Abstract
L'olfatto è altamente conservata tra le specie ed è necessario per la riproduzione e la sopravvivenza.
Negli esseri umani, l'olfatto è anche uno dei sensi che viene colpito con l'invecchiamento ed è un forte predittore di malattie neurodegenerative. Così, test olfattivo è usato come un metodo diagnostico non invasivo per rilevare deficit neurologici presto. Al fine di comprendere i meccanismi alla base olfattiva suscettibilità rete, ricerca olfattiva nei roditori ha preso slancio negli ultimi dieci anni.
Qui, presentiamo un metodo semplice, efficiente e riproducibile test olfattivo tempo di percezione dell'odore innata e sensibilità nei topi senza la necessità di qualsiasi restrizione cibo o acqua prima. I test vengono eseguiti in un ambiente familiare per i topi, richiedono solo i profumi e 2 minuti a sessione di esposizione odorizzante. Viene eseguita l'analisi post-hoc, utilizzando i comandi del computer-assistita in ImageJ e può essere, quindi,, Effettuata dall'inizio alla fine da un ricercatore.
Questo protocollo non richiede alcun hardware o configurazione speciale ed è indicato per qualsiasi laboratorio interessati a testare percezione olfattiva e sensibilità.
Introduction
Olfatto è una delle funzioni sensoriali più sviluppate ed importanti nei mammiferi. Qualsiasi riduzione di valore di attività olfattiva possono influenzare l'assunzione di cibo, comportamento sociale e, nel peggiore dei casi, anche la sopravvivenza. Negli esseri umani, il deterioramento olfattivo è l'età dipendente 1 ed è considerato un forte predittore di disturbi neurologici 2-6. Il test di identificazione olfattiva sviluppato dalla University of Pennsylvania rappresenta attualmente uno dei più utilizzati, non invasive e quantificabili, test diagnostici che possono valutare i primi deficit neurologici 7 e prevedere con elevata probabilità la progressione della demenza 8,9.
L'accessibilità del sistema olfattivo e l'importanza dell'olfatto nei roditori, ha scatenato una linea intensa ricerca sulle funzioni meccanismi olfattivi sottostanti 10. Abbiamo precedentemente dimostrato che la perdita di funzione della recept segnalazioneo Notch1 colpisce evitamento olfattiva 11. In questo protocollo si usa topi privi del ligando segnalazione, Jagged1, in neuroni o glia per studiare le prestazioni olfattiva.
L'olfatto innata è definito da tre parametri come la percezione, discriminazione tra odori e sensibilità olfattiva 4. Test olfattivo in roditori può essere fatto in una varietà di modi e alcuni studi comportamentali fare uso di olfactometers, che forniscono l'odore all'animale in una specifica concentrazione di vapore e in un lasso di tempo preciso 12 - 14. Tuttavia, questo strumentazione è costoso e può essere disponibile solo in strutture specializzate. Nel nostro lavoro, forniamo un protocollo semplice, veloce e riproducibile test olfattivo, che viene effettuata con profumi volatili. Le prove descritte percezione misura a un attrattivo o un odore repellente e valutare la discriminazione tra il profumo e il 11,15,16 acqua. Utilizzando la stessa messa a punto, we può anche misurare la sensibilità ad un odore a diverse concentrazioni 16,17. L'elaborazione video post-hoc assistita da computer, ispirato all'opera di pagina e colleghi 18, fornisce i risultati imparziali, senza la necessità di accecamento sperimentale e consentendo una sola persona per svolgere l'intero esperimento.
Questo protocollo è destinato a fornire un punto di partenza per studiare il comportamento olfattiva nei topi.
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Protocol
Tutte le procedure di animali sono in conformità con la Direttiva UE 2010/63 / UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e sono approvati dalla locale comitato Animal Care (Cantone di Friburgo, Svizzera).
1. Preparazione degli animali
- Animali da esperimento
- Effettuare esperimenti su wild type maschio adulto e topi transgenici (C57BL / 6 di fondo) di 3-5 mesi di età. I tre gruppi di topi corrispondono a controlli di tipo littermate selvatici (gruppo A, Jagged1 flox / flox 19) e due linee del mouse condizionali KO (gruppo B, e C Jagged1ncKO, Jagged1gcKO).
- Topi Camera in condizioni standard di laboratorio in una stanza ventilata, con un ciclo di buio / luce controllata 12 ore e di fornire cibo e acqua ad libitum.
2. Setup sperimentale
- Arena sperimentale
- Per l'arena sperimentale, utilizzare una gabbia del mouse sterilizzato pulito (36 centimetri di lunghezza x 20,5 centimetri di altezza di larghezza x 13.5 cm) (Figura 1A).
- Assegnare ad ogni mouse per una gabbia numerata con biancheria fresca, alto 3 cm. Se gabbie vengono riutilizzati, come nella prova di sensibilità odore, adottare le seguenti misure per evitare la contaminazione incrociata tra odori e topi.
- Segnare il lato acqua.
- Pulire le pareti strette delle gabbie con due carte tissue spruzzati con etanolo al 70%, una per ogni lato.
- Accumulano gabbie secondo il genotipo dei topi e memorizzare temporaneamente sotto una cappa laminare.
- Macchina fotografica
- Montare una fotocamera su un treppiede personalizzato con l'obiettivo a 58 cm dal fondo della gabbia (Figura 1A). Fissare la posizione del treppiede e la gabbia e delimitare con segni per consentire alla telecamera di essere centrato sulla parte superiore della gabbia.
- Video su 320 pixel x 240 pixel, 15,08 fotogrammi al secondo come file MOV registrare.
- Odori
- Risospendere il scents, quando indicato, nel solvente in cui siano solubili.
- Per il test di preferenza burro di arachidi uso. Risospendere il burro di arachidi in olio di arachidi (10% w / v).
- Per l'uso di test evitamento acido puro 2-metil (2-MB) (98%).
- Per la prova di sensibilità, usare urina femminile dalla stessa colonia mouse e sfondo (C57BL / 6).
- Per comodità raccogliere le urine 1-2 giorni prima della prova olfattiva. Trattenere e tenere premuto il mouse sotto il cofano con il suo ventre sopra la griglia gabbia. Sotto la griglia gabbia collocare un piatto di plastica petri per raccogliere le gocce di urina.
- Raccogliere l'urina da ciascuna femmina in una provetta da 1,5 ml e miscelare tutti i campioni di urina per normalizzare la variabilità tra animali. Conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
- Il giorno dell'esperimento, scongelare l'urina ed eseguire 4 diluizioni in acqua bidistillata a un fattore di diluizione di 10 (1:10, 1: 100, 1: 1.000, 1: 10.000).
3. Test olfattiva
Nota: in questo protocollo gli odori sono stati volutamente scelti, che sono percepiti come attrattivi forti (burro di arachidi e di urina femminile) o forte repellente (acido 2-MB) 15. È importante effettuare la preferenza e test di sensibilità a piacevoli odori prima della prova di scampo per eliminare la possibilità di eventuali interferenze con il comportamento olfattiva. Tuttavia, per ragioni di semplicità, in questo lavoro, la preferenza e l'elusione di prova saranno entrambi descritti sotto il test di percezione. Ogni sessione comportamentale inizia con una fase di assuefazione.
- Fase assuefazione
- Posto l'animale in gabbia assegnato pulito e lasciate esplorare per 5 minuti (Figura 1B). Poiché l'ambiente della gabbia sperimentale è familiare alla gabbia a casa, questo breve periodo di tempo è sufficiente per consentire assuefazione.
- Se il test di sensibilità viene completato in un giorno, effettuare assuefazione sola volta prima della application di alta dell'odore diluito. Se il test di sensibilità viene eseguita in giorni diversi, ogni giorno è necessaria una fase di assuefazione su una nuova gabbia pulita.
- Percezione di prova
- Dopo assuefazione, attivare la fotocamera e subito pipetta 60 ml di profumo gradevole (burro di arachidi) e 60 ml di profumo neutro (acqua di rubinetto) sulle pareti opposte della gabbia a circa 10 cm dal fondo (Figura 1C).
- Lasciate che il mouse esplorare gli odori per 2 minuti (Figura 1D). Successivamente, spegnere la fotocamera.
- A questo punto, procedere con la successiva del mouse a partire dalla fase di assuefazione. Eseguire il test di evitamento esattamente nello stesso modo, applicando 60 ml di odore repellente (acido 2-MB) e 60 ml di acqua.
- Test di sensibilità
- Valutare la soglia attrazione di topi maschi a concentrazioni crescenti di urina femminile nel seguente ordine: 1: 10.000; 1: 1.000; 1: 100; 1:10 e nelle urine puro.
- Dopo assuefazione, esporre ogni topo alla più alta diluizione pipettati dallo sperimentatore come precedentemente descritto in 3.2.1.
- Registrare il comportamento esplorativo di urina contro acqua, entro un arco di tempo 2 minuti su una videocamera. Dopo che tutte le coorti di topi sono testati per la più alta diluizione (1: 10.000), esporre a una maggiore concentrazione di urina, come sopra indicato.
4. analisi post-hoc dei dati
Nota: Tutti i test comportamentali descritti sono trattati post hoc seguendo le istruzioni di analisi dei dati.
- Aprire MOV file in ImageJ per i sistemi Windows
- Installare Quick Time per Java utilizzando le impostazioni personalizzate da http://www.apple.com/quicktime/download.
- Installare il plugin Quick Time dal sito ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html).
- Importare il QTJava.zip (C: Program Files QuickTime QTSystem) nei extens bibliotecaioni di ImageJ (.ImageJ jre lib ext).
- Copiare anche il QTJava.zip nella cartella plugins e rinominarlo come QTJava.jar.
- Installare i sei script allegati nella cartella macro (ImageJ plugins Macros).
- Aprire ImageJ e compilare ed eseguire il plugin Quick Time, da allora in poi vicino ImageJ.
- Riaprire ImageJ e aprire il file MOV utilizzando File> Importa> utilizzando Quick Time.
- Regolazione Video
- Una volta che il file video viene aperto in ImageJ, tagliare il video per ottenere una costante esplorazione 2 min dal tempo sperimentatore ha pipettato i odoranti nella gabbia (T0). Identificare il telaio corrispondente al T0 e rimuovere i fotogrammi precedenti utilizzando incrementi di 1 (ImageJ immagine Pile ToolsSlice rimozione). Utilizzare lo stesso comando per eliminare tutti i fotogrammi che superano l'esplorazione 2 min.
- Assicurarsi che la gabbia sia centrato e se necessario utilizzare l'Immagine> Trasforma> comando Ruota per allinearlo.
- Vedasio Elaborazione
Nota: l'elaborazione video è interamente assistita da computer e utilizza i comandi macro che accompagnano questo articolo.- Al fine di limitare l'area sulla gabbia di un x 218 pixel dimensioni 127 pixel eseguire la Fase 1 macro dal Plugin> Macro> Esegui comando. Spostare il rettangolo fisso sopra la gabbia (Figura 2, punto 1).
- Raccolto l'area della gabbia sulla regione di interesse (ROI) utilizzando la Fase 2 macro (Figura 2, Passaggio 2).
- Utilizzare la Fase 3 macro per estrarre l'immagine del mouse dallo sfondo assegnando un segnale di soglia, despeckling e filtrando la varianza del segnale. I valori di uscita nel grafico sull'asse Z indicano i valori medi di grigio, corrispondente all'intensità dell'ombra del mouse spostano all'interno della ROI della "camera dell'acqua" durante l'esplorazione 2 min. Copiare i risultati in un foglio di lavoro denominato secondo il ROI in un foglio di calcolo (Figura 2, punto 3).
- Utilizzare il Passo 4 macroestrarre i valori medi grigi del mouse nella ROI "camera di odore". Copiare i risultati in un foglio di lavoro denominato secondo il ROI nello stesso file foglio di calcolo come a 4.3.3 (Figura 2, punto 4).
- Al fine di limitare ulteriormente l'analisi del movimento del mouse nella ROI "perimetro acqua" utilizzare la macro Passaggio 5. Copiare il risultato sul foglio di lavoro denominato in base al ROI nello stesso file foglio di calcolo come a 4.3.3 (Figura 2, punto 5).
- Per limitare l'analisi del movimento del mouse nella ROI "odore perimetrale" utilizzare la macro Passo 6. Copiare il risultato sul foglio di lavoro denominato in base al file ROI foglio di calcolo come a 4.3.3 (Figura 2, Procedimento 6).
- Elaborare tutti i video e controllare la coerenza del numero di fotogrammi al animali. Qui, registrare tutti gli animali per 1.810 fotogrammi corrispondenti ad una sessione di esplorazione 2 min.
- Per ciascun animale e per ogni ROI sorta telai con media va grigiolues maggiore di 0. Divide il numero di fotogrammi dai valori corrispondenti a 1 secondo e ottenere i secondi trascorsi in ogni ROI.
5. Analisi statistica
- Per ogni prova di verificare l'omogeneità della varianza all'interno gruppi / genotipi con il test di Bartlett con la formula accessibile http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/.
- Nella attrazione e l'elusione di prova, effettuare confronti tra i tempi trascorsi con acqua contro odore entro un gruppo utilizzando test t di Student non direzionale assumendo varianze uguali o disuguali a seconda dei risultati del test di Bartlett. Confronto i tempi trascorsi con gli odori sottratto dal tempo trascorso con acqua tra le genotipi da ANOVA con test post-hoc di Bonferroni.
- Nel test di sensibilità analizzare i confronti tra il tempo trascorso con l'odore sottratto dal tempo trascorso con water tra i gruppi a una specifica diluizioni di urina da ANOVA con test post-hoc di Bonferroni. Confrontare la sensibilità tra i gruppi a crescenti concentrazioni di odori da 2-Way ANOVA con ripetizioni con test post-hoc di Bonferroni.
- L'interazione tra genotipi e trattamenti nella attrazione e l'elusione di prova sono indagati da 2-way ANOVA con test post-hoc di Bonferroni.
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Representative Results
Il test misura la percezione attrazione di burro di arachidi e di evitare di acido 2-MB. Tre gruppi di topi sono testati e il tempo trascorso in "odore perimetrale" vengono quantificati rispetto all'acqua. Nel test di preferenza, il gruppo di controllo A visualizza preferenza significativa per l'odore rispetto all'acqua (t 8 = 2.52, p <0,05). D'altra parte, il gruppo B non mostra alcuna attrazione significativa al burro di arachidi e passa più tempo con acqua (6 t = 3.22, p <0,05). Così, si comporta diversamente dal gruppo di controllo A (F 1,7 = 26.39, p <0.005). Inoltre, il gruppo C non mostra alcuna discriminazione e spende circa lo stesso tempo con acqua e burro di arachidi (t 8 = 0,78, p = 0,45). Nel complesso, i tre gruppi si comportano in modo diverso (F 2,9 = 19,83, p <0.005) e vi è una significativa interazione tra il genotipo e il trattamento (burro di arachidi e acqua) (F 2,1 = 4,90, p <0.005) ( In risposta a 2-MB acido gruppo di controllo visualizza un riflesso evitamento e di conseguenza passa più tempo con acqua (t 8 = 2.67, p <0,05). Analogamente, il gruppo B mostra un evitamento reflex pronunciato a 2-MB acido (t 6 = 3.71, p <0,01). D'altra parte, il gruppo C non discrimina tra i due odori e passa tempi comparabili con 2-MB acido e acqua (8 t = 2.2, p = 0,6) (Figura 3B). Nel complesso, confrontando la risposta di evitamento i tre gruppi non visualizza un comportamento diverso significativa (F 2, 9 = 0,76, p = 0,49), come conseguenza vi è alcuna interazione tra il trattamento e il genotipo (F 1, 2 = 0,52, p = 0.63). Nel test di sensibilità olfattiva di urina femminile, la curva viene visualizzata la preferenza per urina a diverse concentrazioni rispetto acqua (Preferenza index = tempo trascorso con urina sottratto dal tempo trascorso con acqua). In thè prova, osserviamo che gruppo di controllo A ha una soglia di attrazione per l'urina alla diluizione di 1: 1.000 e visualizza crescente attrazione per urina con l'aumento delle concentrazioni. Gruppo B e C mostrano un 100 volte più elevato della soglia di attrazione (1,10) rispetto al gruppo A (F 2,9 = 4,78, p <0,05). Display C curve di sensibilità comparabili gruppo B e (F = 1,19 0,36, p = 0,55). Confrontando la sensibilità tra i gruppi, sembra che il gruppo A ha una maggiore sensibilità di urina femminile rispetto al gruppo B e C (F 2,19 = 7.12, p <0,01) (Figura 4). 
Figura 1: Rappresentazione del installazione utilizzato per eseguire i test olfattivi. (A) Camera sopra la gabbia. (B) I topi sono posti in una gabbia per un periodo di 5 minuti assuefazione. (C) La odosproloqui sono pipettati sulla parete della gabbia. (D) L'attività esplorativa di odorizzante rispetto dell'acqua viene testata in una finestra 2 min. 
Figura 2:.. Workflow di elaborazione video assistita da computer utilizzando i comandi macro in ImageJ L'esempio si riferisce a un mouse del gruppo A esposto ad urina in una diluizione 1:10 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 3:. I risultati rappresentativi dei test di preferenza e di evitamento olfattive I topi dei tre gruppi (n = 5 per il gruppo A, n = 4 per il gruppo B e n = 5 per il gruppo C) sono stati esposti a (A) di arachidi, mater e acido (B) 2-MB per una sessione di esplorazione 2 min. Il tempo totale di esplorare l'odore (cerchi neri) contro acqua (cerchi grigi) è rappresentato. Differenze significative nel comportamento olfattivo tra i gruppi sono indicati da barre orizzontali nere e asterischi. Differenze significative nei tempi tra l'odore e l'acqua all'interno dei gruppi sniffing sono indicati da barre orizzontali grigie e asterischi. * P <0.05, ** p <0.01, *** p <0.01 (barre orizzontali grigie, test t; barra orizzontale nera, ANOVA). Le barre di errore sono errori standard della media (SEM). 
Figura 4:. Risultati rappresentativi di test di sensibilità a concentrazioni crescenti di urina femminile La curva preferenza, in tempo di esplorazione con urina a diverse concentrazioni sottratto dal tempo trascorso con acqua, mostra che gruppoA (n = 5) ha la più alta sensibilità per urine rispetto al gruppo B (n = 4) e C (n = 5). * P <0,05 (barre orizzontali nere, ANOVA). Le barre di errore sono SEM.
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Discussion
I test proposti in questo protocollo permette di valutare diversi aspetti del comportamento olfattivo innato nei topi: percezione di odori, di discriminazione tra gli odori contro l'acqua e la sensibilità agli odori. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi odore secondo la preferenza e la scala evitamento precedentemente dimostrato 15. Poiché il protocollo si basa sull'attività esplorativa è importante che i topi non presentano deficit motori o ansia che possono influenzare il loro movimento e interferire con l'esplorazione olfattiva. Le prove sono destinati topi maschi adulti ma possono essere adattate per investigare olfaction anche nelle femmine adulte o topi anziani.
Prima di iniziare una tale olfatto studio che ha valutato nei topi, è importante prestare attenzione ai seguenti aspetti: 1) eseguire ogni prova, ad una distanza di almeno 3 giorni. Evitare dovrebbe essere testato da ultimo per ridurre al minimo le interferenze di memoria olfattiva 20; 2) effettuare la postaxperiments allo stesso tempo del giorno, preferibilmente nel tardo pomeriggio, quando i topi sono nel loro ciclo attivo 21 e utilizzano una fonte di luce soffusa. Inoltre, la pianificazione del test olfattivo a volte definiti controlli per eventuali modifiche circadiani nelle funzioni olfattive 22; 3) prima di iniziare il test di evitamento, che utilizza odoranti repellenti, come acidi, portare una gabbia al tempo nella suite sperimentale e mantenere la gabbia sotto una cappa laminare. Questo passo è importante per evitare assuefazione al odorizzante ed ottenere una risposta più omogenea nello stesso gruppo; 4) separare temporaneamente i topi che sono stati testati fino a quando tutti i topi della stessa gabbia sono esposti alla odorizzante, per minimizzare la contaminazione odorizzante; 5) usare animali dello stesso ceppo, poiché diversi ceppi possono comportarsi in maniera eterogenea quando esposto ad un odorizzante 23; 6) lo sperimentatore deve indossare un camice da laboratorio in ogni momento e cambiare i guanti tra gli animali per prevenire l'odore di miscelazione; 7)dopo pipettaggio l'operatore deve muoversi lentamente dalla gabbia ad una distanza di 1,3 metri per evitare qualsiasi stimolo confusione ai topi durante l'esplorazione olfattiva; 8) i topi che mostrano valori di grigio medi solo in una camera devono essere escluse dallo studio, dal momento che i topi sono tenuti ad esplorare entrambe le camere in misura diversa.
Il metodo descritto offre diversi vantaggi rispetto ad altri protocolli: è estremamente semplice da configurare, utilizza materiali poco costosi, è di completamento veloce e si avvale di un software open source, come ad esempio ImageJ. Inoltre, mettiamo a disposizione le macro che sono pronti per essere installato e che può essere personalizzato utilizzati e adattati a qualsiasi arena e più di 2 perimetri odore. Va notato che solo il tempo trascorso nel perimetro odore assegnato è una misura dell'attività olfattiva. Considerando che il tempo trascorso in ciascuna camera dà una lettura dell'attività esplorativa del mouse ed è solo una stima approssimativa del comportamento olfattivo. Come con altri metodi, potenza statistica può essere ottenuto aumentando il numero di animali per gruppo.
Rispetto al test olfattivo usando olfactometers, che possono controllare automaticamente la pressione di vapore e tempo di consegna 12 - 14, il protocollo proposto è meno controllato. Tuttavia, tutti gli odori sono applicati in volumi uguali, a distanza definita e per la stessa finestra di tempo. Quindi, mantenendo queste variabili costanti, in questo test un olfattometro non è richiesto. Vi è un altro potenziale limitazione a questo protocollo consistente nel tempo richiesto per la regolazione ed il taglio di ogni video per ottenere un numero fisso di fotogrammi. Tuttavia, la stessa analisi assistita da computer può essere utilizzato anche su configurazioni più sofisticate con porte odore erogare l'odore in momenti specifici. In questo caso, il taglio video potrebbe essere impostato automaticamente.
Rispetto ad altri protocolli che utilizzano i tamponi di cotonempregnated con l'odore di provare attrazione e l'elusione, l'attuale protocollo prevede un ulteriore informazioni sulla discriminazione olfattiva tra un romanzo odore e un odore neutro (acqua) 15,16 in una sessione sperimentale unico. Inoltre, il protocollo non richiede accecamento sperimentale e può essere completamente condotto da un singolo sperimentatore utilizzando l'analisi computerizzata imparziale.
Questi semplici test possono essere utilizzati per monitorare la progressione dei deficit neurali in modelli murini della malattia di Alzheimer o di Parkinson e di indagare i meccanismi di trasmissione olfattiva.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse cage | Italplast (Italy) | 1144B | 36 cm length x 20.5 cm width x 13.5 cm height |
| Chipped wood bedding | Abedd (Austria) | LTE E-001 | 3 cm high |
| Peanut butter | Migros (Switzerland) | NA | 1:10 |
| 2-Methylbutyric | Sigma Aldrich (Switzerland) | W269514 | Pure |
| Female urine from fertile females of same mouse strain | NA | NA | Dilution series |
| Camera | Olympus (US) | Camedia C-8080 | MOV files |
| Quicktime for Java (Windows) | Apple (USA) | NA | video plugin for visualizing MOV files |
| ImageJ for Windows | NIH (USA) | NA | Video Processing/Analysis |
References
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