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Bioengineering

प्लानर ढाल प्रसार प्रणाली एक 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में कीमोटैक्सिस जांच

doi: 10.3791/52948 Published: June 12, 2015

Introduction

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कीमोटैक्सिस के रूप में जाना एक एकाग्रता ढाल की दिशा में कोशिकाओं के वरीय आंदोलन, शरीर में रोग और शारीरिक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस तरह के उदाहरण त्वचा और म्यूकोसा घाव भरने 1, morphogenesis 2, सूजन 3, और ट्यूमर के विकास 4,5 हैं। यह भी कैंसर की कोशिकाओं को दोनों व्यक्तिगत और सामूहिक सेल प्रवास रणनीतियों 6 के माध्यम से विस्थापित कर सकते हैं कि दिखाया गया है। इसके अलावा, diffusional अस्थिरता तंत्र पोषक तत्वों का स्रोत की ओर से आप्रवासन और इस प्रकार व्यापक क्षेत्रों और ऊतकों 7 आक्रमण कर सकते हैं तो एक tumorous शरीर / वस्तु से एक या क्लस्टर कोशिकाओं के विभाजन के लिए प्रेरित कर सकते हैं।

इसके अलावा, यह विविध प्रवास तंत्र की वजह से आसंजन अणुओं 8 के विभिन्न भूमिकाओं के लिए, 2 डी में और 3 डी में सक्रिय हो सकता है कि दिखाया गया है। इसलिए, इन विट्रो assays में physiologically प्रासंगिक के लिए एक कदम एक measureabl में सेल गतिशीलता की जांच के लिएई और सरल तरीका सेल आंदोलन घटना 9 को समझने में महत्व का है। दुर्भाग्य से, सेल प्रवास का विश्लेषण करने में कठिनाई है, एक व्यापक मात्रात्मक कीमोटैक्सिस परख आमतौर पर निष्पक्ष सेल गतिशीलता और परिवहन घटना मॉडलों की माप पर स्थापित एक लंबे श्रमसाध्य विधि की आवश्यकता है।

सेल कीमोटैक्सिस जांच करने के लिए विगत प्रयोगात्मक दृष्टिकोण Boyden कक्ष 10 और तहत agarose परख 11 में शामिल हैं। हालांकि, इन जल्दी assays के भीतर, सेल प्रवास के प्रयोगों के समय के संबंध में आंदोलन की निगरानी नहीं की थी। अधिक महत्वपूर्ण बात, प्रयोगों के लिए इस्तेमाल एकाग्रता ढ़ाल अच्छी तरह से परिभाषित नहीं किया गया है या केवल कुछ ही घंटे से अधिक नहीं के लिए संकेत बनाए रखना है, जबकि पूरी तरह से समझ में आया। इसके अलावा, जल्दी कीमोटैक्सिस चैम्बर के प्रयास के दो आयामों को सेल प्रवास प्रतिबंधित है और एक प्रवास 12 के कैनेटीक्स नजर रखने के लिए अनुमति नहीं दी। Boyden कक्ष को देखते हुए, एक समापन बिंदु परखशोधकर्ता नेत्रहीन प्रवास का निरीक्षण करने की अनुमति नहीं होगी और सीधे chemokinesis (यादृच्छिक आंदोलन) से कीमोटैक्सिस (दिशात्मक आंदोलन) को अलग नहीं कर सका। इसके अतिरिक्त, के ध्यान में लीन होना आकार और मोटाई में कई चर-मतभेद आसानी से पुन: पेश करने के लिए बहुत मुश्किल चैम्बर झिल्ली कर दिया है, और chemokines 13,14 कोशिकाओं के प्रवासी प्रतिक्रिया छुपाया।

Microfluidics की नई समझ के साथ, नए कक्षों और सूक्ष्म उपकरणों मध्य प्रवाह शर्तों के तहत सेल हरकत की जांच के लिए एक साधन के रूप में जांच या 15,16 कीमोटैक्सिस किया गया है। इन नए उपकरणों के अंतर्गत, नया सेल मेट्रिक्स शुरू किए गए थे और एक सेल 17,18 पर कतरनी तनाव के प्रभाव की तरह, की जांच की। दुर्भाग्य से, अतीत और वर्तमान microfluidic कीमोटैक्सिस कक्षों ट्यूमर सेल आक्रमण और मेटास्टेसिस, और im सहित कई जैविक प्रक्रियाओं, के बाद से 2 डी substrates के एक महत्वपूर्ण झटका करने के लिए सेल प्रवास के अध्ययन के लिए सीमितmune सेल प्रवास, 3 डी प्रवास शामिल है।

प्रत्यक्ष अवलोकन कक्षों-जहां एक chemoattractant समाधान कोशिकाओं से युक्त एक 3 डी जेल के साथ संपर्क में है भी भी 19,20 सूचना दी गई है। इन कक्षों क्षैतिज एक दूसरे के बगल में 21 या गाढ़ा छल्ले के रूप में 22 में शामिल हो गए हैं, दो डिब्बों, एक chemoattractant युक्त एक और कोशिकाओं से युक्त एक है। इन प्रणालियों को सही दिशा में इशारा कर रहे हैं, लेकिन समय की एक विस्तारित अवधि के लिए एक कीमोटैक्सिस प्रणाली नहीं रखते।

इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने यह भी डायलिसिस कोशिकाओं, साथ ही हीड्रास्टाटिक दबाव 23-25 ​​के अधीन कोलेजन नमूने के माध्यम से दरियाफ्त अणुओं के प्रसार में कोलेजन झिल्ली के माध्यम से diffusivity की जांच की है। कोलेजन जैल में कुछ प्रसार प्रयोगों के चुंबकीय क्षेत्र और रासायनिक निगमन 26 का उपयोग कर जेल की भौतिक और रासायनिक संशोधनों पर भरोसा करते हैं। Colla में diffusivity मॉडलिंग के लिए एक लोकप्रिय तरीकाgenous ऊतकों निरंतर बिंदु photobleaching के प्रतिदीप्ति इमेजिंग पर निर्भर करता है। इस विधि उन्मुख मज्जा ऊतकों में बड़े अणुओं का प्रसार गुणांक में anisotropy पता चला है। फिर भी, photobleaching से जोड़ कार्टिलेज में प्रयोग किया जाता है और न मेट्रिसेस कोलेजन किया गया है। इसी तरह एक ओर जहां आवश्यक हो, मॉडलिंग प्रयोगों के लिए विशेष रूप से कोलेजन जैल के प्रसार गुणांक को समझने के माध्यम से किया जाना चाहिए। इससे भी महत्वपूर्ण बात, सिस्टम सेल बल पीढ़ी को मापने के लिए एक विधि का उपयोग नहीं करते।

दुर्भाग्य से, सबसे प्रणालियों एक आदर्श व्यवस्था के लिए एक या दो प्रमुख तत्व गायब होने लगते हैं: सेल ट्रैकिंग, मैट्रिक्स, reproducibility के एक आसानी से एक अपेक्षाकृत सरल सेट अप, के न्यूनतम के माध्यम से एक chemotactic कारक के साथ एक प्रसार ढाल समझ की इजाजत दी बातचीत सेल सेल, और आयामी मात्रा का ठहराव के लिए इकाइयों (यानी, वेग, बल, विशिष्ट एकाग्रता) को मापने की क्षमता। मोघे एट अल। 27 कोशिकाओं शुरू जेल भर में बिखरे बजाय फिल्टर सतह पर ध्यान केंद्रित किया गया है जिसमें इन आवश्यकताओं के सबसे को पूरा एक प्रणाली है कि प्रस्तावित है, लेकिन सेल उत्पन्न करता है कि सेना को मापने के लिए मुश्किल था।

इस प्रयोजन के लिए, हम एक सेल को मापने के लिए छवि विश्लेषण तकनीक के साथ युग्मित समय चूक माइक्रोस्कोपी पर आधारित है, जो मौजूदा assays, के आधुनिक प्रसार कक्ष सीमाओं को पार करने की अनुमति देता है जो एक 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में कीमोटैक्सिस की जांच के लिए एक planar ढाल प्रसार प्रणाली पेश एक 3 डी वातावरण में सेना। इस प्रोटोकॉल के विभिन्न कक्षों में 3 डी कीमोटैक्सिस जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक साधारण 3 डी प्रसार कक्ष बनाने का एक सरल, अभी तक अभिनव तरीका प्रदान करता है।

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Protocol

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1. 3 डी मोल्ड डिजाइन और पार्ट्स

  1. ढालना
    1. काम करने से पहले, एक सिलिकॉन elastomer किट, एक जीवित कोशिका इमेजिंग कक्ष, एक 22 मिमी कांच coverslip, और आयाम 10.07 मिमी x 3.95 मिमी x 5.99 मिमी के साथ एक machined एल्यूमीनियम धातु घन प्राप्त करते हैं। नीचे धारक में coverslip रखने और विक्रेता द्वारा निर्देशित के रूप में चैंबर के बाकी कोडांतरण द्वारा ढलाई के लिए जीना सेल इमेजिंग कक्ष तैयार करें।
    2. इसके बाद, संदंश का उपयोग, जीना सेल इमेजिंग कक्ष आवास के बीच में और coverslip के शीर्ष पर machined एल्यूमीनियम धातु घन जगह है, और फिर अलग निर्धारित करें।
    3. Elastomer के 5 मिलीलीटर बनाने के लिए निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार सिलिकॉन elastomer समाधान मिलाएं।
    4. एक डिस्पोजेबल प्रयोगशाला रंग का उपयोग करना, जीना सेल इमेजिंग कक्ष सेटअप में सिलिकॉन elastomer समाधान डालना और रखा machined एल्यूमीनियम धातु घन स्थानांतरित करने के लिए नहीं किया जाता है। इलाज के लिए एक सुरक्षित स्थान हे / एन में, प्रयोगशाला बेंच पर व्यवस्था रखें।
    5. अगली सुबह, deconstructलाइव सेल इमेजिंग कक्ष, निर्माता से सिफारिश की और के रूप में संदंश का उपयोग मोल्ड बाहर खींच। संदंश का प्रयोग, ध्यान मोल्ड से machined एल्यूमीनियम धातु घन निकाल सकते हैं। सिंक करने के लिए जाओ और विआयनीकृत पानी के साथ मोल्ड कुल्ला। सूखे के लिए एक कागज तौलिया पर मोल्ड रखें।
    6. एक बार सूखा, एक शौक उपयोगिता चाकू का उपयोग कर, मोल्ड के माध्यम से slits के कटौती सिलिकॉन मोल्ड के अंदर, प्रत्येक अनुदैर्ध्य अंत से 2.34 मिमी के अलावा दूरी। आप एक प्रयोग के लिए इस प्रणाली का निर्माण करने के लिए तैयार कर रहे हैं जब तक एक सुरक्षित और सूखी जगह में ढालना रहता है सुनिश्चित करें।
  2. हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक कांच coverslips तैयारी
    1. कोलेजन मैट्रिक्स, एक सतह का पालन हाइड्रोफिलिक coverslips बनाने के लिए अनुमति के लिए:
      1. एक डिस्पोजेबल विंदुक का प्रयोग, 3-aminopropyl-trimethoxysilane के 150 μl बाहर मापने के लिए और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में समाधान डालना। एक दूसरे डिस्पोजेबल विंदुक के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब के लिए 100% इथेनॉल के 30 मिलीलीटर जोड़ें और ढक्कन बंद कर दें। पूर्ण मिश्रण सुनिश्चित करने, 2 मिनट के लिए समाधान भंवर। पीहमारे एक गिलास पेट्री डिश में समाधान और अलग निर्धारित करें।
      2. एक दूसरे पेट्री डिश में 100% एथिल शराब के 15 मिलीलीटर डालो और अलग सेट (बर्तन लेबल करने के लिए सुनिश्चित कर लें)।
      3. एक नया डिस्पोजेबल विंदुक का प्रयोग, विआयनीकृत पानी की 30 मिलीलीटर बाहर मापने के लिए और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में समाधान डालना। अगला, glutaraldehyde के 1,875 μl एक नया डिस्पोजेबल पिपेट उपाय बाहर का उपयोग करते हुए और एक ही 50 मिलीलीटर ट्यूब में समाधान डालना और ढक्कन बंद कर दें। पूर्ण मिश्रण सुनिश्चित करने, 2 मिनट के लिए समाधान भंवर। तीसरे पेट्री डिश में मिश्रण डालो, और अलग निर्धारित करें।
      4. संदंश का प्रयोग, एक 22 मिमी दौर गिलास coverslip बाहर ले और एक डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग कर 100% इथेनॉल के मिश्रण के साथ दोनों पक्षों कुल्ला।
      5. 100% इथेनॉल समाधान पकवान की 30 मिलीलीटर के साथ 3-aminopropyl-trimethoxysilane में rinsed गिलास coverslip प्लेस और 5 मिनट के लिए समाधान में बैठने के लिए अनुमति देते हैं।
      6. संदंश के साथ, कांच coverslip बाहर ले और डिस्पोजेबल विंदुक के साथ 100% इथेनॉल समाधान के साथ फिर से कुल्ला।
      7. 1,875 में rinsed गिलास coverslip गिराglutaraldehyde की μl और 30 विआयनीकृत पानी के मिश्रण का मिलीग्राम और 30 मिनट के लिए अलग निर्धारित करें।
      8. 30 मिनट के बाद, संदंश के साथ कांच coverslip हटाने और विआयनीकृत पानी से कुल्ला और आरटी पर सुखाने के लिए सूखी ऊतक हे / N पर जगह है।
      9. दोहराएँ coverslip सूई और एक ही उत्पन्न समाधान के साथ की जरूरत के रूप में कई coverslips के लिए घूम रहा है।
    2. दी प्रोटोकॉल द्वारा हाइड्रोफोबिक coverslips के बनाओ।
      1. Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl के 500 μl, एसिटिक एसिड के 100 μl और 2 मिनट के लिए एक 50 मिलीलीटर ट्यूब और भंवर में हेक्सेन के 19.4 मिलीलीटर जोड़ें। कांच पेट्री डिश में समाधान डालो और अलग निर्धारित करें।
      2. साफ संदंश का प्रयोग, एक गिलास coverslip बाहर ले और 2 मिनट के लिए तैयार मिश्रित समाधान में ड्रॉप। 2 मिनट गुजर जाने के बाद, संदंश के साथ कांच coverslip बाहर ले और आरटी पर सुखाने के लिए सूखी ऊतक हे / N पर एक डिस्पोजेबल पिपेट और जगह coverslip का उपयोग कर विआयनीकृत पानी से कुल्ला। जब तक इस्तेमाल प्लास्टिक पेट्री डिश में स्टोर coverslip।
      3. दोहराएँ coverslip के डीआईपीपीआईएनजी और एक ही उत्पन्न समाधान के साथ की जरूरत के रूप में कई coverslips के लिए घूम रहा है।

2. मोल्ड विधानसभा

  1. एक डिस्पोजेबल पिपेट एक रासायनिक अपशिष्ट कंटेनर पर 90% की एथिल शराब के साथ मोल्ड कुल्ला का उपयोग कर, नए नए साँचे उपयोग करने से पहले। अगला, विआयनीकृत पानी से भरा एक पेट्री डिश में ढालना जगह है और हे / एन बैठने के लिए अनुमति देते हैं।
  2. मोल्ड विधानसभा शुरू करने से पहले शुष्क हवा के लिए एक तौलिया पर संदंश और जगह का उपयोग कर समाधान से बाहर ढालना ले लो।
  3. ढालना हवा सुखाने है, एक उच्च परिशुद्धता हीरे-चिह्न उपकरण का उपयोग एक्स 5.99 मिमी 3.95 मिमी की तुलना में थोड़ा बड़ा दो आयतों में वर्ग हाइड्रोफिलिक coverslips के काटा। सिलिकॉन मोल्ड में कटौती स्लॉट में प्रत्येक कटौती आयत coverslip के स्लाइड।
  4. उल्टा ढालना पलटें और एक डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग सिलिकॉन मोल्ड के नीचे के साथ वैक्यूम तेल लागू होते हैं। इसके बाद, वापस सही साइड अप ढालना फ्लिप और परिपत्र हाइड्रोफिलिक गिलास को शामिल किया गया पर आचारण के नीचे दबाएँएक मुहर बनाने के लिए होंठ।
  5. डिस्पोजेबल दस्ताने के साथ, इकट्ठे ढालना लेने के लिए और एक डिस्पोजेबल पेट्री डिश में और फिर एक जैव हुड में जगह है। प्रयोग से पहले होता ढालना बाँझ 1 घंटे के लिए यूवी जैव हुड दीपक चालू करें।

3. कोलेजन मिश्रण और 3 डी मैट्रिक्स

  1. कोलेजन मिश्रण, दाग तैयारी और मानक प्रोटोकॉल 28 के अनुसार इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को तैयार करने से पहले।
  2. एक जैव हुड में, मानक प्रयोगशाला तकनीकों और प्रोटोकॉल 29,30 का उपयोग करना, वांछित chemoattractant एकाग्रता के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल मीडिया और chemoattractant मिश्रण। पिपेट 5 एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में विशेष सेल मीडिया-chemoattractant एकाग्रता समाधान के मिलीलीटर और एक गर्म पानी के स्नान में समाधान के लिए कदम।
  3. एक विंदुक का प्रयोग, माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए समाधान को गर्म करने के एक गर्म पानी के स्नान में एक दूसरे 15 मिलीलीटर ट्यूब और जगह में सिर्फ सेल मीडिया के 5 मिलीलीटर निकाल सकते हैं।
  4. 10x फॉस्फेट बफर के एक जैव हुड में, पिपेट 30 μlसूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में एड समाधान (पीबीएस)। 15 सेकंड के लिए एक ही सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब और भंवर में 1 एन सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) के 6 μl जोड़ें।
  5. फ्रिज में से कोलेजन मैं चूहे की पूंछ समाधान प्राप्त और मानक प्रयोगशाला तकनीकों और प्रोटोकॉल 29 का उपयोग करते हुए जैव-हुड के लिए कदम। कोलेजन अभी भी ठंडा है सुनिश्चित करें। एक ही सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोलेजन के 168.3 μl पिपेट।
  6. इसके बाद, एक ही सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए एक पिपेट का उपयोग पीले, हरे फ्लोरोसेंट कार्बोक्सिलेट संशोधित microspheres की 18 μl जोड़ें। भंवर 30 सेकंड के लिए सभी समाधान के साथ सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब।
  7. सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में वांछित सेल मीडिया सेल मिश्रण (लगभग 2 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल एकाग्रता) की 77.7 μl जोड़ें और 20 सेकंड के लिए विंदुक टिप का उपयोग कर मिश्रण। आवश्यक के रूप में, फ्लोरोसेंट माला और सेल व्यवहार्यता तालिका (तालिका 1) के अलावा के लिए अनुकूलित कस्टम कोलेजन मिश्रण का पालन करके मैट्रिक्स घनत्व बदल।
  8. पिपेट 300 & #181, अच्छी तरह से केंद्र में कोलेजन सेल मिश्रण के एल तैयार की मोल्ड विधानसभा की अच्छी तरह से (# 2)। एक डिस्पोजेबल पेट्री डिश पर मोल्ड प्लेस और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एक मानक इनक्यूबेटर में चलते हैं।
  9. इनक्यूबेटर से सिस्टम को हटाने और जैव हुड में वापस जगह है। संदंश का प्रयोग, प्रत्येक coverslip के शीर्ष पर clamping और दूर मोल्ड से ऊपर खींच रहा है और दोनों के द्वारा हाइड्रोफोबिक कवर फिसल जाता है हटा दें।
  10. कोलेजन ढालना पक्षों ने एक तलीय प्रसार ढाल के लिए अनुमति देने के लिए सीधे अभी भी कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए वांछित माइक्रोस्कोपी और छवि के लिए पूरी व्यवस्था को ले जाएँ।
  11. एक 100 μl एकल चैनल पिपेट का उपयोग कर खुर्दबीन के नीचे अभी भी सिस्टम, के साथ, अच्छी तरह से # 1 में सेल मीडिया के 100 μl जोड़ें। इसके बाद, एक 100 μl एकल चैनल पिपेट का उपयोग अच्छी तरह से # 3 में वांछित chemoattractant एकाग्रता के साथ सेल मीडिया के 100 μl जोड़ें।
  12. इसके तत्काल बाद दोनों कुओं में समाधान जोड़ने के बाद, इमेजिंग शुरू।

4. इमेजिंग और प्रसारमॉडलिंग

  1. एक विशिष्ट एकाग्रता की गणना करने के लिए विशिष्ट कोलेजन घनत्व के लिए प्रसार गुणांक को खोजने के लिए करना चाहता है, नीचे प्रोटोकॉल का पालन करें:
    1. , बजाय वांछित chemoattractant एकाग्रता के साथ सेल मीडिया पैदा करने की ", कोलेजन मिश्रण और 3 डी मैट्रिक्स 'के ऊपर शीर्षक दिया प्रोटोकॉल का पालन मानक गणना और प्रोटोकॉल में 30 का उपयोग करते हुए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 5 माइक्रोन rhodamine बनाते हैं।
    2. छवि एक confocal प्रणाली के साथ 3 डी कोलेजन matrices के प्रतिदीप्ति पर कब्जा करने के लिए एक आर्गन लेजर (488 एनएम) का उपयोग कर एक औंधा माइक्रोस्कोप पर मुहिम शुरू की। छवि को 7 घंटे के लिए हर 2 या 3 सेकंड।
  2. प्रसार मॉडलिंग के लिए: नीचे दिखाई गणितीय मॉडल का उपयोग करना, इन सामान्य चरणों के साथ प्रोसेसिंग और विश्लेषण के लिए एक कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर कोड लिखें।
    1 समीकरण
    1. अधिकतम इरादे से rescaling और सामान्य के लिए कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर में आयात छवियोंचर्चाएं। बढ़त के चयन करने के लिए इस छवि का एक ग्रे रंग-नक्शा करने के लिए छवियों में कनवर्ट करें। केंद्र के अधिकार के लिए और केंद्र के बाईं ओर, छवि के केंद्र के साथ एक धुरी उठाओ।
    2. कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर कोड का उपयोग करना, सच तीव्रता और दोनों के बीच अंतर के साथ साथ, सामान्यीकृत तीव्रता साजिश है।
    3. फिटिंग (एकाग्रता, समय, और लंबाई) के लिए आवश्यक अगला, इनपुट पैरामीटर।
    4. समय बनाम सामान्यीकृत एकाग्रता और डेटा के लिए एक बहुपद फिट के साथ एक्स-अक्ष भर में एकाग्रता प्रोफाइल प्लॉट।
    5. कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर कोड का उपयोग प्रसार के गुणांक की गणना।

5. प्रायोगिक मापन

  1. वापस प्रसार समीकरण की चर्चा करते हुए, नीचे के रूप में दिखाया प्रणाली के भीतर किसी भी स्थान पर विशिष्ट एकाग्रता को खोजने के लिए समीकरण को फिर से लिखना।
    2 समीकरण
    कहां है:
    वें के एल = लंबाईई मैट्रिक्स कोलेजन
    जांच के तहत एक्स = स्थान
    प्रसार के डी = गुणांक
    टी = बीता समय
  2. कीमोटैक्सिस प्रयोगों के दौरान, पल केमोकाइन प्रणाली को जोड़ा गया है कि विशिष्ट समय रिकॉर्ड करने के लिए किया जाता है। सेल प्रवास आंदोलन पाया जाता है एक बार, कोंफोकल समय चूक रिकॉर्डिंग रिकॉर्ड, और इमेजिंग हुई जहां किनारे से विशिष्ट समय और स्थान नोट करने के लिए किया जाता है।
  3. डेटा विश्लेषण के दौरान, प्रसार और सेल प्रयोगों दोनों के लिए कोलेजन के भीतर किसी भी बिंदु पर सामान्यीकृत विशिष्ट एकाग्रता को खोजने के लिए समीकरण में विशेष सेल के लिए विख्यात गुजरे समय, स्थान और प्रसार के गुणांक प्लग।

TFM का उपयोग 6. ट्रैकिंग सेल प्रवास

  1. TFM / डीवीसी तकनीक से नीचे प्रोटोकॉल का पालन का उपयोग करते हुए सेल प्रवास को ट्रैक करने के लिए:
    1. अच्छी तरह से # 3 में वांछित chemoattractant एकाग्रता के अलावा के बाद, एक औंधा माइकर पर मुहिम शुरू की एक confocal प्रणाली के साथ 3 डी कोलेजन मेट्रिसेस इमेजिंग शुरूoscope एक सेल की जांच के लिए लगता है।
    2. एक चलती सेल पाया जाता है एक बार, देखने के क्षेत्र के बीच में सेल जगह है और (Z अक्ष में छवि के लिए) एक piezoelectric मोटर, छवि हर 1 या 2 मिनट का उपयोग।
    3. सेल बल पीढ़ी और विरूपण की गणना के लिए, TFM / डीवीसी प्रोटोकॉल 31 निम्नलिखित प्रतिदीप्ति मोतियों की विस्थापन को खोजने के लिए एक कम्प्यूटेशनल कोड उत्पन्न करते हैं।

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Representative Results

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सही रूप में सेल के पलायन का आकलन करने के लिए इस परख की क्षमता प्रणाली के एक अच्छा सेटअप पर निर्भर करता है। इसलिए, यह सही प्रसार प्रणाली मोल्ड डिजाइन और चित्र 1 में सचित्र के रूप में, हाइड्रोफोबिक और हाइड्रोफिलिक दोनों coverslips रखने में महान देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रणाली ठीक से बनाया गया है और एक बहुत खोजने के लिए सुनिश्चित करने के प्रसार मॉडलिंग चरण के दौरान किया जाता है तो इस प्रणाली के प्रसार का विश्लेषण करने के लिए, चित्रा 2 में दिखाया गया के रूप में एक अच्छा प्राप्त करने में सक्षम है, रैखिक शुरू लाइन अच्छा, छवियों fluoresces।

एक सफल सेल कीमोटैक्सिस विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण प्रसार मॉडलिंग और एक कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर उत्पन्न कोड के माध्यम से प्रसार और विशिष्ट एकाग्रता समीकरण के गुणांक खोजने के लिए सामान्य प्रसार के समीकरण को हल किया जाता है। विश्लेषण कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर में छवियों को आयात करने और चलाने के बाद (चित्रा 3), प्रसार के गुणांकमूल्यांकन किया जा सकता है (तालिका 2)। चित्रा 4 पाँच परीक्षण किया कोलेजन सांद्रता के माध्यम से rhodamine के प्रसार के भूखंडों का प्रतिनिधित्व करता है। प्रसार भूखंड का आकार एक रेखीय प्रसार मॉडल के पारंपरिक आकार से मेल खाते हैं। यह rhodamine के प्रसार कोलेजन-कम कोलेजन घनत्व तेजी से प्रसार की एकाग्रता के विपरीत आनुपातिक है कि देखा जा सकता है। यह कोलेजन के इस एकाग्रता में एक उच्च porosity है, के रूप में उम्मीद की जा रही है। 1.5 मिलीग्राम / एमएल (चित्रा 4 बी) के एक एकाग्रता में कोलेजन प्रसार साजिश में क्षैतिज लाइनों बस ट्रेसर संकेत के संतृप्ति से अधिक का परिणाम हैं। चित्रा 4 में दिखाया गया है इससे भी महत्वपूर्ण बात, प्रत्येक पंक्ति समय सामान्यीकृत एकाग्रता कभी नहीं रसायन का कोई पलटने का संकेत है, एक ही समय (डीटी) पर पिछले अंक से अधिक बढ़ जाती है, जबकि करने के लिए, कोलेजन के अंदर एक विशिष्ट बिंदु (एक्स, वाई) का प्रतिनिधित्व करता है। यह एक चे का एक महत्वपूर्ण विशेषता हैmotaxis चैम्बर रिवर्स प्रवाह के बिना एक chemoattractant का सीधा प्रवाह की अनुमति है।

प्रत्येक एक्स स्थान पर पिछले दस छवियों की जांच करके, एक स्थानों में से प्रत्येक में rhodamine के स्थिर राज्य एकाग्रता के एक भूखंड उत्पन्न करने में सक्षम है। पूरे नमूना लंबाई (चित्रा 5) के पार extrapolating करके, एक पूरे नमूना को देखने के लिए कर सकते हैं। यह रेखीय प्रसार ढाल सेल प्रयोगों (चित्रा 6) के लिए उपयोग किया जा सकता है, जो पूरे नमूना लंबाई, भर के अनुरूप है कि इंगित करता है।

चित्र 1
चित्रा 1: लाइव सेल इमेजिंग कक्ष में तलीय ढाल प्रसार प्रणाली मोल्ड विधानसभा का एक योजनाबद्ध (1) (नीचे शीर्ष करने के लिए) से एक नीचे आवास (ग) एक हाइड्रोफिलिक 22 मिमी coverslip, मिट्टी से मिलकर पूरी प्रणाली के एक कंप्यूटर गायन,। शीर्ष आवास, और एक गिलास को कवर। (2) मो के आयाम (क) सम्मिलित करता कटौती जहां एलडी दिखाए जाते हैं। (3) (ख) प्रत्येक पक्ष पर हाइड्रोफोबिक coverslips के 3-अच्छी तरह से प्रणाली बनाने के लिए कटौती आवेषण में गिरावट के साथ कोलेजन मैट्रिक्स के साथ मोल्ड। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: कोलेजन में rhodamine माइक्रोस्कोपी छवियों का उदाहरण एक 1.0 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन एकाग्रता के साथ तलीय ढाल प्रसार प्रणाली में एक ही Z अक्ष स्थान पर rhodamine प्रसार प्रयोगों के दौरान लिया छवियों प्रतिनिधि,।। स्केल बार = (क) 0 मिनट (ख) 3 मिनट (ग) 7 मिनट, और rhodamine के बाद (डी) 15 मिनट है, जहां 500 माइक्रोन चैम्बर के लिए जोड़ा गया है। तीर कोलेजन मैट्रिक्स के माध्यम से rhodamine के प्रसार की दिशा इंगित करता है।e.com/files/ftp_upload/52948/52948fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। प्रारंभिक (डीटी = 0) छवि के विश्लेषण और एक 2.5 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन एकाग्रता के साथ कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर कोड के द्वारा उत्पन्न प्रसार गणना का सारांश का उदाहरण (ए) काले और सफेद प्रतिपादन विश्लेषण के लिए कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर में अपलोड की गई। (बी) के विशेष अंक तीव्रता तुलना के लिए और प्रसार की गणना के लिए उपयोगकर्ता द्वारा चुना (एक्स, वाई अक्ष पिक्सल में) कर रहे हैं। प्रत्येक पंक्ति स्थिर राज्य में कोलेजन मैट्रिक्स भर में rhodamine की छवि बी (डी) एकाग्रता प्रोफ़ाइल में एक लाल रंग की बात करने के लिए इसे संबद्ध जहां कोलेजन मैट्रिक्स भर में rhodamine (सी) प्रसार प्रोफ़ाइल। Smoothed डेटा के बीच (ई) तुलना (Bluई डॉट) और smoothed और सच (हरी डॉट के बीच अंतर के साथ प्रसार प्रयोग (लाल डॉट) से सच डेटा)। (एफ) सच (लाल डॉट) की सामान्यीकृत एकाग्रता और सज्जित (हरा) डॉट प्रयोग भर में कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर कोड से डेटा। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। विभिन्न बिंदुओं पर तलीय ढाल प्रसार प्रणाली का उपयोग कर कोलेजन मैट्रिक्स के माध्यम से प्रसार प्रोफाइल का उदाहरण प्रत्येक पंक्ति उपयोगकर्ता द्वारा कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर कोड से चुना एक अलग चयनित डेटा बिंदुओं को इंगित करता है। (ए) 1.0 मिलीग्राम / एमएल (बी) के 1.5 मिलीग्राम / एमएल (सी) 2.0 मिलीग्राम / एमएल (डी) 2.2 मिलीग्राम / एमएल और के घनत्व पर कोलेजन मैट्रिक्स (ई रोंग>) 2.5 मिलीग्राम / एमएल। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। स्थिर राज्य में तलीय ढाल प्रसार प्रणाली का उपयोग कर कोलेजन मैट्रिक्स भर में rhodamine के एक एकाग्रता (सामान्यीकृत) प्रोफ़ाइल का उदाहरण सर्किलों उपयोगकर्ता द्वारा कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर कोड हालांकि चुना विशिष्ट डेटा अंक हैं। रेड लाइन पूरी कोलेजन मैट्रिक्स भर में rhodamine एकाग्रता दिखाने के लिए (दिखाया आर 2 मूल्य के साथ) सबसे अच्छा लाइन फिट डेटा बिंदुओं का उपयोग करने और extrapolating का निर्माण किया। (ए) 1.0 मिलीग्राम / एमएल (बी) के 1.5 मिलीग्राम / एमएल (सी) 2.0 मिलीग्राम / एमएल (डी) 2.2 मिलीग्राम मिलीग्राम / और (ई) 2.5 मिलीग्राम / एमएल के घनत्व पर कोलेजन मैट्रिक्स।2948fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: सेल प्रवास के प्रयोगों का उदाहरण 3 डी तलीय ढाल प्रणाली में पलायन एक न्यूट्रोफिल की A से Z-टुकड़ा माइक्रोस्कोप छवि।। न्यूट्रोफिल सितारा प्रयोग के शुरू में सेल की प्रारंभिक स्थिति को इंगित करता है जहां chemoattractant ढाल (सफेद तीर ढाल की दिशा को दर्शाया गया है और त्रिकोण अपनी एकाग्रता प्रोफाइल से पता चलता है), की ओर migrates। Subplot तीर अगली बार सूत्रीय दिशा इंगित करता है जहां 3 डी अंतरिक्ष में सेल से पता चलता है। स्केल बार 10 माइक्रोन =। छवियों के बीच डीटी = 5 मिनट (यानी, एबी)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कोलेजन सेल घनत्व पीबीएस फ्लोरोसेंट मोती NaOH कोलेजन मैं चूहे की पूंछ मीडिया
2.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर 10% 6% 2% 70.20% 11.80%
2.2 मिलीग्राम / एमएल 10% 6% 2% 61.70% 20.30%
2.0 मिलीग्राम / एमएल 10% 6% 2% 56.10% 25.90%
1.5 मिलीग्राम / एमएल 10% 6% 2% 42.10% 39.90%
1.0 मिलीग्राम / एमएल 10% 6% 2% 28.10% 53.90%

तालिका 1: कस्टम गफ्लोरोसेंट माला और सेल व्यवहार्यता के अलावा के लिए अनुकूलित ollagen मिश्रण।

कोलेजन जेल की एकाग्रता प्रसार का गुणांक (2 सेमी / सेक)
2.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर 1.03 एक्स 10 -6 2.54 एक्स 10 -7 ±
2.2 मिलीग्राम / एमएल 1.28 एक्स 10 -6 3.53 एक्स 10 -7 ±
2.0 मिलीग्राम / एमएल 6.48 एक्स 10 -6 1.66 एक्स 10 -7 ±
1.5 मिलीग्राम / एमएल 1.05 एक्स 10 -5 2.04 एक्स 10 -7 ±
1.0 मिलीग्राम / एमएल 1.39 एक्स 10 -5 1.06 एक्स 10 -7 ±
पानी 1.50 एक्स 10 -5

तालिका 2: प्रसार के गुणांक।

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Discussion

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के साथ या कोशिकाओं के बिना सफल प्रसार प्रयोगों के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: सही ढंग से मोल्ड विधानसभा की स्थापना; हाइड्रोफोबिक coverslips की निकासी के दौरान नुकसान को रोकने के लिए आवश्यक मैनुअल निपुणता विकसित करना; सही तरीके से प्रसार गुणांक की गणना के लिए एक बहुत अच्छा रैखिक शुरू लाइन को खोजने के लिए यह सुनिश्चित करना; कोलेजन और chemoattractant दोनों की प्रयोगात्मक गणना सही; सही ढंग से बाहर सूखा नहीं है मैट्रिक्स सुनिश्चित करने के लिए जीना सेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करें; और एक बाँझ, स्वस्थ संस्कृति को बनाए रखने।

प्रसार प्रयोगों का आयोजन करते हैं, तो यह प्रसार भूखंडों (चित्रा 4) एक रेखीय प्रसार मॉडल के पारंपरिक आकार मैच सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है।

टा में रिपोर्ट के रूप में प्रत्येक नमूने पर कई अलग अलग एक्स स्थानों पर विश्लेषण चल रहा है, यह कोलेजन के विभिन्न सांद्रता में rhodamine के लिए प्रसार की औसत गुणांक की गणना करने के लिए संभव है ble 2। कोलेजन की एकाग्रता मैट्रिक्स में porosity की वृद्धि की वजह से कमी आई है के रूप में इन परिणामों के कोलेजन जेल घटने के माध्यम से प्रसार के पिछले शोध के गुणांक के साथ संगत कर रहे हैं।

स्थिर अवस्था में प्रसार मॉडल समीकरण के अनुसार, एक x मान भर में एक रेखीय एकाग्रता प्रोफाइल जाने की उम्मीद है। अंक के लिए एक रेखीय समारोह फिटिंग द्वारा, एक वे, वास्तव में, सभी रैखिक रहे हैं कि देख सकते हैं। तीन कोलेजन सांद्रता के लिए सबसे अच्छा फिट लाइनों में से प्रत्येक के लिए एक रेखीय प्रवृत्ति लाइन फिटिंग के आर 2 मूल्य पर या 0.92 से ऊपर थे। सभी extrapolated भूखंडों में बच के मानदंडों एक अच्छा फिट, यह दर्शाता है .0227 थे। इस रैखिक संबंध विश्लेषणात्मक समाधान के साथ समझौते में है। उम्मीद होगी इमेजिंग के रूप में कोलेजन नमूना के किनारे पर सीधे शुरू नहीं करता है, क्योंकि एकाग्रता, 100% पर शुरू नहीं करता है। यह पूरी तरह से इमेजिंग जांच करने के लिए भी असंभव है।

_content "> इसके अतिरिक्त, हम परिणामों की तुलना करने के लिए जैल में प्रसार को देखा है कि अन्य कागजात संदर्भ में सक्षम थे। शेनॉय और रोज़ेनब्लाट 2.2 एक्स होना करने के लिए एक 30 मिलीग्राम / एमएल succinylated कोलेजन समाधान में बीएसए (त्रिज्या = 4 एनएम) के प्रसार गुणांक पाया 10 -7 2 सेमी / सेकंड 32। rhodamine की त्रिज्या कोलेजन 24 के माध्यम से अपनी तेजी से प्रसार समय जो बताते 0.78 एनएम है। प्रसार के अध्ययन में यह अणुओं की तुलना करने की त्रिज्या का उपयोग करने के लिए आम बात है। त्रिज्या बढ़ जाती है, आणविक वजन भी बढ़ जाती है। रामानुजन एट अल। dextran के प्रसार गुणांक पाया (त्रिज्या = 6 एनएम) polymerized 20% कोलेजन जैल में 4.72 एक्स 10 -8 2 सेमी / सेक 24 होने के लिए (2.0 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता जैल के समकक्ष)। फिर, हम खाते में अणु आकार अंतर रखना अगर यह (डी = 1.28 एक्स 10 -6 2 सेमी / सेक) हम 2.0 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता जेल के लिए मनाया प्रसार गुणांक के बराबर है। Leddy और Guilak संवर्धनजोड़ कार्टिलेज 33 के माध्यम से dextrans के प्रसार आइईडी। जोड़ कार्टिलेज के द्रव्यमान का लगभग दो-तिहाई पोलीमेरिक कोलेजन (मुख्यतः प्रकार द्वितीय) है क्योंकि यह कोलेजन matrices के माध्यम से और जोड़ कार्टिलेज के माध्यम से प्रसार तुलना करने के लिए संभव है। Leddy और Guilak सेमी -7 10 एक्स 6-10 के बीच 2 / सेकंड 33 होने के लिए जोड़ कार्टिलेज के माध्यम से 3 केडीए dextran के प्रसार गुणांक पाया। सिस्टम ठीक से काम करता है यह जानते हुए कि हम तो sawtooth और क्षणिक प्रणाली गर्मी हस्तांतरण मॉडल का उपयोग, सिस्टम के भीतर कहीं भी विशिष्ट एकाग्रता की गणना करने में सक्षम थे। इस अतिरिक्त मीट्रिक सेल एकाग्रता समझ और ढाल ढाल ट्रैक करने के लिए सेल प्रयोगों के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है।

हमारे दृष्टिकोण का उपयोग करते समय प्रयोगों के समय की अवधि एक सीमित कारक हो सकता है। इसलिए, यह बाहर सूखा नहीं है मैट्रिक्स सुनिश्चित करने के लिए जीना सेल इमेजिंग प्रणाली के लिए एक कवर का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। Experimen के दौरान एक कवर का उपयोगटीएस, हम सफलतापूर्वक जेल सूख बिना सेल प्रयोगों के दौरान 7 घंटा और 4 घंटे के लिए rhodamine के प्रसार की निगरानी करने में सक्षम थे। एक एक कवर का उपयोग नहीं करता है, जेल में तेजी से सूख और काफी कोशिकाओं के प्रसार और प्रवास प्रभावित हो सकती है।

इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल कीमोटैक्सिस के दौरान एक 3 डी वातावरण में सेल बलों को मापने के लिए सक्षम होने के लिए एक अच्छी तरह से नियंत्रित तलीय प्रसार मॉडल / प्रणाली का उपयोग करता है। यहाँ हम TFM / डीवीसी के प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है कि एक नव विकसित सरल प्रणाली मौजूद है। 3 डी कोलेजन matrices के माध्यम से 1) सफलतापूर्वक मॉडल प्रसार और तलीय ढाल प्रसार प्रणाली, कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त करते हैं, तो कीमोटैक्सिस और नहीं chemokinesis को बढ़ावा देना चाहिए कि, विश्लेषणात्मक अभिव्यक्ति के लिए डेटा फिटिंग द्वारा, सत्यापित;: इस प्रणाली का प्रयोग, शोधकर्ताओं करने में सक्षम हो जाएगा 2) पाँच अलग अलग सांद्रता के कोलेजन के लिए प्रसार के गुणांक की गणना; और 3) को सफलतापूर्वक डि भीतर chemoattractant के विशिष्ट एकाग्रता लगता हैffusion चैंबर। इस दृष्टिकोण के साथ, एक और बहुपक्षीय प्रणाली और जटिल प्रसार ढ़ाल की श्रमसाध्य दृष्टिकोण के बिना नहीं आसानी से और आसानी से उपलब्ध विशिष्ट मीट्रिक के साथ सेल कीमोटैक्सिस की जांच कर सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Corp 182 SIL ELAST KIT .5KG a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 CMB for 18 mm round coverslips
22 mm Glass Coverslip Fisher Scientific NC0180281 Neuvitro Corp. cover slip 22 mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife X-Acto X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778-5ML
Glutaraldehyde Polysciences, Inc 00216A-10 Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube Fisher Scientific 14-432-22 Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass Petri dish Fisher Scientific 08-747A Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15 mm)
Forceps Fisher Scientific 22-327-379 Fine Point Forceps
Cover glasses Fisher Scientific 12-518-105A Rectangle; 30 x 22 mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl Gelest SIT8174.0
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane Sigma-Aldrich 296090 anhydrous, 95%
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool Lunzer PV-081-3 Straight extended tip scribe, .020" (.50 mm) diameter by .200" (5.0 mm) tip length
Vacuum grease Dow Corning 14-635-5C High-Vacuum Grease
15 ml tube Fisher Scientific 14-959-49D 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10x phosphate buffered solution Fisher Scientific BP399-500 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1 N sodium hydroxide Sigma-Aldrich 38215 Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail BD Biosciences 354236 Rat tail 
Micro centrifuge tube Fisher Scientific 02-681-332 Volume: 2.0 ml;
O.D. x L: 13 x 40 mm;
sterile; single-wrapped
Name Company Catalog Number Comments
Carboxylate-modified microspheres Invitrogen  F-8813 Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine Sigma-Aldrich 83689 Rhodamine B for fluorescence

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References

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प्लानर ढाल प्रसार प्रणाली एक 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में कीमोटैक्सिस जांच
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Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).More

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).

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