Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Planar Gradient Diffusion System til Undersøg Chemotaxis i en 3D kollaqenmatrix

doi: 10.3791/52948 Published: June 12, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den foretrukne bevægelse af celler mod en koncentrationsgradient, kendt som kemotaksi, spiller en vigtig rolle i patologiske og fysiologiske processer i kroppen. Sådanne eksempler er hud og slimhinder sårheling 1, morfogenese 2, inflammation 3, og tumorvækst 4,5. Det har også vist sig, at kræftceller kan migrere gennem både individuelle og kollektive strategier celle migrering 6. Desuden kan diffusionssystemer ustabilitet mekanismer fremkalde adskillelse af enkelte eller grupperede celler fra en tumorform krop / objekt og derefter kan indvandre i retning af en kilde til næringsstoffer og dermed invadere bredere områder og væv 7.

Desuden har det vist sig, at forskellige mekanismer migration kan være aktiv i 2D og i 3D, på grund af forskellige roller adhæsionsmolekyler 8. Derfor, for at et skifte til fysiologisk relevant i vitro assays undersøge celle motilitet i en measureable og enkel måde, er af betydning for forståelsen cellebevægelse fænomener 9. Desværre det er vanskeligt at analysere celle migration, en omfattende kvantificerbar kemotaksi assay kræver som regel en lang besværlig metode, der bygger på måling af upartiske cellemotilitet og transport fænomener modellerne.

Tidligere eksperimentelle metoder til at undersøge celle kemotaksis omfatter Boyden kammer 10 og under agarose assay 11. Men inden for disse tidlige assays, cell migrationseksperimenter ikke overvåge bevægelse i forhold til tiden. Mere, vigtigere, koncentrationsgradienter anvendt til forsøgene var ikke veldefineret eller helt forstået mens kun opretholde signaleringen for ikke mere end nogle få timer. Desuden tidlig kemotaksis kammer forsøg begrænset celle migration til to dimensioner og ikke tillader en at overvåge kinetik migration 12. Ser man på Boyden kammer, en endpoint assayville ikke tillade forskeren at observere migration visuelt og kunne ikke direkte skelne kemotaksi (retningsbestemt bevægelse) fra kemokinese (tilfældig bevægelse). Derudover flere variable-forskelle i porestørrelsen og tykkelsen af membraner fremstillet kammeret meget vanskeligt at reproducere og let skjult den vandrende reaktion af celler til chemokiner 13,14.

Med den nye forståelse af mikrofluidik, nye kamre og mikro-enheder blevet undersøgt som et instrument til at undersøge celle bevægelse under interstitielle strømning eller kemotaxi 15,16. Under disse nye enheder blev nye celle metrikker indføres og undersøgt, ligesom virkningen af forskydningsspænding på en celle 17,18. Desværre, tidligere og nuværende mikrofluide kemotaksi kamre begrænsede studier af cellemigration til 2D substrater-en vigtig tilbageslag da mange biologiske processer, herunder tumorcelleinvasion og metastase, og immune cellemigration, involverer 3D migration.

Direkte observationskamre-hvor en kemoattraktant opløsning er i kontakt med et 3D gel indeholdende celler er også blevet også rapporteret 19,20. Disse kamre har to rum, hvoraf det ene indeholder en kemoattraktant og en indeholdende celler, er forbundet ved siden af hinanden horisontalt 21 eller som koncentriske ringe 22. Disse systemer er spidse i den rigtige retning, men ikke holde et kemotaksi-system i en længere periode.

Desuden har forskere også undersøgt diffusivitet gennem kollagenmembraner i dialyse celler, såvel som diffusion af tracer molekyler gennem kollagen, der underkastes hydrostatisk tryk 23-25. Nogle diffusionsforsøg i kollagengeler afhængige fysiske og kemiske modifikationer af gelen under anvendelse af magnetfelter og kemisk inkorporering 26. En populær metode til at modellere diffusivitet i Collagenous væv afhængig af fluorescens billeddannelse af kontinuerlig punkt fotoblegning. Denne metode har vist anisotropi i diffusionskoefficienterne af makromolekyler i orienterede kollagene væv. Alligevel har fotoblegning blevet anvendt i ledbrusk og ikke collagenmatricer. Mens lignende, skal de fornødne modellering eksperimenter udføres gennem specifikt forstå diffusionskoefficient kollagengeler. Endnu vigtigere er, kan systemerne ikke udnytte en metode til at måle celle force generation.

Desværre synes de fleste systemer til at mangle et eller to centrale elementer for et ideelt system: Den giver mulighed for celle sporing, en diffusion gradient forståelse med en kemotaktisk faktor gennem matricen, et relativt simpelt sæt op med en lethed i reproducerbarhed, minimering af celle-celle-interaktioner, og evnen til at måle dimensionale enheder til kvantificering (dvs. hastighed, kraft, specifik koncentration). Moghe et al. 27 foreslået et system, der opfyldte de fleste af disse krav, hvor celler blev oprindeligt dispergeret i hele gelen snarere end koncentreret på filteroverfladen, men var vanskeligt at måle kræfter, cellen genererer.

Til dette formål præsenterer vi et plant gradient diffusion system til at undersøge kemotaxi i en 3D-collagenmatrix, som gør det muligt at overvinde moderne diffusionskammer begrænsningerne i de eksisterende assays, der er baseret på time-lapse mikroskopi, kombineret med billedanalyse teknikker til at måle celle kræfter i et 3D-miljø. Denne protokol giver en enkel, men innovativ måde at skabe en simpel 3D diffusionskammer, der kan bruges til at undersøge 3D kemotaksi i forskellige celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. 3D Mold Design og dele

  1. Mold
    1. Før du arbejder, får en silikone elastomer kit, en levende celle imaging kammer, en 22 mm dækglas, og en bearbejdet aluminium terning med dimensioner 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Forbered levende celler kammer til formning ved at placere dækglasset i bunden holderen og samling resten af ​​kammeret som anvist af sælgeren.
    2. Dernæst bruger pincet, placeres bearbejdet aluminium metal terning i midten af ​​den levende celle imaging kammer boliger og på toppen af ​​dækglasset, og derefter afsat.
    3. Bland silikone elastomer løsninger efter producentens protokol til at gøre 5 ml elastomer.
    4. Ved hjælp af en engangs lab spatel, hæld siliconeelastomer opløsningen i levende celler setup kammer og sikrer ikke at flytte placeret bearbejdet aluminium metal terning. Stil anlægget på laboratoriet bænken, på et sikkert sted O / N til hærdning.
    5. Den næste morgen, dekonstruerelive cell imaging kammer, som anbefalet af producenten, og træk skimmel ved hjælp af pincet. Ved hjælp af pincet, forsigtigt udtrække den bearbejdede aluminium metal terning for skimmel. Gå til vasken og skyl formen med deioniseret vand. Placer formen på et stykke køkkenrulle til at tørre.
    6. Når det er tørt, under anvendelse af en hobby kniv, skæres slidser gennem formen, anbragt 2,34 mm fra hver langsgående ende, inde silikoneformen. Sørg for skimmel ophold i et sikkert og tørt sted, indtil du er klar til at konstruere systemet til et eksperiment.
  2. Hydrofile og hydrofobe dækglas Fremstilling
    1. At tillade kollagen matrix for at holde sig til en overflade, skabe hydrofile dækglas:
      1. Ved hjælp af en engangs pipette udmåle 150 pi 3-aminopropyl-trimethoxysilan og hæld opløsning i et 50 ml rør. 30 ml af 100% ethanol til 50 ml rør med en anden engangspipette og lukke låget. Vortexes opløsning i 2 min, hvilket sikrer fuldstændig blanding. Pvores løsning i et glas petriskål og der er afsat.
      2. Hæld 15 ml 100% ethanol i en anden petriskål og der er afsat (sørg for at mærke retter).
      3. Ved hjælp af en ny engangs pipette udmåle 30 ml deioniseret vand og hæld opløsning i et 50 ml rør. Næste ved hjælp af en ny engangs pipette foranstaltning ud 1.875 pi glutaraldehyd og hæld opløsningen i samme 50 ml rør og luk låget. Vortexes opløsning i 2 min, hvilket sikrer fuldstændig blanding. Hæld blandingen i tredje petriskål, og der er afsat.
      4. Ved hjælp af pincet, tegne en 22 mm runde dækglas og skyl begge sider med 100% ethanol-blanding ved hjælp af en engangs pipette.
      5. Placere skyllet dækglas i 3-aminopropyl-trimethoxysilan med 30 ml 100% ethanol opløsning skålen og lad det sidde i opløsning i 5 min.
      6. Med pincet, tegne dækglas og skyl igen med 100% ethanol løsning med engangs pipette.
      7. Drop skylles dækglas i 1.875pi glutaraldehyd og 30 ml deioniseret vand blandingen samt afsat i 30 min.
      8. Efter 30 minutter fjernes dækglas med pincet og skyl med deioniseret vand og anbringes på tør væv O / N at tørre ved stuetemperatur.
      9. Gentag dækglas dypning og flytte for så mange dækglas som nødvendigt med de samme genererede løsninger.
    2. Gøre hydrofobe dækglas ved given protokol.
      1. Tilsættes 500 pi tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl, 100 pi eddikesyre og 19,4 ml hexan i et 50 ml rør og vortex i 2 minutter. Hæld løsning i glas petriskål og der er afsat.
      2. Ved hjælp af rene pincet, tegne en dækglas og slip i forberedt blandede opløsning i 2 min. Efter 2 minutter er gået, tegne dækglas med en pincet og skyl med deioniseret vand ved anvendelse af en engangs pipette og sted dækglas på tør væv O / N at tørre ved stuetemperatur. Store dækglas i petriskåle af plast indtil anvendelse.
      3. Gentag dækglas DIPPing og flytte for så mange dækglas som nødvendigt med de samme genererede løsninger.

2. Mold Assembly

  1. Før anvendelse af forme, under anvendelse af en engangspipette skylles formen med 90% ethylalkohol i en affaldsbeholder. Herefter sættes formen i en petriskål fyldt med deioniseret vand og lad det sidde O / N.
  2. Tag skimmel ud af opløsning ved hjælp af pincet og sted på et håndklæde til at lufttørre, før du starter formen forsamling.
  3. Mens formen er lufttørring, skære firkantede hydrofile dækglas i to rektangler lidt større end 3,95 mm x 5,99 mm ved hjælp af en høj præcision diamant-ridsning værktøj. Skub hvert snit rektangel dækglas ind i rillerne skåret i silikone formen.
  4. Flip formen på hovedet og anvende vakuum fedt langs bunden af ​​silikoneformen ved anvendelse af en engangspipette. Næste, flip formen tilbage højre side opad, og tryk på bunden af ​​formen på de cirkulære hydrofile glas coverslip at skabe en tætning.
  5. Med engangshandsker, afhente den samlede mug og anbringes i en disponibel petriskål og derefter ind i en bio-hætte. Tænd UV Bio-hætte lampe i 1 time til at sterilisere formen før eksperimenter opstår.

3. Kollagen Blanding og 3D Matrix

  1. Før udarbejdelsen af kollagen blandingen, bejdse og forberede celler til billeddannelse i henhold til standardprotokoller 28.
  2. Anvendelse af standard laboratorieteknikker og protokoller 29,30, i en bio-hood, bland celle medier og kemoattraktant i et 15 ml rør til den ønskede kemoattraktant koncentration. Pipette 5 ml bestemt celle medie-chemoattractant koncentration løsning i et 15 ml rør og flytte opløsningen i et opvarmet vandbad.
  3. Ved hjælp af en pipette, ekstrakt 5 ml blot celle medier ind i en anden 15 ml rør og sted i et opvarmet vandbad til opvarmning af løsningen til mikroskopi eksperimenter.
  4. I en bio-hood, pipette 30 pi 10x phosphatbuffered opløsning (PBS) ind i mikro centrifugerør. Tilsæt 6 pi 1 N natriumhydroxid (NaOH) i samme micro centrifugerør og vortex i 15 sekunder.
  5. Opnå collagen I rotte hale opløsning fra køleskabet og flytte til bio-hætte ved anvendelse af standard laboratorieteknikker og protokoller 29. Sørg for kollagen er stadig koldt. Pipette 168,3 pi collagen i samme micro centrifugerør.
  6. Dernæst tilsættes 18 pi gul-grønne fluorescerende carboxylat--modificerede mikrosfærer med en pipette til samme micro centrifugerør. Vortex micro centrifugerør med alle de løsninger til 30 sek.
  7. Tilføje 77,7 pi ønskede cellemedier-celle-blanding (ca. 2 x 10 6 celler / ml koncentration) til mikro centrifugerør og blandes under anvendelse pipettespids til 20 sek. Om nødvendigt ændre matrixdensiteten ved at følge den brugerdefinerede collagen blanding tilpasset til tilsætning af fluorescerende perler og cellelevedygtighed tabel (tabel 1).
  8. Pipette 300 & #181 l af kollagen-celle blanding ind til centrum godt (godt # 2) af den fremstillede støbeaggregatet. Anbring formen på en engangs petriskål og flytte det til en standard inkubator i 20 minutter ved 37 ° C med 5% CO2.
  9. Fjern systemet fra inkubatoren og sted tilbage i bio-hætte. Ved hjælp af pincet, fjernes både hydrofobe dækglas ved klemning på toppen af ​​hver dækglas og trække op og væk fra formen.
  10. Flytte hele systemet til det ønskede mikroskopi og image at sikre kollagen støbeformsider stadig lige at muliggøre en planar diffusion gradient.
  11. Med systemet stadig under mikroskop under anvendelse af en 100 pi enkelt-kanals pipette, tilsættes 100 pi celle medier i godt # 1. Næste, ved anvendelse af en 100 pi enkelt-kanals pipette tilsættes 100 pi celle medier med ønsket kemoattraktant koncentration i godt # 3.
  12. Umiddelbart efter tilsætning løsninger ind i begge brønde, påbegyndes billeddannelse.

4. Billedbehandling og DiffusionModeling

  1. Hvis man ønsker at finde diffusionskoefficienten for den specifikke kollagen tæthed til at beregne den specifikke koncentration, følg protokollen nedenfor:
    1. Følge den givne forskrift ovenfor titlen "Kollagen blandingens og 3D matrix," i stedet for at generere celle medier med ønsket kemoattraktant koncentration, gør 5 uM rhodamin i et 15 ml rør ved anvendelse af standard beregninger og protokoller 30.
    2. Billede 3D collagenmatricer med et konfokalt monteret på et omvendt mikroskop ved anvendelse af en argon laser (488 nm) for at fange fluorescens. Billede hver 2 eller 3 sek i op til 7 timer.
  2. For Diffusion Modeling: Ved hjælp af matematiske model er vist nedenfor, skrive en beregningsmæssige software kode til behandling og analyse af disse generelle trin.
    Ligning 1
    1. Importer billeder til beregningsmæssige software til rescaling og normalisere ved den maksimale Intenversitet. Konvertere billeder til en grå farve-kort over billedet for at vælge kanten. Pick en akse langs midten af ​​billedet, til højre for midten og til venstre for midten.
    2. Brug af beregningsmæssige programkode, plotte normaliserede intensitet, sammen med den sande intensitet og forskellen mellem de to.
    3. Næste, input de nødvendige til montering (koncentration, tid og længde) parametre.
    4. Plotte den normaliserede koncentration mod tiden og koncentrationen profil på tværs af x-aksen med et polynomium til dataene.
    5. Beregne koefficienten af ​​diffusion ved hjælp af den beregningsmæssige programkode.

5. Eksperimentelle Målinger

  1. Med henvisning tilbage til diffusionsligningen, omskrive ligningen til at finde den specifikke koncentration på ethvert sted i systemet, som vist i det følgende.
    Ligning 2
    Hvor:
    L = Længden af ​​the collagenmatrix
    x = placering under efterforskning
    D = koefficient for diffusion
    t = forløbet tid
  2. Under kemotaksi eksperimenter, sikre at registrere den bestemte tid, at det øjeblik kemokin blev tilsat til systemet. Når cellemigration bevægelse er fundet, sikre at registrere konfokal tidsforskudt optagelse, og bemærk bestemt tidspunkt og placering fra kanten, hvor billeddannelse opstod.
  3. Under dataanalyse, skal du sætte bemærkede forløbne tid, sted og koefficienten diffusion for den specifikke celle i ligningen for at finde den normaliserede specifikke koncentration på noget tidspunkt inden for kollagen til både diffusion og celle eksperimenter.

6. Sporing Cell Migration Utilizing TFM

  1. At spore celle migration ved hjælp TFM / DVC teknikker følge protokollen nedenfor:
    1. Efter tilsætningen af ​​ønskede kemoattraktant koncentration i godt # 3, start billeddannelse 3D collagenmatricer med et konfokalt monteret på en omvendt microscope at finde en celle for at undersøge.
    2. Når en bevægende cellen er fundet, placere cellen i midten af ​​synsfeltet og udnytte en piezoelektrisk motor (billedet i z-aksen), billede hver 1 eller 2 min.
    3. Til beregning celle force generation og deformation, generere en beregningsmæssige kode for at finde forskydningerne af fluorescens perler efter de TFM / DVC-protokoller 31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Evnen af ​​dette assay præcist at vurdere migrationen af ​​cellen er afhængig af en god opsætning af systemet. Derfor er det kritisk for Sørg for at designe diffusion systemet formen præcist og stor omhu i at placere både hydrofobe og hydrofile dækglas, som illustreret i figur 1. Hvis systemet er korrekt udformet og under diffusion modellering stadium sikrer at finde en meget god lineær startlinien, man er i stand til at opnå rart fluorescerer billeder, som vist i figur 2, til analyse diffusion af systemet.

Nøglen til en vellykket celle kemotaksi analyse modellere diffusion og løse den generelle diffusion ligning til at finde koefficienten af ​​diffusion og specifik koncentration ligning gennem en beregningsmæssige software genereret kode. Efter at importere billeder til beregningsmæssige software og kører analyse (figur 3), koefficienten af diffusionkan vurderes (tabel 2). Figur 4 viser afbildninger af diffusionen af rhodamin gennem de fem testede kollagen koncentrationer. Formerne af diffusionen plot matche den traditionelle form af en lineær diffusion model. Det kan ses, at diffusion af rhodamin er omvendt proportional med koncentrationen af ​​kollagen-jo lavere kollagendensitet jo hurtigere diffusion. Dette er forventeligt, da denne koncentration af collagen har en højere porøsitet. De vandrette linjer i collagen diffusion plot i en koncentration på 1,5 mg / ml (figur 4B) er simpelthen resultatet af overmætning af tracer-signalet. Endnu vigtigere er, som vist i figur 4 hver linje repræsenterer et specifikt punkt (x, y) inden i kollagen, til hvorimod tiden forøger den normaliserede koncentration aldrig overstiger det foregående punkt på samme tid (dt), hvilket indikerer ingen tilbageførsel af kemikaliet. Dette er en vigtig egenskab ved en chemotaxis kammer for at tillade direkte strøm af en chemoattractant uden tilbagestrømning.

Ved at undersøge de sidste ti billeder ved hvert x placering, man er i stand til at generere et plot af steady-state koncentration af rhodamin ved hver af stederne. Ved at ekstrapolere på tværs af hele prøven længde (figur 5), kan man se på hele prøven. Dette indikerer, at lineær diffusion gradient er konsistent på tværs af hele prøven længde, hvilket kan udnyttes til celle eksperimenter (figur 6).

Figur 1
Figur 1: En skematisk af plane gradient diffusion systemet støbeaggregatet i levende celler kammer (1) En computer gengivelse af det komplette system bestående af (fra bund til top) en nedre hus (c) en hydrofil 22 mm dækglas, støber,. top boliger, og et glas dækning. (2) dimensioner mo ld hvor (a) afskårne inserts er vist. (3) Mold med kollagen matrix med (b) hydrofobe dækglas på hver side gled ind i de afskårne indsatser for at skabe 3-godt-system. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Eksempel på rhodamin mikroskopi billeder i collagen Repræsentative billeder taget under rhodamin diffusionsforsøg, på samme z-aksen placering, i det plane gradient diffusion system med en 1,0 mg / ml collagen koncentration.. Målestok = 500 um, hvor (a) er 0 min (b) 3 min (c) 7 min, og (d) 15 min efter rhodamin blev tilsat til kammeret. Pilen angiver retningen af ​​diffusion af rhodamin gennem collagen matrix.e.com/files/ftp_upload/52948/52948fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Eksempel på analyse og sammenfatning af beregninger diffusion genereret af beregningsmæssige programkode med en 2,5 mg / ml collagen koncentration (A) Sort og hvid gengivelse af initial (dt = 0) billede uploadet til beregningsmæssige software til analyse. (B) Særlige punkter valgt af brugeren for intensitet sammenligning og diffusions beregninger (x, y-aksen er i pixels). (C) Diffusion profil rhodamin hele collagen matrix, hvor hver linje korrelerer med et rødt punkt i billedet B. (D) Koncentration profil rhodamin hele collagenmatrix ved steady-state. (E) Sammenligning mellem de udglattede data (blue dot) og sande data fra diffusion eksperiment (rød prik) med forskellen mellem glattet og sand (grøn prik). (F) Normalized koncentration af sand (rød prik) og monteret (grøn prik) data fra beregningsmæssige programkode hele forsøget. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:. Eksempel på diffusion profil gennem collagenmatrix hjælp af plane gradient diffusion system på forskellige punkter Hver linje angiver en anden udvalgte datapunkter udvalgt fra den beregningsmæssige programkode af brugeren. Collagenmatrix med en tæthed på (A) 1,0 mg / ml (B) 1,5 mg / ml (C) 2,0 mg / ml (D) 2,2 mg / ml og (E rong>) 2,5 mg / ml. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5:. Eksempel på en fusion (normaliseret) profil af rhodamin hele collagen matrix ved hjælp af plane gradient diffusion systemet ved steady-state Circles er specifikke datapunkter valgt selvom den beregningsmæssige programkode af brugeren. Rød linje konstrueret ved hjælp datapunkter og ekstrapolere bedste line-fit (med R2 værdi vist) for at vise rhodamin koncentration hele kollagen matrix. Collagenmatrix med en tæthed på (A) 1,0 mg / ml (B) 1,5 mg / ml (C) 2,0 mg / ml (D) 2,2 mg / ml og (E) 2,5 mg / ml.2948fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: Eksempel på celle migrationseksperimenter En Z-slice mikroskop billede af en neutrofil migrering i 3D plane gradientsystem.. Neutrofil migrerer mod kemoattraktant gradient (hvid pil viser retningen af ​​gradienten og trekanten viser koncentrationen profil), hvor stjernen angiver den indledende position af cellen ved starten af ​​forsøget. Udgaaende viser celle i 3D rummet, hvor pilen indikerer næste gang-punkt retning. Scale bar = 10 um. dt = 5 min mellem billeder (dvs. AB). Klik her for at se en større version af dette tal.

Collagen Cell Density PBS Fluorescerende kugler NaOH Kollagen I Rat Tail Medier
2,5 mg / ml 10% 6% 2% 70.20% 11,80%
2,2 mg / ml 10% 6% 2% 61.70% 20.30%
2,0 mg / ml 10% 6% 2% 56.10% 25.90%
1,5 mg / ml 10% 6% 2% 42.10% 39.90%
1,0 mg / ml 10% 6% 2% 28.10% 53.90%

Tabel 1: Tilpasset collagen blanding tilpasset til tilsætning af fluorescerende perler og cellelevedygtighed.

Koncentration af kollagen Gel Koefficient på Diffusion (cm2 / sek)
2,5 mg / ml 1,03 x 10 -6 ± 2,54 x 10 -7
2,2 mg / ml 1,28 x 10 -6 ± 3,53 x 10 -7
2,0 mg / ml 6,48 x 10 -6 ± 1,66 x 10 -7
1,5 mg / ml 1,05 x 10 -5 ± 2,04 x 10 -7
1,0 mg / ml 1,39 x 10 -5 ± 1,06 x 10 -7
Vand 1,50 x 10 -5

Tabel 2: Koefficienter af diffusion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De mest kritiske trin for succesfulde diffusionsforsøg med eller uden celler er: korrekt opsætning formen forsamlingsfriheden; at udvikle den nødvendige håndelag for at forhindre skader under udvinding af hydrofobe dækglas; sikre at finde en meget god lineær startlinjen til korrekt at beregne diffusionskoefficienten; korrigere eksperimentelle beregninger af både kollagen og kemoattraktant; korrekt brug af levende celler for at sikre matrix ikke tørre ud; og opretholde en steril, sund kultur.

Når der udføres diffusion eksperimenter, er det bydende nødvendigt at sørge for diffusion plots matche de traditionelle former en lineær diffusion model (figur 4).

Kørsel af analysen på flere forskellige x-steder på hver prøve, er det muligt at beregne de gennemsnitlige koefficienterne for diffusion for rhodamin i de forskellige koncentrationer af kollagener, som rapporteret i Ta ble-2. Disse resultater stemmer overens med tidligere forskning-koefficient på diffusion gennem kollagen gel aftager som koncentrationen af kollagen faldt skyldes en forøgelse af porøsitet i matrixen.

Ifølge diffusion modelligningen ved steady state, man forventer at have en lineær koncentrationsgradient profil på tværs af de x-værdier. Ved at tilpasse en lineær funktion til de punkter, kan man se, at de alle er i virkeligheden lineær. R2 værdi for montering af en lineær trend linie for hver af de bedst tilpassede linjer for de tre kollagen koncentrationerne var på eller over 0,92. Normer residualerne i alle ekstrapolerede parceller var 0,0227, hvilket indikerer en god pasform. Denne lineære forhold er i overensstemmelse med den analytiske løsning. Koncentrationen begynder ikke ved 100%, som ville forventes, fordi det billeddannende ikke begynder direkte ved kanten af ​​kollagen prøven. Det er også umuligt at perfekt kalibrere billeddannelse.

_content "> Derudover kunne vi referere andre papirer, der kiggede på diffusion i geler til at sammenligne resultater. Shenoy og Rosenblatt fundet diffusionskoefficienten BSA (radius = 4 nm) i en 30 mg / ml succinyleret kollagen løsning at være 2,2 x 10 -7 cm2 / sek 32. Radius af rhodamin er 0,78 nm, hvilket forklarer dets hurtigere diffusion tid gennem collagen 24. I diffusion undersøgelser, er det almindeligt at anvende radius for at sammenligne molekyler. som radius stiger, molekylvægten også stiger. Ramanujan et al. fandt diffusionskoefficienten af dextran (radius = 6 nm) i polymeriserede 20% kollagengeler (svarende til 2,0 mg / ml koncentration geler) at være 4,72 x 10 -8 cm2 / sek 24. Igen, Dette kan sammenlignes med diffusionskoefficienten vi observeret for 2,0 mg / ml gel-koncentration (D = 1,28 x 10 -6 cm2 / sek), hvis vi tager højde for molekylet størrelsesforskel. Leddy og Guilak studIED diffusion af dextraner gennem ledbrusken 33. Det er muligt at sammenligne diffusion gennem collagenmatricer og gennem ledbrusken fordi ca. to tredjedele af massen af ​​ledbrusk er polymert kollagen (overvejende type II). Leddy og Guilak fandt diffusionskoefficient 3 kDa dextran gennem ledbrusken at være mellem 6-10 x 10 -7 cm2 / sek 33. Vel vidende, at systemet fungerer korrekt vi kunne derefter beregne den specifikke koncentration overalt i systemet, ved hjælp sawtooth og forbigående systemet varmeoverføring modeller. Denne yderligere metrik kan bruges under celle eksperimenter for at spore celle-koncentration forståelse og gradienthældning.

Varigheden af ​​forsøg kan være en begrænsende faktor, når vores fremgangsmåde. Derfor er det vigtigt at bruge et dække for levende celler for at sikre matricen ikke tørrer ud. Ved hjælp af et dæksel under eksperimenterendets, vi var i stand til at overvåge udbredelsen af ​​rhodamin op til 7 timer og 4 timer i løbet af celle eksperimenter uden gel udtørring. Hvis man ikke bruger en dækning, kan gelen tørre op hurtigere og have stor indflydelse på udbredelsen og migration af celler.

Den heri beskrevne protokol anvender en velkontrolleret plane diffusionsmodellen / system for at kunne måle celle kræfter i et 3D miljø under kemotaxi. Her præsenteres en nyudviklet simpelt system, der kan udnyttes til TFM / DVC eksperimenter. Ved hjælp af dette system, vil forskerne kunne: 1) med succes model diffusion gennem 3D collagenmatricer og verificere, ved montering af data til analytiske udtryk, at den plane gradient diffusion system når podes med celler, bør fremme kemotaksi og ikke kemokinese; 2) beregne koefficienten diffusion for collagen af ​​fem forskellige koncentrationer; og 3) med held finde den specifikke koncentration af kemoattraktanten i diffusion kammer. Med denne nærmer, kan man yderligere at undersøge celle chemotaxis med specifikke målinger ikke nemt og let tilgængelige uden besværlige tilgange mangefacetterede systemer og komplekse diffusions stigninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Corp 182 SIL ELAST KIT .5KG a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 CMB for 18 mm round coverslips
22 mm Glass Coverslip Fisher Scientific NC0180281 Neuvitro Corp. cover slip 22 mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife X-Acto X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778-5ML
Glutaraldehyde Polysciences, Inc 00216A-10 Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube Fisher Scientific 14-432-22 Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass Petri dish Fisher Scientific 08-747A Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15 mm)
Forceps Fisher Scientific 22-327-379 Fine Point Forceps
Cover glasses Fisher Scientific 12-518-105A Rectangle; 30 x 22 mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl Gelest SIT8174.0
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane Sigma-Aldrich 296090 anhydrous, 95%
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool Lunzer PV-081-3 Straight extended tip scribe, .020" (.50 mm) diameter by .200" (5.0 mm) tip length
Vacuum grease Dow Corning 14-635-5C High-Vacuum Grease
15 ml tube Fisher Scientific 14-959-49D 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10x phosphate buffered solution Fisher Scientific BP399-500 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1 N sodium hydroxide Sigma-Aldrich 38215 Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail BD Biosciences 354236 Rat tail 
Micro centrifuge tube Fisher Scientific 02-681-332 Volume: 2.0 ml;
O.D. x L: 13 x 40 mm;
sterile; single-wrapped
Name Company Catalog Number Comments
Carboxylate-modified microspheres Invitrogen  F-8813 Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine Sigma-Aldrich 83689 Rhodamine B for fluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adzick, N. S. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. Ann Surg. 225, (2), 236 (1997).
  2. Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens. Cytokine Growth F. R. 8, (1), 11-20 (1997).
  3. Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420, (6917), 860-867 (2002).
  4. Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression. AIChE J. 57, (3), 778-792 (2011).
  5. Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer. Curr. Opin. Cell Biol. 24, (2), 284-291 (2012).
  6. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10, (7), 445-457 (2009).
  7. Cristini, V. Morphologic Instability and Cancer Invasion. Clin. Cancer Res. 11, (19), 6772-6779 (2005).
  8. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, (7191), 51-55 (2008).
  9. Parent, C. A., Devreotes, P. N. A cell's sense of direction. Science. 284, (5415), 765-770 (1999).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  11. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, (6), 1650-1656 (1975).
  12. Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. Generating controlled molecular gradients in 3D gels. Biotechnol. Bioeng. 91, (6), 754-759 (2005).
  13. Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. Growth factor-induced cell motility in tumor invasion. Acta Oncol. 41, (2), 124-130 (2002).
  14. Wilkinson, P. C. Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis. J. Immunol. Methods. 216, (1-2), 139-153 (1998).
  15. Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications. Biotechnol. Bioeng. 105, (5), 982-991 (2010).
  16. Noo, L. J., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, (8), 826-830 (2002).
  17. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, (21), 3118-3125 (2009).
  18. Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies. Biomed. Microdevices. 11, (4), 827-835 (2009).
  19. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat. Rev. Cancer. 3, (5), 362-374 (2003).
  20. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).
  21. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J. Cell Biol. 75, (2 Pt 1), 606-616 (1977).
  22. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell. Sci. 99, (Pt 4), 769-775 (1991).
  23. Gilbert, D. L. Macromolecular diffusion through collagen membranes. Int. J. Pharm. 47, (1-3), 79-88 (1988).
  24. Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys. J. 83, (3), 1650-1660 (2002).
  25. Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio. Biomaterials. 7, (4), 263-267 (1986).
  26. Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. dL. Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion. Biopolymers. 89, (2), 135-143 (2008).
  27. Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay. J. Immunol. Methods. 180, (2), 193-211 (1995).
  28. Sundd, P., et al. Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting. Microcirculation. 18, (5), 361-372 (2011).
  29. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), 2754 (2012).
  30. Stephenson, F. H. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. Elsevier Science. (2010).
  31. Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations. Exp. Mech. In press, (2014).
  32. Shenoy, V., Rosenblatt, J. Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes. Macromolecules. 28, (26), 8751-8758 (1995).
  33. Leddy, H., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Ann. Biomed. Eng. 31, (7), 753-760 (2003).
Planar Gradient Diffusion System til Undersøg Chemotaxis i en 3D kollaqenmatrix
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).More

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter