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Bioengineering

Planar Gradient Diffusionssystem, um Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix Untersuchen

doi: 10.3791/52948 Published: June 12, 2015

Introduction

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Die bevorzugte Bewegung von Zellen in Richtung eines Konzentrationsgefälles Chemotaxis bekannt, spielt eine wichtige Rolle bei pathologischen und physiologischen Prozessen im Körper. Solche Beispiele sind Haut- und Schleimhaut Wundheilung 1, 2 Morphogenese, Entzündungen 3, und das Tumorwachstum 4,5. Es wurde auch gezeigt, daß Krebszellen durch beide individuelle und kollektive Zellmigrationsstrategien 6 migrieren. Darüber hinaus können Diffusionsinstabilität Mechanismen die Trennung von einzelnen oder gruppierten Zellen aus einer Tumor Körper / Objekt zu induzieren und dann kann auf eine Quelle von Nährstoffen einzuwandern und so dringen größere Gebiete und Gewebe 7.

Ferner hat es sich gezeigt, dass die vielfältigen Migrationsmechanismen aktiv in 2D und 3D werden, wegen der unterschiedlichen Rollen von Adhäsionsmolekülen 8. Daher ist ein Umzug in physiologisch relevanten in-vitro-Tests an Zellbeweglichkeit in einem measureabl untersuchene und einfache Weise von Bedeutung für das Verständnis Zellbewegung Phänomene 9. Leider ist die Schwierigkeit bei der Analyse von Zellmigration, eine umfassende quantifizierbare Chemotaxis-Assay erfordert in der Regel eine lange mühsame Methode, auf der Messung der unparteiische Zellbeweglichkeit und Transportphänomene Modelle gegründet.

Vergangenen experimentellen Ansätzen, um die Zellchemotaxis zu untersuchen sind der Boyden-Kammer 10 und der unter Agarose-Assay 11. Doch innerhalb dieser frühen Tests, die Zellmigration Experimente nicht die Bewegung in Bezug auf die Zeit zu überwachen. Weitere, besonders wichtig, die Konzentrationsgradienten für die Experimente verwendet wurden, nicht gut definiert oder vollständig verstanden, während nur die Erhaltung der Signalisierung für nicht mehr als ein paar Stunden. Weiterhin frühen Chemokammer Versuche beschränkt Zellmigration auf zwei Dimensionen und nicht erlauben, die Kinetik der Migration 12 überwachen. Mit Blick auf die Boyden-Kammer, ein Endpunkt-Assaywürde nicht zulassen, dass der Forscher, um die Migration visuell zu beobachten und nicht direkt zu unterscheiden Chemotaxis (Bewegungsrichtung) von Chemokinese (Zufallsbewegung). Darüber hinaus mehrere Variablen-Unterschiede in der Porengröße und Dicke der Membranen verursachten die Kammer sehr schwierig, einfach zu reproduzieren und verdeckte die Wander Reaktion von Zellen auf Chemokine 13,14.

Mit dem neuen Verständnis der Mikrofluidik, haben neue Kammern und Mikrogeräten als Instrument untersucht worden, um Zellbewegung unter Zwischenströmungsbedingungen zu untersuchen oder Chemotaxis 15,16. Unter diesen neuen Geräten wurden neue Zell Metriken eingeführt und untersucht, wie die Wirkung von Scherspannung auf eine Zelle 17,18. Leider vergangenen und aktuellen mikrofluidischen Chemotaxiskammern begrenzt Untersuchungen von Zellmigration, um 2D-Substrate eine wichtige Rückschlag seit vielen biologischen Prozessen wie Tumorzellinvasion und Metastasierung, und imImmunzellmigration, beinhalten 3D-Migration.

Direkte Beobachtung Kammern, wo-a chemoattractant Lösung in Kontakt mit einer 3D-Gel enthaltenden Zellen wurden ebenfalls berichtet 19,20. Diese Kammern haben zwei Kammern, von denen eine Lockstoff und eine mit Zellen, die nebeneinander horizontal 21 oder als konzentrische Ringe 22 verbunden sind. Diese Systeme werden in die richtige Richtung, aber nicht über ein Chemotaxis-System zu halten für eine ausgedehnte Zeitperiode.

Darüber hinaus haben Forscher auch durch Kollagenmembranen in Dialysezellen sowie die Diffusion von Tracermolekülen durch Kollagenproben gegen hydrostatischen Druck unterworfen 23-25 ​​geprüft Leitfähigkeit. Einige Diffusionsexperimente in Kollagengelen beruhen auf physikalischen und chemischen Modifikationen des Gels mit Magnetfeldern und chemischer Einbau 26. Eine beliebte Methode zur Modellierung von Diffusionsvermögen in collaGenous Gewebe beruht auf der Fluoreszenzabbildung der kontinuierlichen Punkt Photobleichen. Dieses Verfahren wurde Anisotropie der Diffusionskoeffizienten von Makromolekülen in orientierten Kollagengewebe offenbart. Dennoch hat Photobleichens im Gelenkknorpel benutzt und nicht-Kollagen-Matrices. Zwar ähnlich, müssen die erforderlichen Modellversuche durch speziell Verständnis der Diffusionskoeffizient von Kollagengelen erfolgen. Noch wichtiger ist, die Systeme nicht ein Verfahren zur Messung Zellkrafterzeugung nutzen.

Leider sind die meisten Systeme scheinen auf ein oder zwei Schlüsselelemente für ein ideales System fehlen: das ermöglicht der Zelle Tracking, einem Diffusionsgefälle Verständnis mit einem chemotaktischen Faktor durch die Matrix, einem relativ einfachen Aufbau mit einer Leichtigkeit der Reproduzierbarkeit, der Minimierung von Zell-Zell-Wechselwirkungen, sowie die Fähigkeit, Dimensionseinheiten zur Quantifizierung (dh, die Geschwindigkeit, Kraft, spezifische Konzentrations) zu messen. Moghe et al. 27 ein System vorgeschlagen, das weitgehend die Anforderungen in der Zellen wurden zunächst im ganzen Gel dispergiert anstatt auf der Filteroberfläche konzentriert erfüllt, ist aber schwierig zu Kräften, die die Zelle erzeugt messen.

Zu diesem Zweck stellen wir eine planare Gradienten-Diffusionssystem zur Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix, die eine moderne Diffusionskammer Beschränkungen vorhandener Assays, die auf Zeitraffermikroskopie beruht, in Verbindung mit Bildanalysetechniken zu Zelle messen zu überwinden ermöglicht untersuchen Kräfte in einer 3D-Umgebung. Dieses Protokoll sieht eine einfache, aber innovative Art der Erstellung einer einfachen 3D-Diffusionskammer, die verwendet werden können, um 3D-Chemotaxis in verschiedenen Zellen zu untersuchen.

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Protocol

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1. 3D-Formenbau und Parts

  1. Schimmel
    1. Vor der Arbeit, eine Silikonelastomer-Kit, ein Live Cell Imaging Kammer, eine 22 mm Deckglas und einer bearbeiteten Aluminium-Metall-Würfel mit den Abmessungen 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Bereiten Sie das Live Cell Imaging Kammer zur Formung, indem das Deckglas in der unteren Halterung und Montage der Rest der Kammer, wie den Angaben des Herstellers.
    2. Als nächstes wird mit einer Pinzette, legen Sie die bearbeiteten Aluminium-Metall-Würfel in der Mitte des Live Cell Imaging Kammergehäuse und auf der Oberseite des Deckglases und dann beiseite stellen.
    3. Mischungssiliconelastomerlösungen gemäß dem Protokoll des Herstellers zu 5 ml Elastomer bilden.
    4. Mit einem Einweg-Labor Spatel, gießen Siliconelastomer-Lösung in Live Cell Imaging Kammer-Setup und stellen Sie sicher nicht platziert bearbeitetem Aluminium Metallwürfel bewegen. Stellen Sie die Anlage auf dem Labortisch, an einem sicheren Ort O / N für die Heilung.
    5. Am nächsten Morgen, dekonstruierendas Live Cell Imaging Kammer, wie vom Hersteller empfohlen wird, und ziehen Sie Form mit einer Pinzette. Mit einer Pinzette vorsichtig heraus das bearbeitete Aluminium-Metall-Würfel von Schimmel. Gehen Sie auf die Wanne und spülen Sie die Form mit VE-Wasser. Legen Sie die Form auf einem Papiertuch, um zu trocknen.
    6. Nach dem Trocknen mit einem Hobby-Messer, schneiden Schlitze durch die Form, Abstand 2,34 mm von jedem Längsende, in der Silikonform. Achten Sie darauf, die Form bleibt in einem sicheren und trockenen Ort, bis Sie bereit sind, um das System für ein Experiment zu konstruieren sind.
  2. Hydrophilen und hydrophoben Deckgläser Vorbereitung
    1. Damit der Kollagenmatrix zu einer Oberfläche haften, zu schaffen hydrophilen Deck:
      1. Unter Verwendung einer Einwegpipette, abmessen 150 ul 3-Aminopropyltrimethoxysilan und gießen Lösung in ein 50 ml Röhrchen. 30 ml 100% Ethanol auf die 50-ml-Röhrchen mit einem zweiten Einwegpipette und den Deckel schließen. Vortex die Lösung für 2 min, wodurch eine vollständige Durchmischung. Punsere Lösung in einer Glaspetrischale und beiseite stellen.
      2. Gießen Sie 15 ml 100% Ethanol in eine zweite Petrischale und beiseite stellen (stellen Sie sicher, um Gerichte zu markieren).
      3. Mit Hilfe einer neuen Einweg-Pipetten, abmessen 30 ml VE-Wasser und gießen Lösung in einen 50-ml-Tube. Als nächstes wird mit einer neuen Einweg-Pipetten Maßnahme aus 1.875 ul Glutaraldehyd und gießen Lösung in den gleichen 50-ml-Tube und den Deckel schließen. Vortex die Lösung für 2 min, wodurch eine vollständige Durchmischung. Die Mischung in Drittpetrischale, und beiseite stellen.
      4. Mit einer Pinzette, nehmen Sie eine 22 mm runden Deckglas und spülen Sie beide Seiten mit 100% Ethanol-Gemisch mit einer Einwegpipette.
      5. Platzieren gespült Deckglas in 3-aminopropyl-trimethoxysilan mit 30 ml 100% ige Ethanollösung Schüssel und zu ermöglichen, in Lösung 5 min stehen lassen.
      6. Mit einer Pinzette herausnehmen Deckglas und spülen wieder mit 100% Ethanol-Lösung mit Einwegpipette.
      7. Drop gespült Deckglas in 1875ul Glutaraldehyd und 30 ml entionisiertem Wasser-Gemisch und beiseite für 30 min eingestellt.
      8. Nach 30 Minuten, entfernen Sie Deckglas mit einer Pinzette und spülen mit VE-Wasser und legen Sie auf das trockene Gewebe O / N bei RT trocknen.
      9. Wiederholen Sie die Deckeintauchen und Bewegen für so viele Deckgläser als mit den gleichen erzeugten Lösungen benötigt.
    2. Machen hydrophoben Deckgläser durch das gegebene Protokoll.
      1. Gib 500 ul Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl wurden 100 ul Essigsäure und 19,4 ml Hexan in einem 50 ml-Röhrchen und Vortex für 2 min. Gießen Lösung in Glaspetrischale und beiseite stellen.
      2. Mit sauberen Pinzette, nehmen Sie ein Deckglas-and-Drop in die vorbereitete gemischte Lösung für 2 Minuten. Nach 2 Minuten vergangen sind, nehmen Sie Deckglas mit einer Pinzette und spülen mit VE-Wasser unter Verwendung einer Einwegpipette und Ort Deckglas auf das trockene Gewebe O / N bei RT trocknen. Shop Deckglas in Kunststoff-Petrischalen bis zur Verwendung.
      3. Wiederholen Sie die Deck dipping und Bewegen für so viele Deckgläser als mit den gleichen erzeugten Lösungen benötigt.

2. Mold Assembly

  1. Vor der Verwendung von Formen, mit einem Einweg-Pipetten spülen Sie die Form mit 90% Ethylalkohol in einem Behälter für Chemieabfälle. Als nächstes legen Sie die Form in einer Petrischale mit entionisiertem Wasser gefüllt und lassen Sie O / N sitzen.
  2. Nehmen Sie Form aus der Lösung mit einer Pinzette und auf einem Handtuch an der Luft trocknen, bevor Sie den Formaufbau.
  3. Während die Form Lufttrocknung, schneiden Sie die quadratische hydrophile Deckgläser in zwei Rechtecke etwas größer als 3,95 mm x 5,99 mm mit einem hochpräzisen Diamantritzwerkzeug. Schieben Sie die Schnitt Rechteck Deckglas in die in die Silikonform geschnitten Slots.
  4. Drehen Sie die Form auf den Kopf und gelten Vakuumfett auf dem Boden der Silikonform mit einer Einwegpipette. Als nächstes drehen Sie die Form wieder rechten Seite nach oben und drücken Sie den Boden der Form auf die kreisförmige hydrophile GlasabdeckungenLippe, um eine Dichtung zu schaffen.
  5. Mit Einweghandschuhe, nehmen Sie den zusammengesetzten Form und in einen Einweg-Petrischale und dann in eine Bio-Haube. Schalten Sie UV Bio-Haube-Lampe für 1 Stunde, um die Form zu sterilisieren, bevor Experimente auftritt.

3. Kollagen Mixture und 3D-Matrix

  1. Vor der Herstellung der Kollagenmischung, Färbung und Vorbereitung der Zellen zum Abbilden gemß Standardprotokollen 28.
  2. Verwendung von Standard-Labortechniken und Protokolle 29,30, in einem bio-Haube, mischen Zellmedien und chemische Lockstoffe in einer 15 ml Tube, um die gewünschte Konzentration chemoattractant. Pipette 5 ml spezifischer Zellmedien chemoattractant Konzentration Lösung in einen 15-ml-Röhrchen und bewegen Sie die Lösung in ein beheiztes Wasserbad.
  3. Mit einer Pipette extrahieren 5 ml nur Zellmedium in einen zweiten 15-ml-Tube und in ein erhitztes Wasserbad zum Aufheizen der Lösung für die Mikroskopie Experimente.
  4. In einem bio-Haube, Pipette 30 ul 10x Phosphatpuffered Lösung (PBS) in Mikrozentrifugenröhrchen. In 6 ul 1 N Natriumhydroxid (NaOH) in derselben Mikrozentrifugenröhrchen und Vortex für 15 Sekunden.
  5. Zu erhalten Kollagen I Rattenschwanz-Lösung aus dem Kühlschrank und zu bewegen, um die bio-Haube mit Standard-Labortechniken und Protokolle 29. Stellen Sie sicher, das Kollagen noch kalt ist. Pipettieren 168,3 ul Kollagen in derselben Mikrozentrifugenröhrchen.
  6. Als Nächstes fügen Sie 18 ul der gelb-grün fluoreszierende Carboxylat-modifizierte Mikrosphären mit einer Pipette auf die gleiche Mikrozentrifugenröhrchen. Wirbel das Mikrozentrifugenröhrchen mit allen Lösungen für 30 sec.
  7. In 77,7 ul der gewünschten Zellmedien-Zellgemisch (ca. 2 x 10 6 Zellen / ml-Konzentration) in Mikrozentrifugenröhrchen und mischen mit Pipettenspitze 20 Sek. Wie nötig, ändern Sie die Matrixdichte, indem Sie die benutzerdefinierte Collagen Mischung für den Zusatz von fluoreszierenden Kügelchen und die Lebensfähigkeit der Zellen Tabelle (Tabelle 1) angepasst.
  8. Pipette 300 & #181; l von Kollagen-Zellen-Mischung in der Mitte gut (gut # 2) des hergestellten Formanordnung. Legen Sie die Form auf einem Einweg-Petrischale und verschieben Sie sie in ein Standard-Inkubator für 20 min bei 37 ° C mit 5% CO 2.
  9. Entfernen System von Inkubator und legen wieder in bio-Haube. Mit einer Pinzette, entfernen Sie die beiden hydrophoben Deckgläser durch Klemmen auf der Oberseite jedes Deckglas und Ziehen nach oben und weg von der Form.
  10. Bewegen des gesamten Systems auf die gewünschte Mikroskopie und Bild sicherzustellen Kollagen Kokillenseiten noch direkt auf eine planare Diffusionsgradienten ermöglichen.
  11. Mit dem System immer noch unter dem Mikroskop, mit einem 100 & mgr; Einkanalpipette, fügen Sie 100 ul der Zellmedien in gut # 1. Dann wurde unter Verwendung eines 100 & mgr; Einkanalpipette fügen 100 ul Zellmedium mit den gewünschten chemoattractant Konzentration in gut # 3.
  12. Unmittelbar nach der Zugabe von Lösungen in beiden Brunnen, beginnen Bildgebung.

4. Imaging und DiffusionModellieren

  1. Wenn man die Diffusionskoeffizienten für die spezifische Kollagendichte, die spezifische Konzentration berechnen finden will, folgen Sie der unten Protokoll:
    1. Folgen Sie der oben angegebenen Protokoll mit dem Titel "Collagen Mixture und 3D-Matrix", anstatt Erzeugung Zellmedium mit den gewünschten chemoattractant Konzentration, machen 5 uM Rhodamin in einer 15-ml-Röhrchen mit Standard-Berechnungen und Protokolle 30.
    2. Bild der 3D-Kollagen-Matrices mit einem konfokalen System auf einem inversen Mikroskop unter Verwendung eines Argon-Laser (488 nm), um die Fluoreszenz zu erfassen montiert. Bild alle 2 oder 3 sec für bis zu 7 Std.
  2. Für Diffusion Modeling: Mit Hilfe der unten mathematisches Modell, einen Rechensoftwarecode für die Verarbeitung und Analyse mit diesen allgemeinen Schritten.
    Gleichung 1
    1. Import von Bildern in Computersoftware für Skalierung und Normalisierung durch die maximale intensity. Konvertieren von Bildern in einer grauen Farbe-Karte des Bildes, um die Kante zu wählen. Pick eine Achse entlang der Mitte des Bildes, auf der rechten Seite der Mitte und links von der Mitte.
    2. Verwendung der Rechensoftware Code plotten die normalisierte Intensität zusammen mit der wahre Intensität und der Unterschied zwischen den beiden.
    3. Danach geben die Parameter für die Montage (Konzentration, Zeit und Länge) notwendig.
    4. Plotten der normierten Konzentration gegen die Zeit und das Konzentrationsprofil in der x-Achse mit einem Polynom-Anpassung an die Daten.
    5. Berechnen der Diffusionskoeffizient mit Hilfe der Rechensoftwarecode.

5. Experimentelle Messungen

  1. Rückbezug auf die Diffusionsgleichung, schreiben die Gleichung, um die spezifische Konzentration an jedem Ort innerhalb des Systems zu finden, wie in unten gezeigt.
    Gleichung 2
    Wo:
    L = Länge der the Kollagenmatrix
    x = Lage in Untersuchung
    D = Diffusionskoeffizient
    t = verstrichene Zeit,
  2. Während Chemo Experimenten sicherzustellen, um die spezifische Zeit, die das Moment Chemokin wurde System hinzugefügt aufzuzeichnen. Sobald die Zellmigration Bewegung gefunden wird, um sicherzustellen, konfokale Zeitrafferaufnahme aufzeichnen, und beachten Sie den genauen Zeitpunkt und Ort vom Rand, wo Bildgebung aufgetreten.
  3. Bei der Datenanalyse, schließen die erwähnte abgelaufene Zeit, Standort und der Diffusionskoeffizient für die spezifische Zelle, in der Gleichung auf die normierte spezifische Konzentration an jedem Punkt innerhalb der Kollagen sowohl Diffusion und Zellexperimenten gefunden.

6. Tracking-Zellmigration Verwendung TFM

  1. Zu verfolgen, die Zellmigration mit TFM / DVC-Techniken folgen dem Protokoll im Handumdrehen:
    1. Nach Zugabe der gewünschten Konzentration chemoattractant in Vertiefung 3, Start Abbilden der 3D-Kollagen-Matrices mit einem konfokalen System auf einem invertierten MICR montiertenOscope zu finden, um eine Zelle zu untersuchen.
    2. Sobald eine Bewegung Zelle gefunden wird, setzen Sie die Zelle, in der Mitte des Sichtfeld und nutzen eine piezoelektrische Motor (für Bild in der z-Achse), Bild alle 1 oder 2 min.
    3. Für die Berechnung Zellkrafterzeugung und Verformung, erzeugen eine Rechencode, um die Verschiebungen der Fluoreszenz Perlen nach den TFM / DVC-Protokolle 31 zu finden.

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Representative Results

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Die Fähigkeit des Assays, genau zu beurteilen die Migration der Zellen beruht auf einem guten Aufbau des Systems. Daher ist es wichtig für Sie sicher, dass die Diffusion System Form genau entwerfen und große Sorgfalt bei der Platzierung sowohl hydrophobe und hydrophile Deckgläsern, wie in Abbildung 1 veranschaulicht. Wenn das System ordnungsgemäß entworfen und während des Diffusionsmodellierungsstufe gewährleistet eine sehr finden gute lineare Startlinie, ist man in der Lage schön zu erreichen fluoresziert Bilder, wie in Abbildung 2 dargestellt, zur Analyse von Diffusion des Systems.

Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Zellchemotaxis-Analyse wird die Modellierung der Diffusion und die Lösung des allgemeinen Diffusionsgleichung, um den Diffusionskoeffizienten und spezifische Konzentrationsgleichung durch eine Rechensoftware generierten Code zu finden. Nach dem Import der Bilder in Rechensoftware und Laufanalyse (Abbildung 3), der Diffusionskoeffizientbeurteilt werden kann (Tabelle 2). 4 zeigt die Kurven der Diffusion von Rhodamin in den fünf getesteten Kollagenkonzentrationen. Die Formen des Diffusions Grundstück passen die traditionelle Form eines linearen Diffusionsmodell. Es kann gesehen werden, dass die Diffusion von Rhodamin ist umgekehrt proportional zur Konzentration des kollagen unteren die Kollagendichte je schneller die Diffusion. Dies ist zu erwarten, da diese Konzentration von Kollagen eine höhere Porosität. Die horizontalen Linien in der Kollagendiffusions Plot bei einer Konzentration von 1,5 mg / ml (4B) sind einfach das Ergebnis einer über die Sättigung des Tracersignals. Noch wichtiger ist, wie in Figur 4 gezeigt, repräsentiert jede Zeile einen bestimmten Punkt (x, y) innerhalb des Kollagens, um wohin Zeit steigt die normierte Konzentration nie den vorherigen Punkt zur gleichen Zeit (dt) überschreitet, was keine Umkehr der chemischen. Dies ist eine wichtige Eigenschaft eines chemotaxis Kammer direkte Strömung eines chemoattractant ohne Rückströmung zu ermöglichen.

Durch Prüfen der vergangenen zehn Bilder an jedem x-Position, ist eine Lage, eine Aufzeichnung der stationären Konzentration von Rhodamin an jedem der Orte zu erzeugen. Durch Extrapolation über die gesamte Probenlänge (Abbildung 5), kann man an der gesamten Probe zu suchen. Dies zeigt an, dass die lineare Diffusionsgradienten konsistent über die gesamte Länge der Probe, die für die Zellexperimenten (Abbildung 6) genutzt werden kann.

Abbildung 1
Abbildung 1: Eine schematische planare Gradienten Diffusionssystem Formanordnung im Live Cell Imaging Kammer (1) Ein Computer-Wiedergabe des Gesamtsystems, bestehend aus (von unten nach oben) eine untere Gehäuse (c) einem hydrophilen 22 mm Deckglas, Schimmel. Tischgehäuse und einem Glasdeckel. (2) Abmessungen des mo ld, wobei (a) geschnitten Inserts werden gezeigt. (3) Form mit Kollagenmatrix mit (b) hydrophobe Deckgläser auf jeder Seite in den Schnitt-Einsätze, um die 3-Loch-System zu schaffen geschoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Beispiel Rhodamin Mikroskopieaufnahmen in Kollagen Repräsentative Bildern während Rhodamin Diffusionsexperimente genommen auf gleicher Z-Achsen-Position, in der ebenen Gefälle Diffusionssystem mit einer 1,0 mg / ml Kollagenkonzentration.. Maßstabsbalken = 500 & mgr; m, wobei (a) 0 min (b) 3 min (c) 7 min, und (d) 15 min nach Rhodamin wurde zur Kammer zugegeben. Pfeil zeigt die Richtung der Diffusion von Rhodamin durch die Kollagenmatrix.e.com/files/ftp_upload/52948/52948fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abb. 3: Beispiel der Analyse und Zusammenfassung von Rechen Software-Code mit einer 2,5 mg / ml Kollagenkonzentration erzeugt Diffusionsberechnungen (A) Schwarz-Weiß-Wiedergabe der ursprünglichen (dt = 0), Bild in Computersoftware zur Analyse hochgeladen. (B) Spezifische Punkte durch den Benutzer für Intensitätsvergleich und Diffusionsberechnungen ausgewählt (x, y-Achse sind in Pixel). (C) Diffusionsprofil von Rhodamin ganzen Kollagenmatrix in der jede Zeile korreliert mit einem roten Punkt im Bild B (D) Konzentrationsprofil von Rhodamin ganzen Kollagenmatrix im Gleichgewichtszustand. (E) Der Vergleich zwischen den geglätteten Daten (blue dot) und wahre Daten aus Diffusionsexperiment (roter Punkt) mit Differenz zwischen geglättet und true (grüner Punkt). (F) Normierte Konzentration von true (roter Punkt) und ausgestattet (grüner Punkt) Daten von Computersoftwarecode während des Experiments. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Fig. 4: Beispiel einer Diffusionsprofil durch Kollagenmatrix mit der ebenen Gefälle Diffusionssystem an verschiedenen Punkten Jede Linie zeigt eine unterschiedliche ausgewählte Datenpunkte, die aus der Rechensoftwarecode durch den Benutzer. Kollagen-Matrix mit einer Dichte von (A) 1,0 mg / ml (B) 1,5 mg / ml (C) 2,0 mg / ml (D) 2,2 mg / ml und (E rong>) 2,5 mg / ml. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Fig. 5: Beispiel einer Konzentration (normalisiert) -Profil von Rhodamin ganzen Kollagenmatrix mit der ebenen Gefälle Ausstrahlungssystems im stationären Zustand Kreise sind bestimmte Datenpunkte aus, obwohl der Rechensoftwarecode durch den Benutzer ausgewählt. Rote Linie, die unter Verwendung Datenpunkte und Extrapolieren besten Line-Passform (mit R 2 gezeigte Wert) Rhodamin-Konzentration in der gesamten Kollagenmatrix zeigen. Kollagen-Matrix mit einer Dichte von (A) 1,0 mg / ml (B) 1,5 mg / ml (C) 2,0 mg / ml (D) 2,2 mg / ml, und (E) 2,5 mg / ml.2948fig5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6: Beispiel der Zellmigration Experimente A Z-Scheibe-Aufnahme einer Neutrophilen-Migration in der 3D-planar Gradientensystem.. Neutrophil wandert zur chemoattractant Gradienten (weißer Pfeil zeigt Richtung Gradienten und das Dreieck zeigt seine Konzentrationsprofil), wobei der Stern zeigt die Anfangsposition der Zelle zu Beginn des Experiments. Teilbild zeigt Zelle im 3D-Raum, in dem Pfeil zeigt nächsten Punktrichtung. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. dt = 5 min zwischen den Bildern (dh AB). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Collagen Zelldichte PBS Fluoreszierende Kügelchen NaOH Collagen I Rat Tail Medien
2,5 mg / ml 10% 6% 2% 70.20% 11.80%
2,2 mg / ml 10% 6% 2% 61.70% 20.30%
2,0 mg / ml 10% 6% 2% 56.10% 25.90%
1,5 mg / ml 10% 6% 2% 42.10% 39.90%
1,0 mg / ml 10% 6% 2% 28.10% 53.90%

Tabelle 1: Benutzerdefinierte collagen Mischung für die Zugabe von fluoreszierenden Perlen und die Lebensfähigkeit der Zellen angepasst.

Konzentration von Kollagengel Diffusionskoeffizient (cm 2 / sec)
2,5 mg / ml 1,03 x 10 -6 ± 2,54 x 10 -7
2,2 mg / ml 1,28 x 10 -6 ± 3,53 x 10 -7
2,0 mg / ml 6,48 x 10 -6 ± 1,66 x 10 -7
1,5 mg / ml 1,05 x 10 -5 ± 2,04 x 10 -7
1,0 mg / ml 1,39 x 10 -5 ± 1,06 x 10 -7
Wasser 1,50 x 10 -5

Tabelle 2: Koeffizienten der Diffusion.

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Discussion

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Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Diffusionsexperimente mit oder ohne Zellen sind: richtig Einrichten der Formanordnung; Entwicklung der notwendigen Fingerfertigkeit, um bei der Extraktion von hydrophoben Deckschäden zu vermeiden; gewährleisten eine sehr gute lineare Startlinie, um den Diffusionskoeffizienten korrekt berechnen zu finden; korrigieren experimentelle Berechnungen von sowohl Kollagen und chemische Lockstoffe; von Live Cell Imaging System, um sicherzustellen, Matrix trocknet nicht aus richtig zu verwenden; und die Aufrechterhaltung einer sterilen, gesunde Kultur.

Bei der Durchführung von Diffusionsexperimente, ist es unerlässlich, um sicherzustellen, dass die Diffusionsgrundstücke entsprechen den traditionellen Formen eines linearen Diffusionsmodell (Abbildung 4).

Ausführen der Analyse an verschiedenen x-Stellen auf jeder Probe ist es möglich, die durchschnittliche Diffusionskoeffizienten für Rhodamin in den verschiedenen Konzentrationen von Kollagenen zu berechnen, wie in Ta gemeldet ble 2. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Forschungs-Diffusionskoeffizienten durch die Kollagengel abnimmt, wenn die Konzentration von Kollagen vermindert aufgrund einer Erhöhung der Porosität in der Matrix.

Nach dem Diffusionsmodellgleichung in einem stabilen Zustand, erwartet man, um eine lineare Konzentrationsprofil für die x-Werte. Durch Anpassen einer linearen Funktion, die den Punkten kann man sehen, daß sie alle tatsächlich linear. Der R 2 -Wert von Einbau eines linearen Trendlinie für jede der Best-Fit-Linien der drei Kollagen-Konzentrationen waren bei oder über 0,92. Die Normen der Residuen in allen extrapolierten Grundstücke waren 0,0227, was auf eine gute Passform. Diese lineare Beziehung ist in Übereinstimmung mit der analytischen Lösung. Die Konzentration nicht zu 100% zu beginnen, wie zu erwarten wäre, da die bildgebende nicht direkt am Rand des Kollagenprobe beginnen. Es ist auch nicht möglich, die Abbildungs ​​perfekt kalibrieren.

_content "> Darüber hinaus konnten wir die anderen Papiere, die bei Diffusions sah in Gelen die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu verweisen. Shenoy und Rosenblatt fand den Diffusionskoeffizienten von BSA (Radius = 4 nm) in einer 30 mg / ml succinylierte Kollagenlösung auf 2,2 x sein 10 -7 cm 2 / s 32. Der Radius Rhodamin beträgt 0,78 nm, was seiner schnelleren Diffusionszeit durch Kollagen 24 erklärt. In Diffusionsuntersuchungen, ist es üblich, den Radius, um Moleküle zu vergleichen zu verwenden. Wenn der Radius zunimmt, das Molekulargewicht ebenfalls an. Ramanujans et al. gefunden, den Diffusionskoeffizienten von Dextran (Radius = 6 nm) in polymerisierter 20% Kollagen-Gelen (Äquivalent von 2,0 mg / ml Konzentration Gele) auf 4,72 x 10 -8 cm 2 / s 24 dar. Auch Dies ist vergleichbar mit dem Diffusionskoeffizienten, die wir für die 2,0 mg / ml Konzentration Gel beobachtet (D = 1,28 x 10 -6 cm 2 / sec), wenn wir berücksichtigen die Molekülgröße Unterschied. Leddy und Guilak Gestütied die Diffusion von Dextranen durch Gelenkknorpel 33. Es ist möglich, die Diffusion durch Kollagenmatrices und durch Gelenkknorpel zu vergleichen, da etwa zwei Drittel der Masse des Gelenkknorpels polymeren Kollagen (überwiegend Typ II). Leddy und Guilak gefunden des Diffusionskoeffizienten von 3 kDa Dextran durch Gelenkknorpel zwischen 6-10 x 10 -7 cm 2 / s 33 ist. Zu wissen, dass das System einwandfrei funktioniert waren wir dann in der Lage, um die spezifische Konzentration überall innerhalb des Systems zu berechnen, mit Sägezahn und transienten Wärmeübertragungssystem-Modelle. Diese zusätzliche Metrik kann während der Zellexperimente verwendet werden, um Zellkonzentration Verständnis und Gradientensteigung verfolgen.

Zeitdauer der Experimente kann ein limitierender Faktor bei der Verwendung unserer Ansatz. Daher ist es wichtig, eine Abdeckung für das Live Cell Imaging System zu verwenden, um die Matrix zu gewährleisten trocknet nicht aus. Mit einem Deckel während experiments, konnten wir erfolgreich die Diffusion von Rhodamin bis zu 7 Stunden und 4 Stunden während der Zellexperimente ohne Gel Versiegen zu überwachen. Wenn man nicht mit einem Deckel, könnte das Gel trocknet schneller und die Diffusion und Wanderung von Zellen signifikant beeinflussen.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet eine gut kontrollierte planare Diffusionsmodell / System in der Lage, Zellen Kräfte in einer 3D-Umgebung während der Chemotaxis zu messen. Hier präsentieren wir Ihnen ein neu entwickeltes einfaches System, für TFM / DVC Experimente genutzt werden können. Mit diesem System werden die Forscher in der Lage zu sein: 1) erfolgreich Modell Diffusion durch 3D-Kollagen-Matrices und überprüfen, durch Anpassen der Daten an analytischen Ausdruck, dass die planare Gradienten Diffusionssystem, wenn es mit Zellen beimpft, sollte die Chemotaxis und nicht Chemokinese zu fördern; 2) die Berechnung der Diffusionskoeffizienten für Kollagen von fünf verschiedenen Konzentrationen; und 3) die spezifische Konzentration des chemoattraktive im di erfolgreich findenffusion Kammer. Damit nähert, kann man weiter zu prüfen Zellchemotaxis mit spezifischen Metriken nicht einfach und leicht zugänglich, ohne den mühsamen Ansätze der vielfältigen Systeme und komplexe Diffusionsgradienten.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Corp 182 SIL ELAST KIT .5KG a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 CMB for 18 mm round coverslips
22 mm Glass Coverslip Fisher Scientific NC0180281 Neuvitro Corp. cover slip 22 mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife X-Acto X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778-5ML
Glutaraldehyde Polysciences, Inc 00216A-10 Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube Fisher Scientific 14-432-22 Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass Petri dish Fisher Scientific 08-747A Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15 mm)
Forceps Fisher Scientific 22-327-379 Fine Point Forceps
Cover glasses Fisher Scientific 12-518-105A Rectangle; 30 x 22 mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl Gelest SIT8174.0
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane Sigma-Aldrich 296090 anhydrous, 95%
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool Lunzer PV-081-3 Straight extended tip scribe, .020" (.50 mm) diameter by .200" (5.0 mm) tip length
Vacuum grease Dow Corning 14-635-5C High-Vacuum Grease
15 ml tube Fisher Scientific 14-959-49D 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10x phosphate buffered solution Fisher Scientific BP399-500 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1 N sodium hydroxide Sigma-Aldrich 38215 Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail BD Biosciences 354236 Rat tail 
Micro centrifuge tube Fisher Scientific 02-681-332 Volume: 2.0 ml;
O.D. x L: 13 x 40 mm;
sterile; single-wrapped
Name Company Catalog Number Comments
Carboxylate-modified microspheres Invitrogen  F-8813 Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine Sigma-Aldrich 83689 Rhodamine B for fluorescence

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References

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Planar Gradient Diffusionssystem, um Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix Untersuchen
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Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).More

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).

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