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Bioengineering

Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

doi: 10.3791/52948 Published: June 12, 2015

Introduction

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Il movimento preferito di cellule verso un gradiente di concentrazione, noto come chemiotassi, svolge un ruolo importante in processi patologici e fisiologici del corpo. Tali esempi sono la pelle e le mucose guarigione delle ferite 1, morfogenesi 2, infiammazione 3, e la crescita tumorale 4,5. E 'stato anche dimostrato che le cellule tumorali possono migrare attraverso due strategie cellule migratorie individuali e collettive 6. Inoltre, i meccanismi di instabilità diffusionali possono indurre la separazione delle cellule singole o cluster da un corpo / oggetto tumorale e quindi in grado di emigrare verso una fonte di sostanze nutritive e di invadere le zone più ampie e tessuti 7 così.

Inoltre, è stato dimostrato che i meccanismi di migrazione diverse possono essere attivi in 2D e in 3D, a causa di diversi ruoli delle molecole di adesione 8. Pertanto, una mossa per fisiologicamente rilevanti in vitro per indagare motilità cellulare in un measureable e modo semplice è di importanza nella comprensione movimento delle cellule fenomeni 9. Purtroppo, la difficoltà nell'analisi migrazione cellulare, un completo test chemiotassi quantificabile solito richiede un metodo lungo laboriosa, fondata sulla misurazione della motilità cellulare e fenomeni di trasporto modelli imparziale.

Approcci sperimentali passato per indagare chemiotassi cellulari includono la camera di Boyden 10 e il sotto dosaggio agarosio 11. Tuttavia, all'interno di questi primi test, esperimenti di migrazione delle cellule non hanno controllano il movimento in relazione al tempo. Di più, importante, i gradienti di concentrazione usati per gli esperimenti sono stati non ben definiti o completamente compresi mentre solo sostenere la segnalazione per non più di qualche ora. Inoltre, presto chemiotassi tentativi camera limitato la migrazione delle cellule a due dimensioni e non permettono di monitorare la cinetica della migrazione 12. Guardando la camera di Boyden, un saggio finalenon consentirebbe al ricercatore di osservare la migrazione visivamente e non ha potuto differenziare direttamente chemiotassi (movimento direzionale) da chemochinesi (movimento casuale). Inoltre, diverse variabili differenze nella dimensione dei pori e lo spessore delle membrane-reso la camera molto difficile da riprodurre facilmente e nascosti reazione migrante delle cellule di chemochine 13,14.

Con la nuova comprensione di microfluidica, nuove camere e micro-dispositivi sono stati studiati come strumento per indagare locomozione cella in condizioni di flusso interstiziali o chemiotassi 15,16. In questi nuovi dispositivi, sono stati introdotti e studiati, come l'effetto di sollecitazione di taglio su una cella 17,18 nuove metriche cellulari. Purtroppo, le camere chemiotassi microfluidica passati e attuali limitati studi di migrazione cellulare a substrati-an 2D battuta d'arresto importante dal momento che molti processi biologici, tra cui l'invasione delle cellule tumorali e metastasi, e immigrazione cellulare mune, comporta migrazione 3D.

Camere-dove osservazione diretta di una soluzione chemiotattico è in contatto con un gel 3D contenente cellule sono anche stati riportati anche 19,20. Queste camere hanno due scomparti, uno contenente un fattore chemiotattico e una contenente cellule, sono uniti l'uno accanto all'altro in orizzontale 21 o come anelli concentrici 22. Questi sistemi sono puntati nella giusta direzione, ma non mantengono un sistema di chemiotassi per un periodo di tempo prolungato.

Inoltre, i ricercatori hanno esaminato diffusività attraverso membrane di collagene nelle cellule dialisi, nonché la diffusione delle molecole traccianti attraverso campioni di collagene sottoposta a pressione idrostatica 23-25. Alcuni esperimenti di diffusione in gel di collagene affidano a modificazioni fisiche e chimiche del gel utilizzando campi magnetici e incorporazione chimiche 26. Un metodo comune per la modellazione di diffusività in collatessuti azo tati si basa sulla fluorescenza del punto photobleaching continuo. Questo metodo ha rivelato anisotropia nei coefficienti di diffusione di macromolecole nei tessuti collageni orientati. Tuttavia, photobleaching è stato usato nella cartilagine articolare e non collagene matrici. Mentre simile, gli esperimenti di modellazione necessari devono essere effettuati tramite specificamente comprendere il coefficiente di diffusione del gel di collagene. Ancora più importante, i sistemi non utilizzano un metodo per misurare generazione di forza cella.

Sfortunatamente, la maggior parte dei sistemi sembrano mancare uno o due elementi fondamentali per un sistema ideale: il che consente di inseguimento cellulare, una comprensione gradiente di diffusione con un fattore chemiotattico attraverso la matrice, un insieme relativamente semplice con una facilità di riproducibilità, la minimizzazione interazioni cellula-cellula, e la capacità di misurare unità dimensionali per quantificazione (cioè, velocità, forza, concentrazione specifica). Moghe et al. 27 ha proposto un sistema che soddisfaceva la maggior parte di questi requisiti in cui le cellule sono state inizialmente disperse nel gel anziché concentrati sulla superficie del filtro, ma era difficile misurare le forze che la cellula genera.

A questo proposito, vi presentiamo un sistema planare gradiente di diffusione di indagare chemiotassi in una matrice di collagene in 3D, che permette di superare i limiti moderni camera di diffusione dei dosaggi esistenti, che si basa sulla microscopia time-lapse, associato a tecniche di analisi di immagine per la misurazione delle cellule forze in un ambiente 3D. Questo protocollo fornisce un modo semplice, ma innovativo di creazione di una semplice camera di diffusione 3D che può essere usato per studiare chemiotassi 3D in celle diverse.

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Protocol

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1. 3D Mold Design e parti di ricambio

  1. Muffa
    1. Prima di lavorare, di ottenere un kit di elastomero siliconico, una camera di imaging cellulare dal vivo, un vetrino di vetro di 22 mm e un cubo di metallo alluminio lavorato con dimensioni 10,07 millimetri x 3,95 millimetri x 5,99 millimetri. Preparare la camera di cellule vive per stampaggio ponendo il vetrino nel supporto inferiore e montaggio del resto della camera come indicato dal produttore.
    2. Successivamente, utilizzando una pinza, posizionare il cubo di metallo alluminio lavorato al centro della custodia camera di imaging cellulare dal vivo e sulla parte superiore del vetrino, e poi mettere da parte.
    3. Mescolare soluzioni elastomero siliconico secondo il protocollo del produttore per fare 5 ml di elastomero.
    4. Utilizzando un laboratorio spatola monouso, versare la soluzione elastomero siliconico in configurazione camera di imaging cellulare dal vivo e garantire di non muoversi messo lavorato cubo di metallo alluminio. Posizionare il sistema sul banco di laboratorio, in una posizione sicura O / N per curare.
    5. La mattina dopo, decostruirela camera di imaging cellulare dal vivo, come raccomandato dal costruttore e tirare fuori la muffa con pinze. Utilizzando pinze, estrarre con attenzione il cubo di metallo alluminio lavorato da muffe. Vai al lavello e lavare lo stampo con acqua deionizzata. Mettere lo stampo su un tovagliolo di carta per asciugarsi.
    6. Una volta asciutto, di un coltello multiuso mio hobby, tagliare fessure attraverso lo stampo, distanziati 2,34 millimetri di distanza l'uno estremità longitudinale, all'interno dello stampo in silicone. Assicurarsi che i soggiorni di stampo in un luogo sicuro e asciutto fino a quando si è pronti a costruire il sistema per un esperimento.
  2. Idrofili e idrofobi vetro coprioggetto Preparazione
    1. Per consentire la matrice di collagene di aderire ad una superficie, creare coprioggetto idrofili:
      1. Usando una pipetta monouso, misurare 150 ml di 3-amminopropil-trimetossisilano e versare la soluzione in un tubo da 50 ml. Aggiungere 30 ml di etanolo al 100% al tubo 50 ml con una seconda pipetta monouso e chiudere il coperchio. Vortex la soluzione per 2 minuti, assicurando la completa miscelazione. Pla nostra soluzione in una capsula di Petri di vetro e mettere da parte.
      2. Versare 15 ml di alcol etilico al 100% in un secondo piatto di Petri e mettere da parte (assicuratevi di etichettare i piatti).
      3. Utilizzando una nuova pipetta monouso, misurare 30 ml di acqua deionizzata e versare la soluzione in una provetta da 50 ml. Successivamente, utilizzando una nuova misura pipetta usa e getta su 1.875 ml di glutaraldeide e versare la soluzione nello stesso tubo da 50 ml e chiudere il coperchio. Vortex la soluzione per 2 minuti, assicurando la completa miscelazione. Versare il composto in terza piastra di Petri, e mettere da parte.
      4. Utilizzando pinze, togliere un 22 millimetri coprioggetto di vetro rotondo e risciacquare entrambi i lati con 100% di miscela di etanolo con una pipetta monouso.
      5. Inserire coprioggetto di vetro risciacquati in 3-amminopropil-trimetossisilano con 30 ml di etanolo al 100% piatto soluzione e lasciar riposare in soluzione per 5 min.
      6. Con una pinza, estrarre coprioggetto di vetro e sciacquare di nuovo con soluzione di etanolo al 100% con la pipetta monouso.
      7. Goccia coprioggetto di vetro risciacquato in 1.875ml di glutaraldeide e 30 ml di miscela di acqua deionizzata e mettere da parte per 30 min.
      8. Dopo 30 minuti, rimuovere coprioggetto di vetro con una pinza e sciacquare con acqua deionizzata e collocarlo su asciutto O tessuto / N ad asciugare a temperatura ambiente.
      9. Ripetere immersione coprioggetto e in movimento per il numero di lamelle, se necessario con le stesse soluzioni generate.
    2. Fai coprioggetto idrofobiche dal protocollo data.
      1. Aggiungere 500 pl di tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl, 100 ml di acido acetico e 19,4 ml di esano in una provetta da 50 ml e agitare per 2 min. Versare la soluzione in vetro piastra di Petri e mettere da parte.
      2. Utilizzando pinze pulite, togliere un vetrino di vetro e cadere in soluzione mista preparata per 2 minuti. Dopo 2 minuti sono passati, togliere vetrino di vetro con una pinza e sciacquare con acqua deionizzata con una usa e getta pipetta e luogo coprioggetto su asciutto O tessuto / N ad asciugare a temperatura ambiente. Conservare vetrino in piatti di plastica Petri fino all'uso.
      3. Ripetere coprioggetto DIPPzione e spostando a molti coprioggetto come necessario con le stesse soluzioni generati.

Assemblea 2. Mold

  1. Prima di utilizzare stampi, usando una pipetta monouso lavare lo stampo con il 90% di alcool etilico su un contenitore per rifiuti chimici. Quindi, posizionare lo stampo in una capsula di Petri riempita con acqua deionizzata e lasciar riposare O / N.
  2. Prendete muffa dalla soluzione con pinze e posto su un telo ad asciugare prima di avviare il gruppo di forma.
  3. Mentre lo stampo è aria di essiccazione, tagliare i coprioggetti idrofili quadrata in due rettangoli leggermente più grandi 3,95 millimetri x 5,99 millimetri utilizzando uno strumento diamante scribing alta precisione. Far scorrere ogni vetrino taglio rettangolo nelle fessure tagliate nello stampo in silicone.
  4. Vibrazione dello stampo capovolto e applicare grasso per vuoto lungo il fondo dello stampo in silicone con una pipetta monouso. Avanti, capovolgere lo stampo posteriore lato destro in alto e premere il fondo dello stampo sulle coperture in vetro idrofili circolarilabbro per creare una tenuta.
  5. Con guanti monouso, prendere lo stampo montato e mettere in un piatto e getta Petri e poi in un bio-cappuccio. Accendere lampada UV Bio-cappuccio per 1 ora per sterilizzare lo stampo prima che si verifichi la sperimentazione.

3. Il collagene miscela e 3D Matrix

  1. Prima di preparare la miscela di collagene, macchia e preparare le cellule per l'imaging secondo protocolli standard 28.
  2. Utilizzando tecniche di laboratorio standard e protocolli 29,30, in un bio-hood, mescolare carta cellulari e chemiotattico in un tubo da 15 ml alla concentrazione chemoattractant desiderata. Pipettare 5 ml di soluzione specifica cella media-chemiotattico concentrazione in una provetta da 15 ml e spostare la soluzione in un bagno d'acqua riscaldata.
  3. Usando una pipetta, estrarre 5 ml di supporti cellulari solo in un secondo tubo da 15 ml e posto in un bagno d'acqua riscaldata per riscaldare la soluzione per esperimenti di microscopia.
  4. In un bio-hood, pipetta 30 ml di 10x tampone fosfatosoluzione ed (PBS) in micro provetta da centrifuga. Aggiungere 6 ml di 1 N di idrossido di sodio (NaOH) in stessa provetta da centrifuga micro e vortex per 15 sec.
  5. Ottenere soluzione coda di ratto collagene I dal frigo e passare al bio-cappa utilizzando tecniche di laboratorio standard e protocolli 29. Assicurarsi che il collagene è ancora freddo. Pipetta 168,3 ml di collagene nella stessa provetta da centrifuga micro.
  6. Successivamente, aggiungere 18 ml di microsfere carbossilato modificato fluorescenti giallo-verde con una pipetta alla stessa provetta da centrifuga micro. Vortex provetta micro con tutte le soluzioni per 30 sec.
  7. Aggiungere 77,7 ml di desideri miscela di cellule media-cell (circa 2 x 10 6 cellule / ml concentrazione) in micro tubo di centrifuga e miscelare con puntale per 20 sec. Se necessario, modificare la densità matrice seguendo la miscela collagene personalizzato adattato per l'aggiunta di perline fluorescenti e tavolo vitalità cellulare (Tabella 1).
  8. Dispensare 300 & #181; l di miscela di collagene-cellule al centro (pozzetto 2 #) del complesso di stampo preparato. Collocare lo stampo su un piatto Petri monouso e spostarlo in un incubatore standard per 20 min a 37 ° C con 5% di CO 2.
  9. Togliere sistema da incubatore e mettere di nuovo in bio-cappuccio. Utilizzando pinze, rimuovere entrambi i vetrini idrofobici fissando sulla parte superiore di ogni vetrino e tirando alto e lontano dallo stampo.
  10. Spostare l'intero sistema alla microscopia e immagine desiderata per assicurare lati dello stampo collagene sono ancora diritto per consentire un gradiente planare diffusione.
  11. Con il sistema ancora sotto il microscopio, utilizzando un 100 microlitri monocanale pipetta, aggiungere 100 ml di supporti cellule nel pozzetto 1 #. Successivamente, utilizzando una 100 pl monocanale pipetta aggiungere 100 ml di media cella con concentrazione chemoattractant desiderato nel bene # 3.
  12. Subito dopo l'aggiunta di soluzioni in entrambi i pozzi, iniziare imaging.

4. Imaging e DiffusioneModellismo

  1. Se si vuole trovare il coefficiente di diffusione per la densità del collagene specifico per calcolare la concentrazione specifica, seguire il protocollo di seguito:
    1. Seguire il protocollo di cui sopra dal titolo "miscela di collagene e 3D Matrix", invece di generare supporti cella con concentrazione chemoattractant desiderata, fare 5 micron rhodamine in un tubo da 15 ml con calcoli e protocolli 30 standard.
    2. Immagine matrici collagene 3D con un sistema confocale montato su un microscopio invertito utilizzando un laser ad argon (488 nm) per catturare la fluorescenza. Immagine ogni 2 o 3 secondi per un massimo di 7 ore.
  2. Per Modeling Diffusione: Usando il modello matematico mostrato di seguito, scrivere un codice software di calcolo per l'elaborazione e l'analisi di questi passaggi generali.
    Equazione 1
    1. Importazione di immagini in software di calcolo per ridimensionamento e normalizzazione da parte della massima intensità. Converti immagini in un colore grigio-mappa dell'immagine per selezionare il bordo. Scegliere un asse lungo il centro dell'immagine, a destra del centro e alla sinistra del centro.
    2. Usando il codice del software di calcolo, tracciare l'intensità normalizzata, insieme con la vera intensità e la differenza tra i due.
    3. Quindi, immettere i parametri necessari per il montaggio (concentrazione, tempo e lunghezza).
    4. Tracciare la concentrazione normalizzata in funzione del tempo e il profilo di concentrazione attraverso l'asse x con un'approssimazione polinomiale ai dati.
    5. Calcolare il coefficiente di diffusione utilizzando il codice software di calcolo.

5. Misure sperimentali

  1. Riferendosi di nuovo alla equazione di diffusione, riscrivere l'equazione per determinare la concentrazione specifica in qualsiasi posizione all'interno del sistema, come mostrato in seguito.
    Equazione 2
    Dove:
    L = Lunghezza del the matrice di collagene
    x = posizione sotto inchiesta
    D = coefficiente di diffusione
    t = tempo trascorso
  2. Durante gli esperimenti di chemiotassi, assicurarsi di registrare il tempo specifico che il momento chemochina è stato aggiunto al sistema. Una volta trovato il movimento migrazione delle cellule, assicurarsi di registrare confocale time-lapse, e prendere nota del tempo specifico e la posizione dal bordo dove si è verificato l'imaging.
  3. Durante l'analisi dei dati, inserire il noto tempo trascorso, la posizione e il coefficiente di diffusione per la cella specifica nell'equazione per trovare la concentrazione specifica normalizzata in qualsiasi punto all'interno del collagene sia per diffusione e esperimenti sulle cellule.

6. Monitoraggio migrazione cellulare Utilizzando TFM

  1. Per monitorare la migrazione delle cellule utilizzando tecniche TFM / DVC seguire il protocollo di seguito:
    1. Dopo l'aggiunta di concentrazione chemoattractant desiderato nel pozzetto 3 #, avviare l'imaging delle matrici di collagene 3D con un sistema confocale montato su un micr invertitaoscope per trovare una cella per indagare.
    2. Una volta che una cellula in movimento viene trovato, posizionare la cella al centro del campo visivo e utilizzare un motore piezoelettrico (all'immagine in asse z), un'immagine ogni 1 o 2 min.
    3. Per calcolare la generazione di forza cellulare e deformazione, generare un codice di calcolo per trovare gli spostamenti delle perline fluorescenza seguenti protocolli TFM / DVC 31.

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Representative Results

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La capacità di questo test per valutare con precisione la migrazione della cella si basa su una buona configurazione del sistema. Pertanto, è fondamentale per fare in modo di progettare lo stampo sistema di diffusione in modo accurato e fare molta attenzione nel porre coprioggetto sia idrofobe e idrofile, come illustrato nella figura 1. Se il sistema è correttamente progettato e durante la fase di modellazione diffusione garantendo trovare molto buona linea di partenza lineare, si è in grado di raggiungere bello fluorescente immagini, come illustrato nella Figura 2, per analizzare diffusione del sistema.

La chiave per un successo analisi chemiotassi cellulare sta modellando la diffusione e risolvendo l'equazione generale diffusione per trovare il coefficiente di diffusione e specifica equazione di concentrazione attraverso un codice generato software di calcolo. Dopo l'importazione delle immagini in un software di calcolo ed esecuzione di analisi (Figura 3), il coefficiente di diffusionepuò essere valutata (Tabella 2). Figura 4 rappresenta trame della diffusione di rodamina attraverso i cinque concentrazioni testate collagene. Le forme della trama diffusione corrispondano la tradizionale forma di un modello di diffusione lineare. Si può notare che la diffusione della rodamina è inversamente proporzionale alla concentrazione di collagene-minore densità collagene più veloce la diffusione. Questo è prevedibile, come questa concentrazione di collagene ha una porosità superiore. Le linee orizzontali nel grafico collagene diffusione ad una concentrazione di 1,5 mg / ml (Figura 4B) sono semplicemente il risultato di oltre saturazione del segnale di tracciante. Ancora più importante, come mostrato in figura 4 ciascuna riga rappresenta un punto specifico (x, y) all'interno del collagene, per mentre il tempo aumenta la concentrazione normalizzata mai supera il punto precedente allo stesso tempo (dt), che indica nessuna inversione della chimica. Questa è una caratteristica importante di un Checamera motaxis per consentire il flusso diretto di un chemoattractant senza flusso inverso.

Esaminando gli ultimi dieci immagini in ogni posizione x, si è in grado di generare un grafico della concentrazione di stato stazionario di rodamina in ciascuna delle posizioni. Estrapolando su tutta la lunghezza del campione (figura 5), si può guardare l'intero campione. Ciò indica che il gradiente di diffusione lineare è costante attraverso l'intera lunghezza del campione, che può essere utilizzato per esperimenti di cellule (Figura 6).

Figura 1
Figura 1: Uno schema di planare gradiente di diffusione sistema complesso di stampo in camera di cellule vive (1) Una resa del computer del sistema completo costituito da: (dal basso all'alto) un alloggiamento inferiore (c) un idrofila 22 millimetri coprioggetto, muffa,. alloggiamento superiore e una copertura in vetro. (2) Dimensioni del mo ld dove (a) gli inserti taglio sono mostrati. (3) Stampo con matrice di collagene con (b) vetrini idrofobici su ogni lato scivolarono negli inserti di taglio per creare il sistema a 3 bene. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: Esempio di immagini di microscopia rodamina in collagene Immagini rappresentative scattate durante gli esperimenti di diffusione rodamina, alla stessa posizione z, nel sistema di diffusione planare gradiente con 1,0 mg / ml concentrazione di collagene.. Barra di scala = 500 micron dove (a) è 0 min (b) 3 min (c) 7 min, e (d) 15 min dopo rodamina è stato aggiunto alla camera. La freccia indica la direzione della diffusione della rodamina attraverso la matrice di collagene.e.com/files/ftp_upload/52948/52948fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Esempio di analisi e sintesi dei calcoli di diffusione generati dal codice del software di calcolo con un 2,5 mg / ml concentrazione di collagene (A) il rendering in bianco e nero iniziale (dt = 0) di caricato nel software di calcolo per l'analisi. (B) punti specifici scelti dall'utente per il confronto dell'intensità e per i calcoli di diffusione (x, asse y sono in pixel). (C) profilo Diffusione rodamina nella matrice di collagene cui ogni riga è correlato ad un punto rosso nell'immagine B. (D) Concentrazione del profilo rodamina nella matrice di collagene allo stato stazionario. (E) Il confronto tra i dati levigate (blue punto) e veri dati da esperimenti di diffusione (punto rosso) con differenza tra levigata e vero (punto verde). (F) la concentrazione normalizzata di vero (punto rosso) e dotato (punto verde) dati dal codice del software di calcolo per tutto l'esperimento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4:. Esempio di profilo di diffusione attraverso matrice di collagene utilizzando il sistema di diffusione gradiente planare in punti diversi Ciascuna riga indica diversi punti dati selezionati scelti dal codice software di calcolo dall'utente. Matrice di collagene ad una densità di (A) 1,0 mg / ml (B) 1,5 mg / ml (C) 2,0 mg / ml (D) 2,2 mg / ml e (E rong>) 2,5 mg / ml. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5:. Esempio di una concentrazione profilo (normalizzata) della rodamina nella matrice di collagene utilizzando il sistema di diffusione gradiente planare all'equilibrio cerchi sono punti dati specifici scelti se il codice del software di calcolo dall'utente. Linea rossa costruito utilizzando punti di dati ed estrapolando migliore line-fit (con valore di R 2 in figura) per mostrare la concentrazione rodamina in tutta la matrice di collagene. Matrice di collagene ad una densità di (A) 1,0 mg / ml (B) 1,5 mg / ml (C) 2,0 mg / ml (D) 2,2 mg / ml e (E) 2,5 mg / ml.2948fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6: Esempio di esperimenti di migrazione cellulare un microscopio Z-fetta di neutrofili migrazione nel sistema piano gradiente 3D.. Neutrofili migra verso il gradiente chemiotattico (freccia bianca raffigura direzione della pendenza e il triangolo mostra il suo profilo di concentrazione), dove la stella indica la posizione iniziale della cella all'inizio dell'esperimento. Subplot mostra cellule nello spazio 3D, dove la freccia indica la prossima direzione time-point. Barra di scala = 10 micron. dt = 5 minuti tra le immagini (ad esempio, AB). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Collagene densità cellulare PBS Perline fluorescenti NaOH Collagene I coda di ratto Media
2,5 mg / ml 10% 6% 2% 70.20% 11.80%
2,2 mg / ml 10% 6% 2% 61.70% 20.30%
2,0 mg / ml 10% 6% 2% 56.10% 25.90%
1,5 mg / ml 10% 6% 2% 42.10% 39.90%
1,0 mg / ml 10% 6% 2% 28.10% 53.90%

Tabella 1: personalizzato cmiscela ollagen adattato per l'aggiunta di perline fluorescenti e la vitalità cellulare.

Concentrazione di Gel collagene Coefficiente di Diffusione (2 cm / sec)
2,5 mg / ml 1.03 x 10 -6 ± 2,54 x 10 -7
2,2 mg / ml 1.28 x 10 -6 ± 3.53 x 10 -7
2,0 mg / ml 6.48 x 10 -6 ± 1,66 x 10 -7
1,5 mg / ml 1,05 x 10 -5 ± 2.04 x 10 -7
1,0 mg / ml 1.39 x 10 -5 ± 1.06 x 10 -7
Acqua 1,50 x 10 -5

Tabella 2: Coefficienti di diffusione.

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Discussion

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Le fasi più critiche per esperimenti di diffusione di successo con o senza cellule sono: impostare correttamente il gruppo di forma; sviluppare la manualità necessaria per evitare danni durante l'estrazione dei vetrini idrofobici; garantendo di trovare una buona linea di partenza lineare per calcolare correttamente il coefficiente di diffusione; correggere i calcoli sperimentali di collagene e chemiotattico; utilizzare correttamente del sistema di imaging cellulare dal vivo per assicurare matrice non si secca; e mantenere una sterile coltura sana.

Nel condurre esperimenti di diffusione, è indispensabile per assicurarsi che le trame di diffusione corrispondano alla forma tradizionale di un modello di diffusione lineare (Figura 4).

Esecuzione analisi a diversi differenti x ubicazioni su ciascun campione, è possibile calcolare i coefficienti medi di diffusione per rodamina nelle varie concentrazioni di collagene, come riportato in Ta ble 2. Questi risultati sono coerenti con precedenti ricerche coefficiente di diffusione attraverso le diminuzioni gel collagene come la concentrazione di collagene è diminuita a causa di un aumento di porosità nella matrice.

Secondo il modello di diffusione equazione a regime, si aspetta di avere un profilo di concentrazione lineare attraverso i valori x. Montando una funzione lineare dei punti, si può vedere che sono tutti, infatti, lineare. Il valore R 2 di montare una linea di tendenza lineare per ciascuna delle rette più appropriate per le tre concentrazioni collagene erano pari o superiori 0,92. Le norme dei residui in tutti i grafici estrapolati erano 0,0227, indicando una buona misura. Questa relazione lineare è d'accordo con la soluzione analitica. La concentrazione non inizia al 100%, come prevedibile, perché imaging non inizia direttamente sul bordo del campione collagene. È anche possibile calibrare perfettamente l'imaging.

_content "> Inoltre, siamo stati in grado di fare riferimento ad altri documenti che consultato la pagina di diffusione in gel per confrontare i risultati. Shenoy e Rosenblatt hanno trovato il coefficiente di diffusione di BSA (raggio = 4 nm) in un / soluzione di collagene succinilata ml 30 mg di essere 2.2 x 10 -7 cm 2 / sec 32. Il raggio di rodamina è 0,78 nm, che spiega il suo tempo di diffusione più velocemente attraverso collagene 24. In studi di diffusione, è comune utilizzare la distanza per confrontare molecole. come raggio aumenta, il peso molecolare aumenta anche. Ramanujan et al. ha trovato il coefficiente di diffusione di destrano (raggio = 6 nm) in polimerizzati 20% gel di collagene (equivalente a 2,0 mg / ml) gel di concentrazione per essere 4,72 x 10 -8 cm 2 / s 24. Ancora una volta, questo è paragonabile al coefficiente di diffusione abbiamo osservato per la 2.0 mg / ml di gel di concentrazione (D = 1,28 x 10 -6 cm 2 / sec), se si tiene conto della differenza di dimensioni molecola. Leddy e Guilak pernoied la diffusione di destrani attraverso cartilagine articolare 33. È possibile confrontare diffusione attraverso matrici di collagene e attraverso cartilagine articolare perché circa due terzi della massa di cartilagine articolare è collagene polimerico (prevalentemente di tipo II). Leddy e Guilak trovato il coefficiente di diffusione di 3 kDa destrano attraverso cartilagine articolare di essere tra 6-10 x 10 -7 cm 2 / s 33. Sapendo che il sistema funziona correttamente siamo stati poi in grado di calcolare la concentrazione specifica qualsiasi punto all'interno del sistema, utilizzando modelli a dente di sega e di trasferimento di calore del sistema transitorio. Questa metrica aggiuntivo può essere utilizzato durante gli esperimenti cellulari per rintracciare comprensione delle cellule-concentrazione e gradiente di pendenza.

Tempo di durata degli esperimenti può essere un fattore limitante quando si utilizza il nostro approccio. Pertanto, è importante utilizzare una copertura per il sistema di cellule vive per assicurare la matrice non si secca. Utilizzando una copertura durante speriments, siamo stati in grado di monitorare con successo la diffusione di rodamina fino a 7 ore e 4 ore durante esperimenti sulle cellule senza il gel prosciugamento. Se non si usa un coperchio, il gel potrebbe asciugarsi più velocemente e incidere in modo significativo la diffusione e la migrazione delle cellule.

Il protocollo qui descritto utilizza un modello planare di diffusione / sistema ben controllato per essere in grado di misurare le forze di cella in un ambiente 3D durante chemiotassi. Presentiamo qui un sistema semplice di nuova concezione che può essere utilizzato per esperimenti TFM / DVC. Utilizzando questo sistema, i ricercatori saranno in grado di: 1) la diffusione successo modello attraverso matrici di collagene 3D e verificare, inserendo i dati a espressione analitica, che il sistema di diffusione planare gradiente, quando seminati con cellule, dovrebbe promuovere chemiotassi e non chemochinesi; 2) calcolare il coefficiente di diffusione per il collagene di cinque concentrazioni diverse; e 3) individuare correttamente la concentrazione specifica del fattore chemiotattico all'interno dicamera di la La fusione. Con questo si avvicina, si può esaminare ulteriormente chemiotassi cella con metriche specifiche non facilmente e prontamente disponibili senza gli approcci laboriose dei sistemi sfaccettate e gradienti di diffusione complessi.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicone elastomer kit Dow Corning Corp 182 SIL ELAST KIT .5KG a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber Live Cell Instrument CM-B18-1 CMB for 18 mm round coverslips
22 mm Glass Coverslip Fisher Scientific NC0180281 Neuvitro Corp. cover slip 22 mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife X-Acto X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778-5ML
Glutaraldehyde Polysciences, Inc 00216A-10 Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube Fisher Scientific 14-432-22 Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass Petri dish Fisher Scientific 08-747A Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15 mm)
Forceps Fisher Scientific 22-327-379 Fine Point Forceps
Cover glasses Fisher Scientific 12-518-105A Rectangle; 30 x 22 mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl Gelest SIT8174.0
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099 Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane Sigma-Aldrich 296090 anhydrous, 95%
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool Lunzer PV-081-3 Straight extended tip scribe, .020" (.50 mm) diameter by .200" (5.0 mm) tip length
Vacuum grease Dow Corning 14-635-5C High-Vacuum Grease
15 ml tube Fisher Scientific 14-959-49D 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10x phosphate buffered solution Fisher Scientific BP399-500 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1 N sodium hydroxide Sigma-Aldrich 38215 Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail BD Biosciences 354236 Rat tail 
Micro centrifuge tube Fisher Scientific 02-681-332 Volume: 2.0 ml;
O.D. x L: 13 x 40 mm;
sterile; single-wrapped
Name Company Catalog Number Comments
Carboxylate-modified microspheres Invitrogen  F-8813 Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine Sigma-Aldrich 83689 Rhodamine B for fluorescence

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References

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Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).More

Stout, D. A., Toyjanova, J., Franck, C. Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix. J. Vis. Exp. (100), e52948, doi:10.3791/52948 (2015).

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