Abstract
Olfaction הוא שמור ביותר בין מינים, ודורש לרבייה והישרדות.
בבני אדם, לחוש ריח הוא גם אחד מהחושים שמושפעים עם הזדקנות והוא מנבא חזק של מחלות ניווניות. לפיכך, בדיקת חוש ריח משמשת כשיטת אבחון לא פולשני לאתר גירעונות נוירולוגיות בשלב מוקדם. כדי להבין את מנגנוני רגישות רשת חוש הריח, חוש הריח מחקר במכרסמים צבר תאוצה בעשור האחרון.
כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה מאוד, זמן יעילה ושחזור בדיקת חוש הריח של תפיסה מולדת ריח ורגישות בעכברים ללא הצורך של כל הגבלת מזון או מים לפני. הבדיקות מבוצעות בסביבה מוכרת לעכברים, דורש רק ריחות ומושב 2 דקות של חשיפת odorant. הניתוח מתבצע, פוסט הוק-, באמצעות פקודות בעזרת מחשב על ImageJ ויכול להיות, ולכן, ביצע מתחילתו ועד סופו על ידי חוקר אחד.
פרוטוקול זה אינו דורש כל חומרה או התקנה מיוחדת ומצוין לכל מעבדה מעוניינת בבדיקת תפיסה ורגישות חוש הריח.
Introduction
Olfaction הוא אחת מהפונקציות החושיות המפותחות והחשובות ביותר ביונקים. כל ירידת ערך בפעילות חוש הריח עלולה להשפיע על צריכת מזון, התנהגות חברתית ו, במקרה הגרוע ביותר, אפילו הישרדות. בבני אדם, הידרדרות חוש הריח הוא גיל תלוי 1 ונחשב למנבא חזק של הפרעות נוירולוגיות 2-6. מבחן זיהוי הריח שפותח על ידי אוניברסיטת פנסילבניה מייצג כיום אחד המבחנים הנפוצים ביותר, לא פולשנית וכימות, האבחון שיכול להעריך גירעונות נוירולוגיות מוקדם 7 ולחזות בהסתברות גבוהה את ההתקדמות של דימנציה 8,9.
הנגישות של מערכת חוש הריח וחוש ריח של הגדולה במכרסמים, עוררה שורה אינטנסיבית של מחקר העוסקת במנגנוני פונקציות חוש הריח בסיסי 10. הראינו הפסד של פונקציה של recept האיתות בעבראו Notch1 משפיע הימנעות חוש הריח 11. בפרוטוקול זה אנו משתמשים בעכברים חסרי יגנד האיתות, Jagged1, בנוירונים או גליה ללמוד ביצועי חוש הריח.
לחוש ריח מולדים מוגדר על ידי שלושה פרמטרים כתפיסה, אפליה בין ריחות ורגישות חוש הריח 4. בדיקת חוש הריח במכרסמים יכולה להיעשות במגוון דרכים וכמה מחקרים התנהגותיים לעשות שימוש olfactometers, המספק את הריח לבעלי החיים בריכוזי אדים ספציפיים ובמסגרת זמן מדויקת 12 - 14. עם זאת, מכשור זה הוא יקר ועשוי להיות זמין רק במתקנים מיוחדים. בעבודה שלנו, אנו מספקים פרוטוקול פשוט, מהיר ושחזור חוש הריח בדיקה, אשר מתבצע באמצעות ריחות נדיפים. הבדיקות מתוארות תפיסת אמצעי לattractant או ריח דוחה ולהעריך את האפליה בין הריח ו11,15,16 מים. שימוש באותה ההגדרה, wדואר גם יכול למדוד את הרגישות לריח בריכוזים שונים 16,17. פוסט-הוק העיבוד בעזרת מחשב הווידאו, בהשראת עבודתו של פייג 'ועמיתי 18, מספק תוצאות משוחדת ללא הצורך של מסנוור ניסיוני ומאפשר לאדם אחד לבצע את הניסוי כולו.
פרוטוקול זה נועד לספק נקודת התחלה ללימוד התנהגות חוש הריח בעכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכי בעלי החיים הנן בהתאם להנחיית האיחוד האירופי 2010/63 / האיחוד האירופי על ההגנה על בעלי החיים המשמשים למטרות מדעיות ואושרו על ידי הוועדה המקומית טיפול בבעלי חיים (קנטון פריבורג, שוויץ).
1. הכנת בעלי החיים
- חיות ניסוי
- לבצע ניסויים בסוג מבוגר זכר פראי ועכברים הטרנסגניים (C57BL / 6 רקע) של 3-5 חודשים של גיל. שלוש הקבוצות של עכברים מתאימות לבקרות littermate הסוג בר (קבוצה, Jagged1 flox / flox 19) ושני קווים מותנים KO עכבר (הקבוצה B, ו- C Jagged1ncKO, Jagged1gcKO).
- עכברי בית בתנאי מעבדה סטנדרטיים בחדר מאוורר, עם מחזור כהה / אור מבוקר 12 שעות ומספקים כרצונך מודעת מזון ומים.
2. הגדרת ניסוי
- זירת ניסוי
- לזירת הניסוי, להשתמש בעכבר בכלוב מעוקר נקי (אורך סנטימטר 36 x 2גובה 0.5 סנטימטרים רוחב X 13.5 סנטימטרים) (איור 1 א).
- הקצאה כל עכבר לכלוב ממוספר עם מצעים טריים, 3 סנטימטר. אם כלובי שימוש חוזרים, כמו במבחן רגישות הריח, לנקוט בצעדים הבאים כדי למנוע זיהום צולב בין ריחות ועכברים.
- סמן את צד המים.
- נקה את הקירות צרים של הכלובים עם שני מסמכי הרקמה ריססו עם 70% אתנול, אחד לכל צד.
- להיערם כלובים לפי גנוטיפ של העכברים ולאחסן באופן זמני מתחת למכסת מנוע למינרית.
- מצלמה
- הר מצלמה על חצובה מותאמת אישית במטרה על 58 סנטימטר מהחלק התחתון של הכלוב (איור 1 א). לתקן את המיקום של חצובה והכלוב ולתחום עם סימנים כדי לאפשר למצלמה כדי להיות מרוכזת בחלק העליון של הכלוב.
- קלטת קטעים וידאו ב 320 פיקסלים x 240 פיקסלים, 15.08 פריימים לשניה כקבצי MOV.
- ריחות
- Resuspend scenTS, כאשר הצביעו, בממס שבו הם מסיסים.
- לחמאת הבוטנים שימוש מבחן העדפה. Resuspend חמאת הבוטנים בשמן בוטנים (10% w / v).
- לשימוש במבחן הימנעות חומצת 2-Methylbutyric (2-MB) טהורה (98%).
- לבדיקת הרגישות, להשתמש בשתן נקבה מאותו המושבה העכבר והרקע (C57BL / 6).
- לנוחיות לאסוף את השתן 1-2 ימים לפני בדיקת חוש הריח. לרסן והחזק את העכבר מתחת למכסת המנוע עם הבטן שלה מעל לרשת הכלוב. תחת רשת כלוב מקום בצלחת פטרי פלסטיק כדי לאסוף את הטיפות של שתן.
- לאסוף את השתן מכל נשים בצינור 1.5 מ"ל ומערבבים את כל דגימות השתן לנרמל לשונות בין בעלי החיים. חנות ב -20 ° C עד שימוש.
- ביום של הניסוי, להפשיר את השתן ולבצע 4 דילולים במים מזוקקים פעמיים בגורם לדילול של 10 (01:10, 1: 100; 1: 1,000; 1: 10,000).
3. בדיקת חוש הריח
הערה: בריחות זה פרוטוקול שנבחרו במכוון שנתפסים כמשיכה חזקה (חמאת בוטנים ושתן נקבה) או דוחה חזק (חומצת 2-MB) 15. חשוב לבצע את ההעדפה ומבחני רגישות לריחות נעימים לפני בדיקת ההימנעות כדי לשלול את האפשרות של התערבות בהתנהגות חוש הריח. עם זאת, למען הפשטות, בנייר, מבחן העדפה והימנעות זו תהיה גם תאר במבחן את התפיסה. כל מפגש מתחיל בהתנהגות שלב התרגלות.
- שלב התרגלות
- מניחים את החיה בכלוב שהוקצה הנקי ולתת לו לחקור במשך 5 דקות (איור 1). כיוון שהסביבה של הכלוב הניסיוני מוכרת לכלוב בבית, זמן קצר זה מספיק כדי לאפשר להתרגלות.
- אם בדיקת הרגישות הושלמה ביום אחד, לבצע הרגלה רק פעם אחת לפני האפליקציותn של הריח המדולל הגבוה ביותר. אם בדיקת הרגישות מתבצעת בימים שונים, בכל יום יש צורך בשלב התרגלות על כלוב נקי חדש.
- מבחן תפיסה
- אחרי ההתרגלות, להפעיל את המצלמה ופיפטה מייד 60 μl של הריח נעים (חמאת בוטנים) ו -60 μl של ריח הניטרלי (מי ברז) על הקירות נגדיים של הכלוב בכ -10 סנטימטר מהחלק התחתון (איור 1 ג).
- בואו העכבר לחקור את הריחות למשך 2 דקות (1D איור). לאחר מכן, כבה את המצלמה.
- בשלב זה, להמשיך במתחיל את העכבר הבא מהשלב ההתרגלות. בצע את בדיקת ההימנעות בדיוק באותו אופן על ידי יישום 60 μl של הריח הדוחה (חומצת 2-MB) ו -60 μl של מים.
- מבחן רגישות
- להעריך את סף המשיכה של עכברי זכרים להגדלת ריכוזים של שתן נקבה לפי הסדר הבא: 1: 10,000; 1: 1,000; 1: 100; 1:10 ושתן טהור.
- אחרי ההתרגלות, לחשוף כל עכבר לדילול הגבוה ביותר pipetted על ידי הנסיין כפי שתואר לעיל ב3.2.1.
- רשום את התנהגות הגישוש של שתן לעומת מים, בתוך מסגרת זמן 2 דקות במצלמת וידאו. אחרי כל שנתוני העכברים נבדקים לדילול הגבוה ביותר (1: 10,000), לחשוף לריכוז גבוה יותר של שתן, כפי שצוין לעיל.
4. הודעה-הוק ניתוח נתונים
הערה: כל הבדיקות התנהגותיות תיארו מעובדות פוסט הוק ביצוע הוראות ניתוח נתונים.
- פתח MOV קבצים בImageJ למערכות Windows
- התקנה מהירה זמן עבור Java תוך שימוש בהגדרות המותאמות אישית מhttp://www.apple.com/quicktime/download.
- התקן את תוסף הזמן המהיר מאתר ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html).
- לייבא QTJava.zip (C: Program Files QuickTime QTSystem) לextens הספרייהיון של ImageJ (.ImageJ JRE lib שלוחה).
- עותק גם QTJava.zip בתיקיית התוספים ושנה את שמו כQTJava.jar.
- התקן את ששת התסריטים מצורפים בתיקיית מאקרו (ImageJ plugins מאקרו).
- ImageJ הפתוח ולקמפל ולהריץ את תוסף הזמן המהיר, לאחר מכן קרוב ImageJ.
- פתח מחדש ImageJ ולפתוח את קובץ MOV באמצעות קובץ> יבוא> באמצעות זמן מהיר.
- התאמת וידאו
- ברגע שקובץ הווידאו נפתח בImageJ, לחתוך את הווידאו על מנת לקבל חקר 2 דקות קבועות מרגע שהנסיין יש pipetted odorants לתוך הכלוב (T0). זהה את המסגרת המתאימה לT0 ולהסיר את המסגרות הקודמות באמצעות מרווחים של 1 (תמונת ImageJ מסיר ערימות ToolsSlice). השתמש באותה פקודה למחוק את כל המסגרות עולות חקר 2 דקות.
- ודא כי הכלוב הוא מרוכז ואם יש צורך להשתמש התמונה> Transform> הפקודה סובב כדי ליישר אותו.
- רְאֵהעיבוד o
הערה: עיבוד וידאו הוא באופן מלא בסיוע מחשב ומשתמש בפקודות פקודות מאקרו מלוות מאמר זה.- כדי להגביל את האזור על הכלוב של x 218 פיקסלים בגודל 127 פיקסלים להפעיל את המאקרו שלב 1 מ> מאקרו פקודת Plugin> הפעלה. הזז את המלבן הקבוע מעל הכלוב (איור 2, שלב 1).
- חתוך את האזור של הכלוב באזור של העניין (ROI) באמצעות מאקרו שלב 2 (איור 2, שלב 2).
- השתמש מאקרו שלב 3 כדי לחלץ את תמונת העכבר מן הרקע על ידי הקצאת אות סף, despeckling וסינון שונות האות. ערכי הפלט בעלילת ציר Z מציינים את הערכים האפורים הממוצעים, המתאימים לעוצמת צל העכבר נע בתוך את ההחזר על ההשקעה של "קאמרי מים" במהלך חקירת 2 דקות. העתק את התוצאות לגיליון עבודה בשם פי את ההחזר על ההשקעה בקובץ גיליון אלקטרוני (איור 2, שלב 3).
- השתמש מאקרו שלב 4 ללחלץ את הערכים האפורים הממוצעים של העכבר בהחזר על ההשקעה "קאמרי ריח". העתק את התוצאות לגיליון עבודה בשם פי את ההחזר על ההשקעה באותו קובץ גיליון אלקטרוני כמו ב4.3.3 (איור 2, שלב 4).
- כדי להגביל את הניתוח של תנועת העכבר ב" היקף המים "החזר על השקעה נוספת להשתמש במאקרו שלב 5. העתק את התוצאה על גיליון העבודה בשם פי את ההחזר על ההשקעה באותו קובץ גיליון אלקטרוני כמו ב4.3.3 (איור 2, שלב 5).
- כדי להגביל את הניתוח של תנועת העכבר ב" היקף הריח "החזר על ההשקעה להשתמש במאקרו שלב 6. העתק את התוצאה על גיליון העבודה בשם פי קובץ הגיליון האלקטרוני החזר השקעה כמו ב4.3.3 (איור 2, שלב 6).
- לעבד את כל קטעי הווידאו ולבדוק עקביות במספר המסגרות לבעלי חיים. כאן, להקליט את כל בעלי החיים ל1,810 מסגרות המתאימות לפגישת חקר 2 דקות.
- לכל חיה ולכל סוג ROI מסגרות עם VA האפור הממוצעlues גדול יותר מאשר 0. לחלק את מספר המסגרות על ידי הערכים מקבילים לשנייה 1 ולקבל את שניות בילו בכל החזר על השקעה.
5. ניתוח סטטיסטי
- עבור כל בדיקה לוודא הומוגניות של שונות בתוך קבוצות / גנוטיפים על ידי הבדיקה של ברטלט באמצעות הנוסחא נגיש בhttp://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/.
- במבחן המשיכה והימנעות, לבצע השוואות בין הפעמים בילו במים לעומת ריח בתוך קבוצה אחת באמצעות מבחן t של סטודנט שאינו-כיווני בהנחת סטיות שווה או לא שווה בהתאם לתוצאות של הבדיקה של ברטלט. השווה את הזמנים בילו עם ריחות מופחתים לפי הזמן בילה במים בין גנוטיפים על ידי כיוון אחד ANOVA עם מבחן פוסט הוק-של Bonferroni.
- בבדיקת הרגישות לנתח השוואות של הזמן בילה עם ריח מופחתים הזמן בילו עם water בין קבוצות בדילולים ספציפיים של שתן על ידי כיוון אחד ANOVA עם מבחן פוסט הוק-של Bonferroni. השווה את הרגישות בין קבוצות לריכוזי ריח גדלו ב 2-Way ANOVA עם חזרות עם מבחן פוסט הוק-של Bonferroni.
- אינטראקציה בין גנוטיפים וטיפולים במבחן המשיכה והימנעות נחקרות על ידי 2-way ANOVA עם מבחן פוסט הוק-של Bonferroni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הבדיקה מודדת את תפיסת המשיכה לחמאת בוטנים והימנעות לחומצת 2-MB. שלוש קבוצות של עכברים שנבדקו ואת משך הזמן ב" היקף הריח "הם לכמת בהשוואה למים. במבחן ההעדפה, קבוצת הביקורת מציגה העדפה משמעותית לריח בהשוואה למים (t 8 = 2.52, p <0.05). מצד השני, קבוצת B לא מראה שום משיכה משמעותית לחמאת בוטנים ומבלה זמן רב יותר עם המים (t 6 = 3.22, p <0.05). לפיכך, הוא מתנהג בצורה שונה מקבוצת הביקורת (F = 26.39 1,7, p <0.005). בנוסף, קבוצת C לא מראה אפליה ומבלה בערך באותו הזמן עם מים וחמאת בוטנים (לא 8 = 0.78, p = 0.45). בסך הכל, שלוש הקבוצות מתנהגות באופן שונה (F = 2,9 19.83, p <0.005) וקיימת אינטראקציה משמעותית בין גנוטיפ והטיפול (חמאת בוטנים ומים) (2,1 F = 4.90, p <0.005) ( בתגובה ל- 2 MB חומצת קבוצת הבקרה מציגה רפלקס הימנעות וכתוצאה מכך מבלה זמן רב יותר עם מים (t 8 = 2.67, p <0.05). כמו כן, קבוצה ב 'מראה רפלקס הימנעות בולט 2-MB חומצה (t 6 = 3.71, p <0.01). מצד השני, קבוצת C אינה מפלה בין שני הריחות ומבלה פעמים להשוות עם 2-MB חומצה ומים (t = 8 2.2, p = 0.6) (איור 3). באופן הכללי, השוואת תגובת הימנעות שלוש קבוצות לא להציג התנהגות משמעותית שונה (F 2, 9 = 0.76, p = 0.49) כתוצאה אין אינטראקציה בין הטיפול וגנוטיפ (F 1, 2 = 0.52, p = 0.63). בבדיקת רגישות חוש הריח שתנו נקבה, העקומה מציגה את ההעדפה לשתן בריכוזים שונים לעומת מים (העדפת מדד = זמן בילו עם השתן המופחת לפי הזמן בילה עם מים). בההיא בדיקה, אנו רואים שקבוצת ביקורת יש סף משיכה לשתן בדילול של 1: 1,000 ומציג הגדלת משיכה לשתן עם ריכוזים עולים. הקבוצה B ו- C להציג 100 פי סף גבוה יותר למשיכה (01:10) בהשוואה לקבוצה (F 2,9 = 4.78, p <0.05). הקבוצה B ועקומות רגישות דומות תצוגת C (F = 0.36 1,19, p = 0.55). השוואת הרגישות בין קבוצות, נראה כי קבוצה יש רגישות גבוהה יותר לשתן נשי בהשוואה לקבוצה B ו- C (F 2,19 = 7.12, p <0.01) (איור 4). 
איור 1: ייצוג של ההתקנה המשמשת לביצוע בדיקות חוש הריח. מצלמה (א) לעיל הכלוב. עכברים (B) ממוקמים בכלוב לתקופה התרגלות 5 דקות. (ג) ODOטרטורים הם pipetted על הקיר של הכלוב. פעילות חיפושים של odorant לעומת מים (D) הוא נבדק בחלון 2 דקות. 
איור 2:.. זרימת עבודה של עיבוד וידאו בעזרת מחשב באמצעות פקודות פקודות מאקרו בImageJ הדוגמא מתייחסת לעכבר מקבוצה חשוף לשתן בדילול 1:10 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 3:. נציגי תוצאות של בדיקות העדפה והימנעות חוש הריח העכברים של שלוש הקבוצות (n = 5 לקבוצה, n = 4 לקבוצה B ו- n = 5 לקבוצה C) נחשף לבוטנים () אבלter וחומצה (B) 2-MB לפגישת חקר 2 דקות. סה"כ הזמן לחקור את הריח (עיגולים שחורים) לעומת מים (עיגולים אפורים) מיוצג. הבדלים משמעותיים בהתנהגות חוש הריח בין קבוצות מסומנים על ידי פסים אופקיים שחורים וכוכביות. הבדלים משמעותיים במרחרחים פעמים בין הריח והמים בתוך קבוצות מוצגים על ידי פסים אופקיים אפורים וכוכביות. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.01 (פסים אפורים אופקיים, מבחן t; פס אופקי שחור, בכיוון אחד ANOVA). ברים שגיאת שגיאות תקן של הממוצע (SEM). 
איור 4:. נציגי תוצאות של מבחני רגישות להגדלת ריכוזים של שתן נקבת עקומת מדד ההעדפה, שניתנה על ידי זמן החיפושים עם שתן בריכוזים שונים מופחתים לפי הזמן בילה במים, מראה כי קבוצה(N = 5) יש הרגישות הגבוהה ביותר לשתן בהשוואה לקבוצה B (n = 4) ו- C (n = 5). * P <0.05 (פסים אופקיים שחורים, בכיוון אחד ANOVA). ברים שגיאה הם SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הבדיקות המוצעות בפרוטוקול זה מאפשרים להעריך היבטים שונים של התנהגות חוש הריח מולדת בעכברים: תפיסה לריחות, אפליה בין ריחות לעומת מים ורגישות לריחות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל ריח על פי ההעדפה והיקף הימנעות מוצגת 15 בעבר. מאז הפרוטוקול מבוסס על פעילות גישוש חשוב שהעכברים לא להציג כל ירידת ערך רכב או חרדה שעשויה להשפיע על התנועה שלהם ולהפריע לחקר חוש הריח. הבדיקות המתוארות מיועדות לעכברי זכרים בוגרים אולם הם יכולים להיות מותאמים גם לחקור olfaction בנשים בוגרות או עכברים בגיל.
לפני תחילת olfaction כגון מחקר חוקר בעכברים חשוב לשים לב להיבטים הבאים: 1) לבצע כל בדיקה בהפרש של לפחות 3 ימים. הימנעות צריכה להיבדק כאחרון כדי למזער הפרעות זיכרון חוש הריח 20; 2) לבצע את הדוארxperiments באותו הזמן של היום, רצוי בשעתי אחר הצהריים המאוחרים, כאשר העכברים נמצאים במחזור הפעיל שלהם 21 ולהשתמש במקור מעומעם של אור. בנוסף, תזמון בדיקת חוש הריח בפקדי פעמים מוגדרות לשינויים אפשריים ביממת פונקציות חוש הריח 22; 3) לפני תחילת בדיקת ההימנעות, אשר משתמשת בניחוחי דוחה, כגון חומצות, להביא כלוב אחד בזמן שבחבילה הניסיונית ולשמור על הכלוב מתחת למכסת מנוע למינרית. שלב זה חשוב כדי למנוע התרגלות לodorant ולקבל תגובה הומוגנית יותר באותה הקבוצה; 4) באופן זמני להפריד את העכברים שנבדקו עד שכל העכברים מאותו הכלוב חשופים לodorant, כדי למזער את זיהום odorant; 5) להשתמש בבעלי חיים מאותו הזן, שכן זנים שונים יכולים להתנהג באופן הטרוגני כאשר הם נחשפים לodorant 23; 6) הנסיין צריך ללבוש חלוק מעבדה בכל העת ולשנות כפפות בין בעלי החיים כדי למנוע ערבוב ריח; 7)לאחר pipetting המפעיל צריך לנוע באיטיות מהכלוב במרחק של 1.3 מטרים כדי למנוע כל גירוי בלבול לעכברים במהלך חיפושי חוש הריח; עכברי 8) בו מוצגות ערכים אפורים ממוצעים רק בחדר אחד יש הוצאו מהמחקר, מאז עכברים צפויים לחקור את שני התאים לדרגות שונות.
השיטה המתוארת מציעה מספר יתרונות על פני פרוטוקולים אחרים: זה מאוד פשוט להגדיר, משתמשת בחומרים זולים, זה של השלמה מהירה ומנצל של תוכנות קוד פתוחות, כגון ImageJ. בנוסף, אנו מספקים פקודות מאקרו כי הם מוכנים להתקנה ואשר ניתן בשימוש מותאם אישית ומותאם לכל זירה ויותר מ -2 היקפה ריח. זה חייב להיות ציין כי רק הזמן בילה במתחם שהוקצה הריח הוא מדד לפעילות חוש הריח. ואילו הזמן המושקע בכל תא נותן קריאת נתונים של פעילות חיפושים של העכבר והוא הערכה גסה בלבד של התנהגות חוש הריח. כמו בשיטות אחרות, כוח סטטיסטי יכול להיות שנרכש על ידי הגדלת מספרם של בעלי חיים לכל קבוצה.
בהשוואה לבדיקת חוש הריח באמצעות olfactometers, שיכול לשלוט באופן אוטומטי ללחץ אדים וזמן אספקה 12 - 14, הפרוטוקול המוצע פחות מבוקר. עם זאת, כל הריחות מיושמים בכמויות שווה, במרחק מוגדר ולאותו חלון הזמן. לפיכך, שמירה על המשתנים הללו קבועים, בזה בדיקת olfactometer לא נדרש. יש עוד מגבלת פוטנציאל לפרוטוקול זה מורכב בזמן הנדרש להתאמה והחיתוך של כל וידאו כדי להשיג מספר קבוע של מסגרות. עם זאת, באותו הניתוח בעזרת המחשב יכול לשמש גם על הגדרות מתוחכמות יותר עם יציאות ריח אספקת הריח בזמנים מסוימים. במקרה זה, חיתוך וידאו יכול להיות מוגדר באופן אוטומטי.
בהשוואה לפרוטוקולים אחרים באמצעות כריות כותנה אניmpregnated עם ריח לבדוק משיכה והימנעות, הפרוטוקול הנוכחי מספק מידע נוסף על אפליית חוש הריח בין ריח רומן וניטראלי ריח (מים) 15,16 בהפעלה ניסיונית אחת אחת. יתר על כן, הפרוטוקול אינו מחייב מסנוור ניסיוני ויכול להיות שנערך כולו על ידי ניסוי בודד באמצעות הניתוח בעזרת מחשב משוחד.
בדיקות פשוטות אלה יכולים לשמש כדי לפקח על ההתקדמות של גירעונות עצביים במודלים של עכברי מחלת אלצהיימר או פרקינסון ולחקור מנגנונים של העברת חוש הריח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse cage | Italplast (Italy) | 1144B | 36 cm length x 20.5 cm width x 13.5 cm height |
| Chipped wood bedding | Abedd (Austria) | LTE E-001 | 3 cm high |
| Peanut butter | Migros (Switzerland) | NA | 1:10 |
| 2-Methylbutyric | Sigma Aldrich (Switzerland) | W269514 | Pure |
| Female urine from fertile females of same mouse strain | NA | NA | Dilution series |
| Camera | Olympus (US) | Camedia C-8080 | MOV files |
| Quicktime for Java (Windows) | Apple (USA) | NA | video plugin for visualizing MOV files |
| ImageJ for Windows | NIH (USA) | NA | Video Processing/Analysis |
References
- Doty, R. L., Kamath, V. The influences of age on olfaction: a review. Cognitive Science. 5, 20 (2014).
- Mesholam, R. I., Moberg, P. J., Mahr, R. N., Doty, R. L. Olfaction in neurodegenerative disease: a meta-analysis of olfactory functioning in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Archives of Neurology. 55 (1), 84-90 (1998).
- Moberg, P. J., et al. Olfactory Dysfunction in Schizophrenia: A Qualitative and Quantitative Review. Neuropsychopharmacology. 21 (3), 325-340 (1999).
- Kovács, T. Mechanisms of olfactory dysfunction in aging and neurodegenerative disorders. Ageing Research Reviews. 3 (2), 215-232 (2004).
- Barrios, F. A., et al. Olfaction and neurodegeneration in HD. Neuroreport. 18 (1), 73-76 (2007).
- Doty, R. L. Olfaction in Parkinson’s disease and related disorders. Neurobiology of Disease. 46 (3), 527-552 (2012).
- Doty, R. L., Shaman, P., Dann, M. Development of the University of Pennsylvania Smell Identification Test: a standardized microencapsulated test of olfactory function. Physiology & Behavior. 32 (3), 489-502 (1984).
- Devanand, D. p, et al. Olfactory Deficits in Patients With Mild Cognitive Impairment Predict Alzheimer’s Disease at Follow-Up. American Journal of Psychiatry. 157 (9), 1399-1405 (2000).
- Conti, M. Z., et al. Odor Identification Deficit Predicts Clinical Conversion from Mild Cognitive Impairment to Dementia Due to Alzheimer’s Disease. Archives of Clinical Neuropsychology. 28 (5), 391-399 (2013).
- Keller, A., Vosshall, L. B. Better Smelling Through Genetics: Mammalian Odor Perception. Current opinion in neurobiology. 18 (4), 364-369 (2008).
- Brai, E., et al. Notch1 activity in the olfactory bulb is odour-dependent and contributes to olfactory behaviour. European Journal of Neuroscience. 40 (10), 3436-3449 (2014).
- Larson, J., Hoffman, J. S., Guidotti, A., Costa, E. Olfactory discrimination learning deficit in heterozygous reeler mice. Brain Research. 971 (1), 40-46 (2003).
- Alonso, M., et al. Olfactory Discrimination Learning Increases the Survival of Adult-Born Neurons in the Olfactory Bulb. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10508-10513 (2006).
- Wesson, D. W., Keller, M., Douhard, Q., Baum, M. J., Bakker, J. Enhanced urinary odor discrimination in female aromatase knockout (ArKO) mice. Hormones and behavior. 49 (5), 580-586 (2006).
- Kobayakawa, K., et al. Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb. Nature. 450 (7169), 503-508 (2007).
- Witt, R. M., Galligan, M. R., Despinoy, J., Segal, R. Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse. Journal of Visualized Experiments JoVE. (23), (2009).
- Lee, A. W., Emsley, J. G., Brown, R. E., Hagg, T. Marked differences in olfactory sensitivity and apparent speed of forebrain neuroblast migration in three inbred strains of mice. Neuroscience. 118 (1), 263-270 (2003).
- Page, D. T., et al. Computerized assessment of social approach behavior in mouse. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 3, 48 (2009).
- Nyfeler, Y., et al. Jagged1 signals in the postnatal subventricular zone are required for neural stem cell self-renewal. Embo J. 24 (19), Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=16163386" 3504-3515 (2005).
- Tong, M. T., Peace, S. T., Cleland, T. A. Properties and mechanisms of olfactory learning and memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Steinlechner, S. Chapter 2.12 - Biological Rhythms of the Mouse. The Laboratory Mouse (Second Edition). , Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123820082000179 383-407 (2012).
- Corthell, J., Stathopoulos, A., Watson, C., Bertram, R., Trombley, P. Olfactory Bulb Monoamine Concentrations Vary with Time of Day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
- Lehmkuhl, A. M., Dirr, E. R., Fleming, S. M. Olfactory assays for mouse models of neurodegenerative disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51804 (2014).
