Abstract
세포 외 매트릭스의 조성과 기계적 성질이 조직 유형 사이에서 매우 가변적이다. 이 크게 결합 조직 기질 다이버 영향 셀 동작은 세포 증식, 분화, 접착 시그널링 및 이동 방향을 포함하여 정상 및 병리학 적 과정을 조절한다. 이와 관련하여, 특정 세포 유형의 타고난 능력 durotaxis라고도 단단, 이하 호환 매트릭스 기판을 향해 이동한다. 이 현상은 배아 발생, 상처 복구 및 암세포 침윤 동안 중요한 역할을한다. 여기, 우리는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 기판을 사용하여 시험 관내에서, durotaxis을 연구하는 간단한 분석을 설명합니다. 챔버 durotaxis 설명의 준비는 상대적으로 부드러운 PDMS 젤 단단한 유리 커버 슬립 사이에 강성 인터페이스를 만듭니다. 제공된 예에서, 우리는 cdc42의 역할을 입증하는 이들 durotaxis 챔버를 사용하고 / RAC1는 GTPase 활성 보호 자전거cdGAP에서, mechanosensing 인간 U2OS의 골육종 세포에서 durotaxis 규제. 이 분석은 mechanosignaling과 durotaxis에서 각각의 역할을 탐구하는 다른 세포 유형 및 / 또는 관심의 다른 단백질의 최저에 쉽게 적응할 수있다.
Introduction
세포 외 기질 (ECM)의 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌을 포함하고, 가교 구조 단백질의 복잡한 배열로 구성된다. 이 아니라 ECM 셀룰러 조직 중요한 구조적지지를 제공한다는 확립되어 있지만, 세포가 활발히 세포 생존, 분화 및 세포 이동을 포함한 다양한 세포 과정을 조절하는 그들의 ECM 환경에서 물리적 인 변화에 대응 것을 나타내는 증거가 증가하고있다. 딱딱한 (~ 25 kPa로) 기판 조골 세포 분화를 촉진 한 예를 들어, ECM의 강성 차이는 연질 기판 (~ 1 kPa의) 신경성 계통 촉진과 함께, 서로 다른 계통으로 중간 엽 줄기 세포를 구동 할 수있다. 마찬가지로 기질 매트릭스 강성 증가는 주변 조직에 2,3- 유방 상피 세포 및 종양 침윤을 촉진하는 것으로 나타났다.
이 mechanosign의 특히 흥미로운 양태세포가 더 견고한 기판 4,5- 향해 우선적으로 마이그레이션하는 durotaxis로 알려진 프로세스에서 aling 활동 결과. 세포는 지속적 ECM 결합 인테그린 수용체를 통해 세포 외 환경의 물리적 특성을 감지. 이것은, 차례로, 국소 유착 또는 초점 콘택트 -6,7-라고도 접착제 구조의 형성을 구동 할 그들의 세포질 도메인 수많은 구조 및 시그널링 단백질의 축적을 촉진한다. 인테그린이 더 고유의 효소 활성이 없기 때문에, 신호는 변화하는 환경에 8 셀의 응답을 조정하기 위해 이러한 액세서리 단백질을 통해 ECM에서 릴레이됩니다. 따라서, mechanosignaling durotaxis 및 조절에 관여하는 주요 단백질의 동정 및 특성 규명은 수사의 중요한 영역이다.
다양한 모델 시스템 durotaxis 관내 연구 개발되어 왔지만, 대부분은 할이용 콜라겐 코팅 된 폴리 아크릴 아미드 기판 (4). 그러나, 폴리 아크릴 아미드의 기판의 제조는 기술적으로 어려울 수 있으며, 상기 분석 방법에 사용되는 콜라겐은 기판 (9)와 화학적으로 가교되어야한다. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 기판은 폴리 아크릴 기판 (10)에 필적하는 기계적 성질을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그러나, PDMS 기판을 간단히 가교제 염기의 혼합 비율에 의해 제조되며, 이러한 기판은 이에 PDMS 세포 행동에 강성의 영향을 연구하기 쉬운 도구를 만드는 화학적 가교의 필요성없이 ECM 단백질로 코팅 될 수있다. 여기서, 우리는 부드러운 PDMS 기판이 경질 유리 커버 슬립과 통합되는 간단한 durotaxis 실을 준비하는 방법에 대해 설명합니다.
분석은, 아래에 설명 된대로, durotaxis을 연구하는 빠르고 간단한 방법을 제공합니다. 이 연구를 위해 우리는 siRNA를 매개로 결합 된 인간의 U2OS의 골육종 세포를 사용cdGAP의 최저은 durotaxis (11)이 초점 접착 단백질의 역할을 연구합니다. 중요한 것은,이 프로토콜은 개별적인 요구에 쉽게 적응 될 수있다. 다른 유형의 세포는 U2OS 세포를 대체 할 수 있고, 어떤 단백질은 뜨거나 durotaxis 동안 셀의 동작에 미치는 영향을 결정하기 과발현 될 수있다. 더욱이,이 프로토콜은 역학 거동 사용 FRAP 또는 접근법 FRET을 분석 형광 태그로 단백질을 포함하도록 구성 될 수있다.
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Protocol
Durotaxis 챔버 1. 준비
- 하나의 6- 웰 조직 배양 플레이트를 준비하기 위해, 50ml의 원뿔형 튜브 용기를 설정. 50ml의 튜브에서 PDMS 염기 용액의 약 10g을 칭량 (솔루션은 매우 점성).
- 90 : 1 기판 (1 ~ kPa로의 적합성), 필요에 가교 결합제 용액의 정확한 양을 결정 (90)에 의해 튜브에 PDMS 염기 용액의 중량을 측정 나눈다. 같은 튜브에 PDMS의 가교제 용액의 계산 된 금액을 추가합니다.
예 : 10g / 90 = 0.11 G. PDMS 염기 용액에 PDMS 가교제 용액 0.11 g을 추가한다.
참고 : 기본 및 가교제 솔루션은 모두 PDMS 키트에 제공됩니다. - 격렬 작은 주걱을 사용하여 실온에서 5 분 동안 PDMS 기재 / 가교 결합제의 혼합물을 혼합한다. 이 단계에서 혼합물을 공기 방울 다수를 포함 할 것이다.
- BUB을 제거하기 위해 실온에서 50 XG에 5 분 동안 벤치 탑 원심 분리기에서 PDMS 기판을 원심 분리기bles. 이 경우 여전히 다시 5 분, 원심 분리 후 거품.
- 90 피펫 1ml의 : 조직 배양의 각 웰에 1 PDMS 기판은 6 웰 플레이트를 처리 하였다. PDMS에 존재하는 임의의 잔류 기포는 21 G 바늘을 사용하여 팝핑함으로써,이 단계에서 제거 될 수있다. PDMS가 아니라 30 분 동안 전파하도록 허용합니다.
- 종기 12mm 유리 # 5 분간 증류수 1 커버 슬립. 두 번 반복하고 증류수 된 커버를 저장합니다.
- 부드럽게 한 후 PDMS에 커버 슬립을 드롭 PDMS 솔루션에 coverslip에의 한 쪽을 터치하여 조직 배양 플레이트의 각 웰에 하나, 건조 coverslip에 배치합니다. 커버 슬립이 침전으로, PDMS는 커버 슬립의 가장자리를 통해 잠식하기 시작하지만, 완전히 포함되지 않습니다. 이것은 (, B를 그림 1A 참조) 경화 후 PDMS와 유리 사이의 인터페이스를 생성합니다.
- PDMS를 치료 (경화) 16 시간 동안 오븐에서 70 ° C에서 접시를 품어. 작은지면 배치세포 배양 후드에서 UV 및 E를 10 분 동안 살균.
참고 : 사용의 몇 일 이내에 판을 만드는 것이 가장 좋습니다. 그러나 판은 버퍼없이 파라 필름에 싸여과 품질에 띄는 감소없이 최대 2 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다.
2. 셀 도금
주 : siRNA를 매개 녹다운의 효과를 연구하는 경우, 제조자의 지시 나 선택의 세포 유형에 대한 최적의 프로토콜을 이용하여 최저을 수행한다.
- 각 코트는 37 ℃에서 1 시간 동안 칼슘 및 마그네슘이없는 / ml의 PBS에 피브로넥틴을 10 μg의 1 ml의 챔버 durotaxis. 대안 적으로, 피브로넥틴은 4 ℃에서 16 시간 동안 / ml의 PBS에 피브로넥틴을 10 μg의 PDMS와 인큐베이션하여 분석 전에 일을 적용 할 수있다. 전체 표면을 PBS 용액에 피브로넥틴에 빠져들되어 있는지 확인합니다.
- 열 변성 1 % BSA를 준비합니다. 0.5 g의 무게 BSA 및 PBS 50 ㎖에 용해.필터는 12 분 동안 80 ℃에서 0.22 ㎛의 필터와 열교환을 통해 살균 용액.
참고 :이 솔루션 4 ℃에서 도금 및 저장 셀하기 전에 하루를 준비합니다. - 피브로넥틴 솔루션을 기음과 PBS로 3 회 반복한다. 각 웰에 PBS에 열 변성 BSA 1 ㎖를 추가하고 실온에서 30 분 동안 품어.
- durotaxis 챔버가 열 변성 BSA로 차단하는 동안를 Trypsinize 및 선택의 세포를 계산합니다.
- 플레이트 원하는 특정 세포 유형에 필요한 매체를 사용 durotaxis 챔버의 각 웰에 2 ㎖를 1 × 105 세포. 세포 부착 및 5 % CO 2, 37 ℃에서 가습 된 배양기에서 4 시간 동안 기판에 도포 할 수있다.
주 : U2OS 세포는 일상적 2 mM L- 글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 10 IU / ml의 페니실린, 10 μg의 / ml의 스트렙토 마이신이 보충 된 10 % FBS DMEM으로 유지된다.
주 :이 예에서 사용되는 세포 수에 최적화U2OS 세포. 다른 유형의 세포에 대한 최적화가 요구 될 수있다. 이 밀도는 세포를 다른 세포와 중요한 상호 작용없이 마이그레이션 할 수있는 충분한 공간을 제공합니다.
3. 라이브 셀 이미징
- 10X 목표와 위상 콘트라스트를 사용하여, 거꾸로 현미경에 라이브 세포 이미징을 수행합니다. 현미경은 장기 촬상 동안 37 ℃ 온도의 제어 및 5 % CO 2 있도록 밀폐 환경, 습한 챔버가 장착되어야한다.
- 세포를 약 3.5 시간 동안 분산 한 후, 현미경 실 플레이트를 조립한다. 샘플 (S)이 30 분 동안 챔버에서 평형화 허용한다.
- 가능한 경우 현미경에 방문 자동화, 멀티 포인트를 설정합니다. (90) 사이의 인터페이스에 초점 : 1 PDMS와 유리 coverslip에 모든 durotaxis 챔버 당 40 점의 평균과의 인터페이스 주위에 이미지에 포인트를 선택합니다. 이미지 셀 최대 16 시간 동안 매 10 분.
참고 : 재관심의 기온은 커버 슬립의 가장자리와 PDMS와 커버 슬립 사이의 실제 인터페이스에 대응하는 내부 라인에 해당하는 외부 줄, 두 줄로 표시됩니다. 그림 1B를 참조하십시오.
4. 데이터 분석
- 표 1과 같은 스프레드 시트를 생성한다.
- 생성 된 각각의 동영상에서 유리 표면과 그 반대로 PDMS에서 교차 이벤트의 수를 카운트. 엑셀 스프레드 시트의 해당 열에 교차 이벤트의 수를 기록한다.
주 : 교차 이벤트가 어느 한 방향으로 PDMS와 유리 사이의 경계 위에 전달 세포핵으로 정의된다. - 다중 교차를 정량화하기 위해, 셀은 인터페이스 교차 회수를 카운트. 그 숫자는 셀이 영화의 단부에 위치 된 기판 상에 대응하는 엑셀 열에 기록되어야한다. t의 인터페이스를 가로 지르는 모든 셀에 대한 분석을 반복그는 영화. 촬영하는 동안 시야에서 마이그레이션 세포를 제외합니다.
주 : 세포가 피브로넥틴 - 코팅 된 PDMS와 유리 커버 슬립의 표면에 균일하게 부착 할 수있는 것을, 실험의 초기에 셀 카운팅함으로써 확인하는 것이 중요하다. - 유리 표면 (즉, durotaxis을 시행)에 PDMS에서 마이그레이션 세포의 비율을 계산합니다. 소프트에서 하드 및 교차 이벤트의 총 수에 의해 하드 및 분할에 끝났 여러 교차 이벤트에 이벤트를 건너의 수를 추가합니다.
- 교차점의 총 수에 의해 다중 교차의 수를 분할하여 복수의 횡단의 비율을 계산한다.
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Representative Results
durotaxis 챔버의 개략도는도 1a에 도시되어있다. 소프트 PDMS 기판 (90 : 솔루션 가교제 PDMS 기재 1 혼합물)을 6 웰 접시에서 확산되고 유리 커버 슬립시켜 인터페이스를 생성하고 부분적으로 커버 슬립의 상부 표면을 덮는 PDMS, 위에 배치되는 다른 준수의 두 기판 사이. 소프트 PDMS 기판의 강성은 유리의 강도가 약 1 GPa의 1-2 반면, 뇌 조직의 일반적인 적합성에 필적 ~ 1 kPa로한다. PDMS와 유리 사이의 계면의 위상차 이미지는도 1b에 흰색 화살표 머리로 나타낸다. 별표는 열심히 기판으로 마이그레이션하는 두 개의 제어 RNAi의 세포를 나타낸다. 알 수있는 비정형 가장자리 (검은 화살표)은 커버 슬립의 에지에 대응한다.
데이터를 정량화하기 위해, 마이크로 소프트 엑셀 스프레드 시트를 표 1과 같이 생성한다 </ strong>을. 교차 이벤트의 수를 카운트하고, 해당 열이 구성되어야한다. 생성 된 동영상의 일부가 정량화에 사용 할 수 없다. 세포의 진행을 방해하거나 PDMS에 거품이 존재하는 경우는 영화 부량에서 생략 될 수있다 세포가 너무 조밀하게 할 경우, 과감 셀 방향성에 영향을 미칠 수있는 충돌의 결과. 이 또한 명백히 세포의 움직임에 영향을 미칠 수있는 세포 분열도 모니터링해야합니다.
일반적으로, 대부분의 부착 세포 유형은 우선적으로 딱딱한 기판 2,4,12으로 마이그레이션합니다. 세포가 자신의 환경에서 기계적인 단서에 반응하는 분자 메커니즘을 이해하기 시작하려면 특정 단백질의 siRNA를 이용하여 무너 뜨렸다 수 있습니다. 이 예에서, 제어 siRNA를 처리 한 세포의 약 70 %가 durotaxis도 2a를 나타냈다. cdGAP가 RNAi의를 사용 녹다운 될 때, 현저히 대조, 세포가 더 선호 없었다여부에 그들이 하드 또는 소프트 기판 그림 2A에 마이그레이션. 제어 siRNA를 처리 한 세포는 일반적으로 단 한번 경계를 넘어도 2B 반면 또 cdGAP 녹다운 세포는 경계 여러 번 교차. 제어 siRNA의 세포의 대표 트랙은 세포가 일반적으로 하나의 강성에 대한 환경을 설명하고 경계 여러번도 2C 교차하지 cdGAP siRNA를 처리 한 세포에 비해 일단 우선적가 더 단단한 표면에 머물렀다 경계를 넘어 이동을 보여준다.
설정 Durotaxis 챔버의 그림 1. 도식. (A) 소프트 PDMS는 6 잘 접시의 각 웰에 확산되고 유리 커버 슬립은 PDMS의 상단에 배치됩니다. PDMS는 BEF, 커버 슬립의 상단의 측면을 통해 잠식한다그것은, 경화 두 기판 사이의 계면을 형성하는 광석. Durotaxis는 PDMS / 유리 인터페이스를 횡단하는 세포의 지향성을 처치에 의해 결정된다. (B) 경질 연질 PDMS와 유리 기판 사이의 계면을 보여주는 대표적인 위상차 이미지. 별표 durotaxis를 겪고 제어 RNAi의 처리 U2OS 세포를 보여줍니다. 흰색 화살촉은 PDMS와 유리 coverslip에 화살표 사이의 인터페이스는 PDMS에서 유리 커버 슬립의 가장자리를 나타냅니다 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. Microsoft Excel 스프레드 시트의 도식이 설정합니다. 열이 영화 번호를 포함하도록 설립, siRNA를이 사용 소프트 PDMS에서 마이그레이션 세포의 수경질 유리 기판 또는 그 반대뿐만 아니라 분석 된 세포의 총 수. 열은 또한 인터페이스를 여러 번 건너 소프트 PDMS 또는 유리 기판 중 하나에 끝 셀에 설정되어 있습니다. 셀 경계가 여러 번에 걸쳐 이주되면 이들 세포의 다수의 교차 이벤트의 수는 셀이 영화의 단부에 위치 된 때, 기판의 열에서 기록된다.
U2OS 세포에서 cdGAP의도 2는 durotaxis 최저의 손실을 야기한다. cdGAP siRNA를 처리 한 세포는 임의의 선호를 나타내지 않은 반면 (A) 대조군 siRNA를 처리 한 세포는, 경질 유리 기판 상에 우선적으로 이동한다. (B) 제어 siRNA를 처리 한 세포는 한 번 PDMS와 유리 사이의 경계를 넘어. 그러나 cdGAP RNAi의 처리 세포를 앞뒤로 B에서 마이그레이션oundary 여러 번. 대표 셀 (C) 트랙 중 하나를 제어로 처리, 또는 cdGAP의 siRNA는 ImageJ에에서 수동 추적 플러그인을 사용하여 생성되었다. P-값 학생의 t-test를 이용하여 측정하고, 오차 막대는 95 % 신뢰 구간을 나타낸다. Wormer 등. 2014 (11)의 허가에 의해 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 세포를 마이그레이션하는 durotaxis을 연구하는 간단한 분석을 설명합니다. 이 분석의 주요 장점은 PDMS를 사용 durotaxis 챔버 제조의 용이성이다. 기판의 강성을 용이하게 분석에서 다양한 강성의 연구를 허용하도록하기 위해 가교제 PDMS 염기 용액의 비율을 변경함으로써 조작 될 수있다. 그러나, 시스템의 하나의 잠재적 인 한계는 더 정교한 시스템 (4)에 의해 제공되는 강도 구배를 발생 반대로 세포 만 기판에 단일 강성 변화에 노출된다는 것이다. 중요하게는, 폴리 아크릴 아미드의 기판과는 달리, ECM 성분은 화학적으로 가교 결합 된 PDMS에있을 필요가 없다. 피브로넥틴 (11)에 특이적인 항체로 염색에 의해 결정되는 바와 같이 실제로, 피브로넥틴 코팅은 PDMS와 유리의 양면에 거의 동등하다. 이전의 연구는 세포가 어느 PDMS 기판이나 폴리 아크릴 아미드, 사용 O에 동일하게 동작하는 것이 도시 했으므로기판 (F) PDMS 세포 (10, 12)에 mechanotransduction을 연구와 훨씬 쉽게 모델을 제공합니다.
PDMS 기판의 제조에서 가장 중요한 단계는베이스 및 가교 결합제 용액이 완전히 혼합되도록한다. 그들이 충분히 혼합되지 않는 경우, 기판은 완전히 열처리시 경화하지 않는다. 이 커버 슬립은 PDMS로 너무 멀리 침몰 또는 커버 슬립 이미징 동안 PDMS에 표류가 발생합니다. 원심 력이 너무 높으면, 기재와 가교제 용액 튜브에 분리 할 수도있다. 이는 원심 분리 속도를 감소시킴으로써 또는 진공 챔버를 사용하여 30 분 동안 혼합물을 탈기함으로써 해결 될 수있다. 마지막으로, 세포 밀도가 너무 많은 세포가 자신의 능력을 완전히 확산하고 이웃 세포와 접촉에 의해 방해받지 않고 durotax에 영향을 미칠 것 같이 중요하다. 본원에보고 된 밀도는 U2OS 세포에 대해 최적화되었다. 그러나, 다른 세포 유형을 사용하는 경우, 최적 CELL 번호는 경험적으로 결정되어야 할 것이다.
우리는 최근에 단백질 cdGAP 신호 초점 접착 mechanosensing을 조절하고 11 durotaxis 방법을 연구하기 위해이 분석을 사용했다. 15 - 분명히, 이러한 durotaxis도 13의 조절에 기여 따라서 기계적 시그널링에 관련되고, 세포 골격 요소, 단백질 매매 성분과 이온 통로와 같은 국소 유착 이외에도 수많은 세포 성분이있다. 이들 각 구성 요소는 용이하게 유사한 RNAi의 접근법을 사용하여 우리의 시스템에서 평가 될 수있다. 또한,이 분석은 다양한 약리학 적 활성제 또는 억제제의 도입에 매우 의무이다. 분석법은 또한 단백질과 역학 시공간 활성을 연구하기 위해, 또는 FRET FRAP 방법과 조합하여 이러한 형광 태그로 단백질의 혼입 분석의보다 정교한 형태를 허용하도록 구성 될 수있다.
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Acknowledgments
이 작품은 NIH R01 GM47607, CA163296 및 CET에 NSF 1,334,493에 의해 지원됩니다. 우리는 원고의 중요한 읽기 터너 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 보고서에 표시된 모든 데이터는 Wormer 등. 2014 (11)의 허가에 의해 재현되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12 mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
References
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