מערכת פשוטה לסלולרי הערכת Mechanosensing וDurotaxis Published: August 27, 2015 doi: 10.3791/52949

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Gregory J. Goreczny¹, Duncan B. Wormer¹, Christopher E. Turner¹

¹Department of Cell & Developmental Biology, SUNY Upstate Medical University

Abstract

מאפייני הרכב ומכאני של מטריקס הם משתנה מאוד בין סוגי רקמות. גיוון זה חיבור סטרומה הרקמה מאוד תא השפעות התנהגות להסדיר תהליכים נורמלים ופתולוגיים כוללים התפשטות תאים, התמיינות, איתות הידבקות והגירה כיוונית. בהקשר זה, היכולת המולדת של סוגים מסוימים של תאים לנדוד לכיוון מצע מטריצה ​​נוקשה, פחות או תואם נקרא durotaxis. תופעה זו ממלאת תפקיד חשוב בהתפתחות עוברית, תיקון פצע ופלישה של תאים סרטניים. כאן אנו מתארים assay פשוט ללמוד durotaxis, במבחנה, באמצעות polydimethylsiloxane מצעים (PDMS). הכנת תאר durotaxis תאים יוצרת ממשק בין נוקשות ג'ל PDMS הרך יחסית וcoverslip זכוכית נוקשה. בדוגמא בתנאי, השתמשנו תאי durotaxis אלה להפגין תפקיד לCdc42 הגנה של מחזור / Rac1 GTPase הפעלהב, cdGAP, בmechanosensing וdurotaxis רגולציה בתאי אוסטאוסרקומה U2OS אנושיים. assay זה הוא בקלות להתאמה לסוגי תאים אחרים ו / או מציאה של חלבונים אחרים של אינטרסים לחקור התפקידים שלהם בmechanosignaling וdurotaxis.

Introduction

מטריקס (ECM) מורכב ממערך מורכב של חלבונים מבניים וcrosslinking כולל קולגן, פיברונקטין וlaminin. למרות שזה מבוסס היטב כי ECM מספק תמיכה מבנית חשובה לרקמות סלולריות, יש ראיות גוברים למצביעות על כך שתאים באופן פעיל להגיב לשינויים פיזיים בסביבת ECM להסדיר תהליכים תאיים שונים כולל הישרדות תא, התמיינות ונדידת תאים. לדוגמא, הבדלים בקשיחות של ECM יכולים לנהוג בתאי גזע mesenchymal כלפי שושלות שונות, עם מצעים רכים (~ 1 kPa) קידום שושלות עצביות בעוד מצעים נוקשה (~ 25 kPa) לקדם בידול osteogenic ^1. כמו כן, עלייה בקשיחות מטריצת סטרומה הוכחה לקדם tumorigenesis החלב אפיתל תאים ופלישה ^ל2,3 הרקמה הסובב.

היבט מעניין במיוחד של mechanosign זהתוצאות פעילות aling בתהליך המכונה durotaxis, שבו תאים לנדוד מועדף כלפי מצע קשיח יותר ^4,5. תאים לחוש כל הזמן את המאפיינים הפיזיים של הסביבה תאית שלהם באמצעות קולט integrin מחייבים את ECM. זה, בתורו, מקדם את ההצטברות של חלבונים מבניים ואיתות רבים לתחומים cytoplasmic לנהוג ההיווצרות של מבנים דבקים הידועים כהידבקויות מוקד או אנשי קשר מוקדי ^6,7. מאז יש לי integrins אין פעילות האנזימטית טבועה, אותות מועברים מECM דרך חלבוני אבזר אלה כדי לתאם את התגובה של התא לסביבה המשתנה שלהם ^8. בהתאם לכך, זיהוי והאפיון של חלבוני מפתח מעורבים בויסות mechanosignaling וdurotaxis הוא אזור חשוב של חקירה.

מערכות מודל שונות פותחו כדי ללמוד durotaxis במבחנה, אך רוב יש לימצעים מנוצלים מצופה קולגן polyacrylamide ^4. עם זאת, ההכנה של מצעי polyacrylamide יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית וקולגן המשמש במבחנים אלה חייב להיות כימיים crosslinked למצע ^9. Polydimethylsiloxane מצעים (PDMS) הוכחו תערוכה תכונות מכאניות דומות למצעי polyacrylamide ^10. עם זאת, מצעי PDMS מוכנים על ידי ערבוב פשוט יחס של הבסיס לcrosslinker ויכולים להיות מצופים מצעים אלה עם חלבוני ECM ללא הצורך בcrosslinking הכימי, ובכך PDMS כלי קל יותר לחקור את ההשפעות של נוקשות בהתנהגות תא. בזאת, אנו מתארים כיצד להכין קאמרי durotaxis פשוט שבמצע PDMS רך משולב עם coverslip זכוכית נוקשה.

Assay, כמפורט להלן, מספק שיטה מהירה ופשוטה ללמוד durotaxis. במחקר זה השתמשנו בתאים אנושיים אוסטאוסרקומה U2OS בשילוב עם תיווך siRNAמציאה של cdGAP כדי ללמוד את התפקיד של חלבון הידבקות מוקד זה בdurotaxis ^11. חשוב לציין, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לדרישות פרט. סוגי תאים אחרים יכולים להחליף את תאי U2OS וכל חלבון יכול להיות הפיל או ביטוי יתר כדי לקבוע את ההשפעות על התנהגות תא במהלך durotaxis. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשלב חלבונים מתויגים fluorescently לנתח את הדינמיקה שלהם וFRAP באמצעות התנהגות או סריג גישות.

Protocol

1. הכנת לשכות Durotaxis

1. כדי להכין צלחת תרבית רקמת 6-גם אחד, הטרה האיזון עם צינור חרוטי 50 מ"ל. לשקול את כ -10 גרם של פתרון PDMS הבסיס בצינור 50 מ"ל (הפתרון הוא די צמיג).
2. ל90: מצע 1 (Compliance של ~ 1 kPa), לחלק את המשקל שנמדד של פתרון בסיס PDMS בצינור ב -90 כדי לקבוע את הסכום הנכון של פתרון crosslinker צורך. מוסיף את הכמות המחושבת של פתרון crosslinker PDMS לאותו צינור.
   לדוגמא: 10 גר '/ 90 = 0.11 גרם. להוסיף 0.11 גרם של פתרון crosslinker PDMS לפתרון בסיס PDMS.
   הערה: פתרונות הבסיס וcrosslinker שניהם מסופקים בערכת PDMS.
3. במרץ לערבב את תערובת הבסיס / crosslinker PDMS 5 דקות בRT בעזרת מרית קטנה. בשלב זה התערובת תכיל מספר רב של בועות אוויר.
4. צנטריפוגה מצע PDMS בצנטריפוגה benchtop במשך 5 דקות ב 50 XG ב RT להסיר את bubbles. אם עדיין יש בועות לאחר 5 דקות, צנטריפוגות שוב.
5. 1 פיפטה מיליליטר של 90: 1 מצע PDMS לבאר כל תרבית הרקמה שטופל 6-גם צלחת. ניתן לבטל את כל בועות אוויר שנותרו כיום בPDMS בשלב זה על ידי פקיעתם באמצעות מחט 21 G. לאפשר PDMS להפיץ למשך 30 דקות בבאר.
6. רתיחה # זכוכית 12 מ"מ 1 coverslips במים מזוקקים למשך 5 דקות. חזור על שתי פעמים ולאחסן את coverslips במים מזוקקים.
7. מקום אחד coverslip מיובש, לבאר כל צלחת תרבית הרקמה על ידי בעדינות נוגע בצד אחד של coverslip לפתרון PDMS לאחר מכן שחרר את coverslip PDMS. כcoverslip מתיישב, PDMS יתחיל לנגוס על הקצוות של coverslip, אבל לא יכסה אותו לחלוטין. זה יפיק ממשק בין PDMS והזכוכית לאחר הריפוי (ראה איור 1 א ', ב').
8. דגירה את הצלחת על 70 מעלות צלזיוס בתנור במשך 16 שעות כדי לרפא (להקשיח) PDMS. מניחים את פלאטדואר בשכונת תרבות התא וUV לעקר במשך 10 דקות.
   הערה: עדיף לעשות את הצלחות בתוך כמה ימים של שימוש. עם זאת, הצלחות יכולות להיות עטופות בParafilm ללא כל חיץ ומאוחסנות ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות ללא כל ירידה מורגשת באיכות.

2. תא ציפוי

הערה: אם בוחן את ההשפעה של מציאה בתיווך siRNA, לבצע את מציאה באמצעות הוראות היצרן או הפרוטוקול מותאם לסוג התא של בחירה.

1. מעיל כל durotaxis קאמרי עם 1 מיליליטר של 10 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין בPBS ללא סידן ומגנזיום לשעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. לחלופין, פיברונקטין ניתן להחיל היום לפני ניתוח על ידי דוגרים PDMS עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין בPBS במשך 16 שעות על 4 מעלות צלזיוס. ודא את כל פני השטח הוא שקוע בפיברונקטין בפתרון PBS.
2. הכן BSA 1% חום מפוגל. שוקל 0.5 גרם BSA ולפזר אותו ב 50 מיליליטר של PBS.סנן לעקר את הפתרון דרך פילטר וחום 0.22 מיקרומטר על 80 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות.
   הערה: הכן את הפתרון הזה ביום שלפני תא ציפוי ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
3. לשאוב את פתרון פיברונקטין ולשטוף 3 פעמים עם PBS. הוסף 1 מיליליטר של BSA-מפוגל חום בPBS לכל היטב דגירה במשך 30 דקות ב RT.
4. Trypsinize ולספור תאים של בחירה תוך תאי durotaxis חוסמים עם BSA החום מפוגל.
5. צלחת 1 x 10 ⁵ תאים בנפח של 2 מיליליטר לכל טוב של חדר durotaxis, באמצעות התקשורת הנדרשת לסוג תא המסוים של בחירה. אפשר התאים לדבוק ולהתפשט על המצע במשך 4 שעות בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.
   הערה: תאי U2OS נשמרים באופן שיגרתי בDMEM עם 10% FBS, בתוספת L- גלוטמין 2 מ"מ, פירובט נתרן 1 מ"מ, ו -10 IU / פניצילין מיליליטר, 10 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין.
   הערה: מספר התאים המשמש בדוגמא זו היא מותאמת לתאי U2OS. ייתכן שתהיה צורך אופטימיזציה לסוגי תאים אחרים. צפיפות זה נותנת את התאים מספיק מקום להעביר ללא אינטראקציות משמעותיות עם תאים אחרים.

הדמיה 3. Live- תא

1. לבצע הדמיה תא חי על מיקרוסקופ הפוכה, באמצעות ניגוד שלב עם מטרת 10X. מיקרוסקופ צריך להיות מצויד עם תא humidified, סגור סביבתי, המאפשר שליטה על הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ במהלך הדמיה לטווח ארוך.
2. אחרי התאים התפשטו לכ 3.5 שעות, להרכיב את הצלחת בתא מיקרוסקופ. לאפשר המדגם (ים) לאזן בתא למשך 30 דקות.
3. הגדר את ריבוי נקודות אוטומטיות, ביקור במיקרוסקופ אם זמין. דגש על הממשק שבין 90: 1 PDMS וcoverslip הזכוכית ולבחור נקודות לתמונה בכל רחבי הממשק עם ממוצע של 40 נקודות לdurotaxis קאמרית. תמונת התאים כל 10 דקות עד 16 שעות.
   הערה: מחדשגיון של עניין יופיע כשני קווים, עם הקו החיצוני המקביל לקצה של coverslip והקו הפנימי המקביל לממשק בפועל בין PDMS וcoverslip. ראה איור 1.

ניתוח נתונים 4.

1. צור גיליון אלקטרוני כמו בטבלה 1.
2. לספור את מספר אירועי מעבר מPDMS למשטח הזכוכית ולהיפך מכל סרט שנוצר. רשום את מספר אירועי מעבר בעמודה המתאימה בגיליון האלקטרוני Excel.
   הערה: אירוע מעבר מוגדר כגרעין התא עובר על הגבול בין PDMS והזכוכית בכל כיוון.
3. כדי לכמת מעברים מרובים, לספור את מספר הפעמים שהתא חצה את הממשק. מספר זה צריך להיות מוקלט בעמודת Excel המתאימה למצע שעליו התא היה ממוקם בסוף הסרט. חזור על הניתוח לכל תא שחוצה את הממשק בtסרטו. תכלול תאים שנודדים משדה הראייה במהלך הדמיה.
   הערה: חשוב גם כדי לוודא, על ידי תא לספור בתחילת הניסוי, שהתאים מסוגלים לדבוק באותה מידה לPDMS מצופה פיברונקטין ומשטחי הזכוכית coverslip.
4. לחשב את אחוז התאים שהגרו מPDMS למשטח הזכוכית (כלומר, עבר durotaxis). הוסף את מספר חציית אירועים מרכים לקשה ואירועי המעבר המרובים שהסתיימו ביום קשה ולחלק במספר הכולל של אירועי מעבר.
5. חישוב אחוזי המעברים מרובים על ידי חלוקת מספר המעברים מרובים במספר הכולל של מעברים.

Representative Results

סכמטי של תא durotaxis מוצג באיור 1 א. מצע PDMS רך (90: תערובת 1 של בסיס PDMS לcrosslinker פתרונות) היא להפיץ בצלחת 6 היטב וcoverslip זכוכית מונח על גבי PDMS, אשר לאחר מכן באופן חלקי מכסה את פני השטח העליונים של coverslip, ובכך ליצור ממשק בין שני מצעים של ציות שונה. הקשיחות של מצע PDMS הרך היא ~ 1 kPa, אשר ניתן להשוות העמידה הטיפוסית של רקמת המוח, ואילו את הנוקשות של זכוכית היא סביב 1-2 ¹ GPA. תמונה בניגוד שלב של הממשק בין PDMS והזכוכית מוצגת על ידי ראשי החץ הלבנים באיור 1. הכוכביות לציין שני תאי RNAi השליטה נודדים לכיוון המצע קשה יותר. הקצה המשונן שניתן לראות (החץ שחור) מתאים לקצה coverslip.

כדי לכמת את הנתונים, גיליון אלקטרוני של Microsoft Excel צריך להיות שנוצר כבטבלת 1 </ Strong>. מספר אירועי מעבר צריך לספור ומאורגן בעמודה המקבילה. חלק מהסרטים שנוצרו לא ניתן להשתמש לכימות. סרט עשוי להיות מושמט מכימות אם יש בועה בPDMS שמפריעה להתקדמות תאים או אם התאים צפופים מדי, וכתוצאה מכך התנגשויות שיכולות באופן דרסטי להשפיע יווני תא. גם חלוקת תא צריכה להיות במעקב, כמו זה יכול גם להשפיע באופן גלוי תנועת תא.

בדרך כלל, סוגים חסיד ביותר תא מעדיפים להגר לכיוון מצע נוקשה ^2,4,12. כדי להתחיל להבין את המנגנון המולקולרי שבאמצעותו תאים מגיבים לרמזים מכאניים בסביבתם, ניתן הפילו את החלבונים ספציפיים באמצעות siRNA. בדוגמא שלנו, כ -70% מהתאים שטופל siRNA השליטה הציגו durotaxis איור 2 א. בניגוד בולט, כאשר cdGAP היה הפילה באמצעות RNAi, התאים לא היו העדפהבאשר לשאלה האם הם היגרו אל איור 2 א מצע הקשה או רך. יתר על כן, תאי מציאה cdGAP חצו את הגבול מספר פעמים, ואילו תאים שטופלו השליטה siRNA בדרך כלל רק חצו את הגבול פעם אחת, איור 2. מסלולי נציג של תאי siRNA שליטה מראים כי התאים בדרך כלל להעביר מעבר לגבול פעם אחת ומעדיף נשאר על פני השטח נוקשה יותר בהשוואה לתאים שטופלו siRNA cdGAP שלא להפגין העדפה או נוקשות וחצו את הגבול מספר פעמים איור 2C.

איור 1. סכמטי של תא Durotaxis להגדיר. () רך PDMS הוא התפשט בכל טוב של צלחת 6 היטב וcoverslip זכוכית מונח על גבי PDMS. PDMS יהיה לנגוס על צידו העליון של coverslip, קודםבצר שהוא מתקשה, כדי ליצור ממשק בין שני מצעים. Durotaxis נקבע על ידי הבקיע יווני של התאים חוצים את ממשק PDMS / זכוכית. תמונה בניגוד שלב נציג מראה את הממשק בין PDMS הרך ומצע זכוכית קשיח (B). הכוכביות להראות תאי U2OS שליטה טופל RNAi עוברים durotaxis. ראשי החץ הלבנים מציינים את הממשק בין PDMS וcoverslip זכוכית והחץ מציין את קצה coverslip הזכוכית תחת PDMS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלת 1. להגדיר סכמטי של גיליון אלקטרוני של Microsoft Excel. עמודות הוקמו לכלול את מספר הסרט, המשמש siRNA, מספר התאים שהגר מPDMS הרךלמצע קשיח זכוכית או להיפך, כמו גם את המספר הכולל של תאים נותחו. עמודות גם להגדיר עבור התאים החוצים אותו מספר פעמים ובסופו הממשק משני PDMS הרך או מצע הזכוכית. אם תא נודד על פני מספר רב של פעמים הגבול, מספר אירועי מעבר המרובים של תאים אלה נרשם בעמודה של המצע שעליו התא היה ממוקם בסוף הסרט.

איור 2. מציאה של cdGAP בתאי U2OS גורמת לאובדן durotaxis. תאי הבקרה siRNA שטופלו () להעביר באופן מועדף על מצע הזכוכית הקשיח, ואילו תאים שטופלו cdGAP siRNA לא הציגו כל העדפה. תאים שטופלו (ב) הבקרה siRNA חצו את הגבול בין PDMS וזכוכית פעם אחת. עם זאת, תאים שטופלו RNAi cdGAP היגרו הלוך ושוב על פני במספר פעמים oundary. מסלולים (C) של תאי נציג טופלו באו שליטה, או cdGAP siRNA היה שנוצר באמצעות תוסף מעקב הידני ImageJ. P-הערכים נקבעו באמצעות מבחן t של סטודנט וברי שגיאות מייצגים את מרווח הביטחון של 95%. מיוצר באישור וורמר et al. 2,014 ^11. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

במסמך זה אנו מתארים assay פשוט ללמוד durotaxis בתאים נודדים. כוח עיקרי של assay זה הוא הקלות של הכנת תאי durotaxis באמצעות PDMS. הנוקשות של מצעים ניתן להשפיע בקלות על ידי שינוי היחס של פתרון בסיס PDMS לcrosslinker כדי לאפשר המחקר של קשיחויות שונות בassay. עם זאת, הגבלת פוטנציאל אחד של המערכת היא שתאים נחשפים רק לשינוי יחיד בקשיחות מצע בניגוד לחווה שיפוע נוקשות המסופק על ידי מערכות מתוחכמות יותר ^4. חשוב לציין, שלא כמו מצעי polyacrylamide, רכיבי ECM לא צריכים להיות כימי צולב קשור לPDMS. ואכן, ציפוי פיברונקטין הוא כ שווה בשני PDMS ומשטחי הזכוכית, כפי שנקבע על ידי צביעה עם נוגדנים ספציפיים לפיברונקטין ^11. מאז מחקרים קודמים הראו כי תאים מתנהגים באותה משני PDMS או מצעי polyacrylamide, o השימושו PDMS מצעים מספק מודל הרבה יותר קל שעם ללמוד mechanotransduction בתאי ^10,12.

הצעד החשוב ביותר בהכנת מצעי PDMS הוא להבטיח כי הבסיס ואת הפתרונות שcrosslinker מעורבבים היטב. אם הם לא מעורבים מספיק טובים, אז מצעים לא ירפאו לחלוטין על טיפול בחום. זה יגרום coverslip שוקע מדי לתוך PDMS או coverslip נסחף בPDMS במהלך הדמיה. אם כוח צנטריפוגה הוא גבוה מדי, פתרונות הבסיס וcrosslinker רשאי להפריד בצינור. זה ניתן לתיקון על ידי הפחתת מהירות צנטריפוגה או על ידי degassing התערובת למשך 30 דקות באמצעות תא ואקום. לבסוף, צפיפות תאים היא קריטית, כמו תאים רבים מדי להשפיע על היכולת שלהם כדי להפיץ באופן מלא וללא הפרעה לdurotax על ידי מגע עם תאי שכנים. הצפיפות דיווחה בזאת הייתה מותאמת לתאי U2OS. עם זאת, אם cel סוגי תאים אחרים נמצאים בשימוש, אופטימלימספרי l יצטרכו להיקבע באופן אמפירי.

יש לנו בשימוש לאחרונה assay זה ללמוד איך הידבקות מוקד איתות החלבון cdGAP מסדירה mechanosensing וdurotaxis ^11. ברור, יש מרכיבים תאיים רבים, בנוסף להידבקויות מוקד, כגון אלמנטי cytoskeletal, רכיבי סחר חלבון ותעלות יונים מעורבים באיתות מכאנית ובכך גם עשויה לתרום להסדרת durotaxis ^13-15. כל אחד ממרכיבים אלה יכול להיות מוערך בקלות במערכת שלנו תוך שימוש בגישות RNAi דומים. בנוסף, assay זה הוא מאוד נוח לכניסתה של מפעילים תרופתיים שונים או מעכבים. Assay יכול גם להיות מותאם כדי לאפשר צורות מתוחכמות יותר של ניתוח כגון שילוב של חלבונים מתויג fluorescently, בשילוב עם סריג או FRAP גישות, ללמוד דינמיקת חלבון והפעלת מרחב ובזמן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	3097358-1004	Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
#1 Cover glass 12 mm	Fisher Scientific	12-545-82
6-well plate	Celltreat	229106
DMEM	Cellgro	15-017-CM
L-Glutamine	Cellgro	25-005-CI
Sodium Pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-CI
Fibronectin	BD Biosciences	610077
PBS	Invitrogen	21600-044
Falcon tubes	Celltreat	229456
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
U2OS cells	ATCC	HTB-96