一个笼子为5分钟。习惯期。 （ 三）ODO咆哮吸管上笼壁。 （D）一种增香剂与水的探究活动是在一个2分钟窗口测试。 
图2：使用宏命令在ImageJ的计算机辅助视频处理的工作流程的例子是指从A组小鼠暴露在尿1:10稀释请点击此处查看该图的放大版本。 
图3：嗅觉偏好和避免测试结果代表三组的小鼠（n = 5的A组，n = 4的B组和n = 5的C组）已暴露于（A），但花生之三和（B）2 MB酸为一个2分钟的探索会话。的总时间探索气味（黑色圆圈）与水（灰色圆）表示。组间嗅觉行为显著差异是由黑色横条和星号表示。在嗅探组内的气味和水之间时间差显著显示灰色横条和星号。 * P <0.05，** P <0.01，*** P <0.01（灰色横条，学生t检验;黑单杠，单因素方差分析）。错误酒吧的平均值（SEM）的标准误差。 
图4：敏感性试验，以增加女性尿液浓度代表性结果的优先指数曲线，由勘探时间与尿液在不同浓度中减去通过与水所花的时间给予，显示该组关于A（n = 5）具有尿最高灵敏度相比，乙组（n = 4）和C（n = 5）。 * P <0.05（黑色水平条，单向ANOVA）。误差棒是SEM。
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Discussion
在这个协议中提出的测试能够评估天生的嗅觉行为的小鼠不同方面：感知气味，气味与水和对气味敏感的歧视。这个协议可以根据先前显示15的偏爱和避免规模应用于任何气味。由于该协议是基于探索行动的小鼠不显示任何运动障碍或焦虑可能影响其运动并干扰嗅觉勘探是很重要的。所描述的试验是为了对成年雄性小鼠但是它们可以适于还调查嗅觉在成年女性或老年小鼠。
1）至少3天的间隔进行每个测试：在老鼠开始这样的研究调查嗅觉之前，要注意以下几个方面是很重要的。应避免被测试的最后，以尽量减少嗅觉记忆20干扰; 2）进行电子xperiments在一天的同一时间，最好是在下午晚些时候，当小鼠在它们的活性周期21和使用的光的减光源。此外，调度的嗅觉测试在定义的时间控制在嗅觉功能22可以昼夜变化; 3）开始回避测试，使用驱蚊气味物质，如酸之前，在实验套房带一个笼子里的时候，并保持在层流罩笼。这个步骤是重要的，以避免习惯的加臭剂，将获得在同一组的更均匀的响应; 4）暂时分离出已经过测试，直到同笼的所有小鼠暴露于加臭剂，以减少臭气物质污染的小鼠; 5）使用相同的菌株的动物中，由于不同的菌株可以表现在当暴露于臭剂23的非均相方式; 6）实验者应穿白大褂在任何时候，改变动物，防止气味混合的手套; 7）吹打后，经营者应当将慢慢远离笼子在1.3米的距离，以防止嗅觉的探索过程中的任何混淆刺激小鼠; 8）小鼠仅在一个腔室显示平均灰度值应该被排除在研究之外，因为老鼠预计探索两个腔程度不同。
所描述的方法有几个优点比其他协议：它是非常简单的设置，使用廉价的材料，它是快速完成，并采取了开源软件，如ImageJ的优势。另外，我们提供要安装的宏已经准备就绪，可定制的使用，并且适用于任何舞台和超过2气味周长。它必须指出，只有在所分配的气味周长所花的时间是嗅觉活性的量度。而每个腔室中花费的时间给出了鼠标的探究活动的读出，并且是嗅觉行为仅粗略估计。与其他方法，统计功效可通过增加每个组的动物数量来获得。
作为使用olfactometers，其可为蒸汽压力和交货时间12自动地控制相比嗅觉测试- 14，所提出的协议少控制。然而，所有的气味被施加等量，在限定的距离和对于相同的时间窗。因此，保持这些变量不变，在该测试的嗅觉不是必需的。还有另一种潜在限制该协议包括在获得帧的固定数所需的调整和每个视频的切削时间。然而，也可以使用上更复杂的设置，不同气味端口递送气味在特定时间相同计算机辅助分析。在这种情况下，视频切割可以自动设定。
相比于用化妆棉我其他协议mpregnated与气味测试的吸引力和回避，本协议提供有关在一个单独的实验性会议一个新的气味和中性的气味（水）15,16之间的嗅觉辨别的附加 信息。此外，该协议不需要实验致盲，并且可以通过使用无偏差计算机辅助分析单个实验者完全进行。
这些简单的测试可用于监测在阿尔茨海默氏症或帕金森氏病的小鼠模型的神经缺陷的进展，并调查嗅觉传输的机制。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse cage | Italplast (Italy) | 1144B | 36 cm length x 20.5 cm width x 13.5 cm height |
| Chipped wood bedding | Abedd (Austria) | LTE E-001 | 3 cm high |
| Peanut butter | Migros (Switzerland) | NA | 1:10 |
| 2-Methylbutyric | Sigma Aldrich (Switzerland) | W269514 | Pure |
| Female urine from fertile females of same mouse strain | NA | NA | Dilution series |
| Camera | Olympus (US) | Camedia C-8080 | MOV files |
| Quicktime for Java (Windows) | Apple (USA) | NA | video plugin for visualizing MOV files |
| ImageJ for Windows | NIH (USA) | NA | Video Processing/Analysis |
References
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