Abstract
Состав и механические свойства внеклеточной матрицы сильно различаются между типами тканей. Это соединительной ткани стромы разнообразие значительно влияет поведение клеток регулировать нормальные и патологические процессы, включая пролиферацию клеток, их дифференциации, адгезии сигнализации и направленной миграции. В связи с этим, врожденная способность некоторых типов клеток мигрировать в направлении жесткой, или менее совместимый подложке матрицы обозначается как durotaxis. Это явление играет важную роль во время эмбрионального развития, заживления ран и инвазии раковых клеток. Здесь мы опишем простой анализ для изучения durotaxis, в пробирке, используя полидиметилсилоксановые (PDMS) субстратов. Подготовка описанный durotaxis камер создает жесткость интерфейс между относительно мягкой PDMS гель и жесткой покровного стекла. В приведенном примере мы использовали эти durotaxis камеры, чтобы продемонстрировать роль для Cdc42 / Rac1 ГТФ активации PROTEв, cdGAP, в mechanosensing и durotaxis регулирования в человека U2OS клеток остеосаркомы. Этот анализ легко адаптируется к другим типам клеток и / или нокдаун других белков интересов, чтобы исследовать их соответствующие роли в mechanosignaling и durotaxis.
Introduction
Внеклеточный матрикс (ЕСМ) состоит из сложного набора структурных и сшивающих белков, включая коллаген, фибронектин и ламинин. Хотя это хорошо известно, что ЕСМ обеспечивает важную структурную поддержку для сотовых тканей, появляется все больше доказательств, чтобы указать, что клетки активно реагировать на изменения физических в их среде ECM регулировать различные клеточных процессов, включая выживаемости клеток, дифференциации и миграции клеток. Например, различия в жесткости ECM может управлять мезенхимальные стволовые клетки к различным линий, с мягкими подложками (~ 1 кПа), способствующих нейрогенные клоны, а жесткие (~ 25 кПа) субстраты способствовать остеогенной дифференцировки 1. Аналогичным образом, увеличение жесткости матрицы стромальных было показано способствовать молочной эпителиальных клеток и образование опухолей вторжение в окружающие ткани 2,3.
Особенно интересный аспект этого mechanosignРезультаты Алинг активности в процессе, известном как durotaxis, в которых клетки мигрируют преимущественно в сторону более жесткой подложке. 4,5 Клетки постоянно ощущать физические характеристики их внеклеточной среде через рецептора интегрина связываться с ЕСМ. Это, в свою очередь, способствует накоплению многочисленных структурных и сигнальных белков в их цитоплазматических доменах для управления формирование липких структур, известных как фокальные адгезии или фокальных контактов 6,7. Так интегрины нет присущей ферментативной активности, сигналы передаются от ECM с помощью этих вспомогательных белков координировать реакцию клетки на их изменяющейся среде 8. Соответственно, идентификация и характеристика основных белков, участвующих в регуляции mechanosignaling и durotaxis является важной областью исследования.
Различные системы модели были разработаны для изучения durotaxis в пробирке, но большинство из нихиспользуемые коллаген-покрытием полиакриламидные субстраты 4. Тем не менее, подготовка полиакриламидных подложек может быть технически сложной и коллаген используется в этих анализах должны быть химически сшитый с подложкой 9. Полидиметилсилоксан (PDMS) подложки, как было показано, чтобы показать сопоставимые механические свойства в полиакриламидных подложек 10. Тем не менее, PDMS подложки получают путем простого смешивания отношение основания к сшивающего агента и эти субстраты могут быть покрыты белков ЕСМ без необходимости химической сшивки, тем самым ПДМС легче инструмент для изучения влияния жесткости на поведение клеток. Здесь мы опишем, как подготовить простую durotaxis камеру, в которой мягкий PDMS субстрат интегрированной с жесткой покровного стекла.
Анализ, как описано ниже, обеспечивает быстрый и простой способ для изучения durotaxis. Для этого исследования мы использовали U2OS клеток остеосаркомы человека в сочетании с миРНК опосредованногонокдаун cdGAP изучить роль этого белка фокальной адгезии в durotaxis 11. Важно отметить, что этот протокол может быть легко адаптированы к индивидуальным требованиям. Другие типы клеток могут быть заменены U2OS клеток и любой белок может быть сбит или избыточно экспрессируется определить воздействие на поведение клеток при durotaxis. Кроме того, этот протокол может быть адаптирован для включения флуоресцентно меченных белков для анализа их динамики и поведения, используя FRAP или беспокоиться подходы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Durotaxis палат
- Для подготовки одного 6-луночного культурального планшета, тарирования с 50 мл коническую трубку. Взвесить примерно 10 г исходного раствора PDMS в 50-мл пробирку (решение довольно вязкая).
- Для 90: 1 подложки (Compliance ~ 1 кПа), разделите измеренное вес базовой решения PDMS в трубке на 90, чтобы определить правильное количество сшивающего раствора необходимо. Добавить вычисленного количества сшивающего агента раствора PDMS с одной трубкой.
Пример: 10 г / 90 = 0,11 г. Добавить 0,11 г PDMS сшивающего раствора к исходному раствору PDMS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Базовые и сшивающих решения и при условии, в комплект PDMS. - Энергично смешивают PDMS основание / сшивающего смесь в течение 5 мин при комнатной температуре с помощью небольшого шпателя. На этой стадии смесь будет содержать большое количество пузырьков воздуха.
- Центрифуга PDMS подложки в настольной центрифуге в течение 5 мин при 50 мкг при комнатной температуре, чтобы удалить BUBBLES. Если есть еще пузыри после 5 мин, центрифугируют снова.
- Пипеткой 1 мл 90: 1 PDMS субстрата в каждую лунку тканевой культуры обрабатывали 6-луночный планшет. Оставшиеся пузырьки воздуха, присутствующие в PDMS могут быть устранены на данном этапе, выталкивая их с помощью иглы 21 G. Позвольте PDMS распространяться в течение 30 мин в скважине.
- Кипение 12 мм стекло # 1 покровные в дистиллированной воде в течение 5 мин. Повторите два раза и хранить покровные в дистиллированной воде.
- Поместите один, сушили покровное в каждую лунку планшета для культуры ткани, осторожно касаясь одной стороны покровного стекла в раствор PDMS затем удалить покровное на PDMS. Как покровное оседает, то PDMS начнет посягать над края покровного стекла, но не будет полностью покрывать его. Это создаст интерфейс между PDMS и стекла после отверждения (рис 1а, б).
- Инкубируйте планшет при 70 ° С в печи в течение 16 ч, чтобы вылечить (затвердевают) в PDMS. Поместите Platе в вытяжном шкафу для культивирования клеток и УФ стерилизации в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего, чтобы сделать пластины в течение пары дней использования. Тем не менее, пластины могут быть завернуты в парафильмом без буфера и хранили при 4 ° С в течение 2 недель без какого-либо заметного снижения качества.
2. Сотовый Покрытие
ПРИМЕЧАНИЕ: Если изучение влияния миРНК опосредованного нокдаун, выполните нокдаун, используя инструкции производителя или оптимизированное для протокола типа клеток выбора.
- Шерсть друг durotaxis камеру 1 мл 10 мкг / мл фибронектина в PBS без кальция и магния в течение 1 ч при 37 ° С. В качестве альтернативы, фибронектин могут быть применены за день до анализа при инкубации с PDMS 10 мкг / мл фибронектина в PBS в течение 16 часов при 4 ° С. Убедитесь, что вся поверхность погружают в раствор фибронектина в PBS.
- Подготовьте денатурированные нагреванием 1% BSA. Взвешивают 0,5 г BSA и растворить его в 50 мл PBS.Фильтр стерилизуют раствор через фильтр и тепла 0,22 мкм при 80 ° С в течение 12 мин.
Примечание: Подготовка это решение за день до клеточной покрытие и магазин на 4 ° C. - Аспирируйте фибронектина решение и промыть 3 раза PBS. Добавить 1 мл тепла денатурированный BSA в PBS в каждую лунку и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Trypsinize и рассчитывать клетки выбора в то время как durotaxis камеры блокирования теплового денатурированный BSA.
- Пластина 1 х 10 5 клеток в объеме 2 мл в каждую лунку durotaxis камеры, при использовании диска, необходимое для конкретного типа клеток выбора. Разрешить клетки придерживаться и выкладывают на подложке в течение 4 ч во влажном инкубаторе при 37 ° С с 5% СО 2.
Примечание: U2OS клетки рутинно поддерживали в DMEM с 10% FBS, дополненной 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 10 МЕ / мл пенициллина, 10 мкг / мл стрептомицина.
Примечание: Число клеток использовали в этом примере оптимизирован дляU2OS клетки. Оптимизация для других типов клеток может потребоваться. Эта плотность дает клеткам достаточно места, чтобы мигрировать без существенных взаимодействий с другими клетками.
3. Live-ячейки изображения
- Выполните изображений живых клеток на инвертированный микроскоп, с помощью фазового контраста с целью 10X. Микроскоп должен быть оснащен закрытом окружающей среды, влажной камере, что позволяет контролировать температуру в 37 ° C и 5% CO 2 в течение долгосрочного изображений.
- После того как клетки распространились примерно 3,5 часа, собрать пластину в микроскоп камеры. Разрешить образец (ы), чтобы уравновесить в камере в течение 30 мин.
- Настройка автоматического, мульти-точка посещения на микроскопе если таковые имеются. Фокус на границе раздела между 90: 1 и PDMS покровным стеклом и выбрать указывает на изображении вокруг интерфейса с в среднем 40 очков за durotaxis камеры. Image клетки каждые 10 мин до 16 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: ReГион интерес будет выглядеть как две линии, с внешней линии, соответствующей краю покровного стекла и внутренней линии, соответствующей фактической границе между PDMS и покровное. Смотрите рисунок 1В.
Анализ данных 4.
- Создать таблицу в таблице 1.
- Подсчитайте количество пропускных событий из PDMS к поверхности стекла и наоборот, с каждого фильма, генерируемого. Запишите число пропускных событий в соответствующей колонке в электронной таблице Excel.
Примечание: Событие пересечения определяется как ядро клетки, проходящей по границе между PDMS и стекла в любом направлении. - Для количественной оценки нескольких переездов, подсчитать количество раз клетка пересекла интерфейс. Это число должны быть записаны в столбце первенствуйте соответствующей подложки, на которой был расположен сотовый в конце фильма. Повторите анализ для каждой ячейки, что пересекает интерфейс в тон фильм. Исключить клетки, которые мигрируют из поля зрения во время съемки.
Примечание: Важно также, чтобы проверить, клеткой подсчета в начале эксперимента, что клетки могут придерживаться в равной степени к покрытой фибронектином PDMS и покровным стеклом поверхностей. - Рассчитывают процент клеток, которые мигрировали из PDMS с поверхности стекла (например, прошли durotaxis). Добавить номер пересечения события от мягкого до жесткого и многочисленных событий, которые закончились пропуска на жесткий и разделите на общее количество пропускных событий.
- Рассчитывают процент многократных пересечений путем деления числа множественных пересечений на общее количество пересечений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема на durotaxis камере показано на фиг.1А. Мягкий ПДМС субстрат (90: 1 смесь PDMS основания к сшивающему решения) распространяется в чашке с 6 скважины и покровным стеклом помещают в верхней части PDMS, которые затем частично покрывает верхнюю поверхность покровного стекла, тем самым создавая интерфейс между двумя подложками разной соответствия. Жесткость мягкого PDMS подложки ~ 1 кПа, что сравнимо с типичной соответствии мозговой ткани, в то время как жесткость стекла составляет около 1-2 ГПа 1. Фазовый контраст изображения интерфейса между PDMS и стекла показана белых стрелок на фиг.1В. Звездочки означают два управления RNAi клеток, мигрирующих в сторону более жесткой подложке. Оборванные края, что может быть видно (черная стрелка) соответствует краю покровного стекла.
Для количественной оценки данных, электронные таблицы Microsoft Excel должны быть созданы как в таблице 1 </ STRONG>. Количество пропускных событий должны учитываться и организовал в соответствующем столбце. Некоторые из фильмов, генерируемых не может быть использована для количественного определения. Фильм может быть исключен из количественного если есть пузырь в PDMS, что мешает с прогрессом клеток или если клетки слишком плотно, в результате чего столкновений, которые могут влиять на клеточную резко направленности. Деление клеток также должны быть проверены, так как это может также влиять открыто движение клетки.
Как правило, большинство прилипшие типы клеток будут преимущественно мигрируют в направлении более жесткой подложке 2,4,12. Для начала, чтобы понять молекулярный механизм, с помощью которого клетки реагировать на сигналы механических в своей среде, конкретные белки могут быть сбил с помощью миРНК. В нашем примере, около 70% контрольных миРНК клетках, обработанных выставлены durotaxis фиг.2А. В контрасте, когда cdGAP был сбит с помощью RNAi, клетки не было никакого предпочтенияотносительно того, что они мигрировали на твердой или мягкой подложки фиг.2А. Кроме того, нокдаун клетки cdGAP пересек граничные несколько раз, в то время как контроль миРНК обработанные клетки как правило, только пересек границу один раз, Фигурное 2В. Представительства треки управления миРНК клеток показывают, что клетки обычно мигрируют через границы раз и преимущественно остались на более жесткой поверхности, по сравнению с cdGAP миРНК-обработанных клеток, которые не демонстрируют предпочтение либо жесткости и скрещенных граничные несколько раз рис 2С.
Рисунок 1. Схема камеры Durotaxis создан. (А) Мягкая ПДМС распространяется в каждую лунку блюдо 6-луночный и покровным стеклом помещают в верхней части PDMS. В PDMS будет посягать на стороны в верхней части покровного стекла, БЭФРуды он затвердевает, чтобы сформировать интерфейс между двумя подложками. Durotaxis определяется счет направленности клеток, пересекающих интерфейс ПДМС / стекло. (Б) представитель фазового контраста изображение, показывающее интерфейс между мягких PDMS и жесткой стеклянной подложке. Звездочки показывают контроля RNAi лечение U2OS клеток, подвергающихся durotaxis. Белые наконечники стрел обозначения интерфейс между PDMS и покровного стекла и стрелки указывает на край покровного стекла под PDMS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1. Схема Microsoft Excel таблицы созданы. Колонны устанавливаются включать номер кино, миРНК используются, количество клеток, которые мигрировали из мягких PDMSжесткой стеклянной подложке или наоборот, а также от общего количества проанализированных клеток. Колонны также настроить для клеток, которые пересекают интерфейс несколько раз и заканчивается либо мягких PDMS или стеклянной подложке. Если ячейка мигрирует через границу несколько раз, количество пропускных нескольких событий этих клеток записывается в графе подложки, на которой был расположен сотовый в конце фильма.
Рисунок 2. Нокдаун cdGAP в U2OS клеток вызывает потерю durotaxis. (A) управления миРНК обработанные клетки мигрируют преимущественно на жесткой стеклянной подложке, в то время как cdGAP миРНК обработанные клетки не проявляют какой-либо предпочтение. (Б) контроль миРНК обработанные клетки пересек границу между PDMS и стекла одновременно. Тем не менее, cdGAP РНК-интерференции клетки мигрировали обработанные назад и вперед по бoundary несколько раз. (C) Следы представительных клеток обрабатывали либо контроля или cdGAP миРНК были получены с использованием ручной плагин для отслеживания в ImageJ. P-значения были определены с использованием Т-теста студента и ошибки бары представляют 95% доверительный интервал. Воспроизводится с разрешения Вормер др. 2014 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом мы опишем простой анализ для изучения durotaxis в миграции клеток. Одним из основных преимуществ данного метода является простота подготовки durotaxis камеры, используя PDMS. Жесткость субстратов можно легко манипулировать, изменяя соотношение PDMS раствора основания, чтобы сшивающему чтобы изучение различных жесткостей в анализе. Тем не менее, одним из потенциальных ограничений системы является то, что клетки подвергаются только к одному изменению субстрата жесткости, в отличие от испытывают жесткости градиента, который обеспечивается более сложных систем 4. Важно отметить, что в отличие от полиакриламидных подложек, компоненты ЕСМ не должны быть химически сшиты PDMS. Действительно, фибронектин покрытием приблизительно эквивалентна на обоих PDMS и стеклянных поверхностях, как определено с помощью окрашивания антителом, специфичным к фибронектина 11. Так как предыдущие исследования показали, что клетки ведут себя так же либо на PDMS или полиакриламидном субстратов, использование Oе PDMS субстраты обеспечивает намного легче модели, с которой для изучения механотрансдукции в клетках 10,12.
Наиболее важным шагом в подготовке подложек PDMS, чтобы гарантировать, что основание и сшивающего агента растворы тщательно перемешивают. Если они не смешиваются достаточно хорошо, то субстраты не полностью вылечить при термообработке. Это приведет к покровное тонет слишком далеко в PDMS или покровное дрейфующих в PDMS во время съемки. Если силы центрифугирования слишком высока, базовые и сшивающего агента растворы могут отделить в трубке. Это может быть исправлено путем снижения скорости центрифугирования или дегазации смеси в течение 30 мин с использованием вакуумной камеры. Наконец, плотность клеток является критическим, так как слишком многие клетки будут влиять на их способность полностью распространяться и durotax беспрепятственно при контакте с соседними клетками. Плотность сообщаемые здесь был оптимизирован для U2OS клеток. Тем не менее, если используются другие типы клеток, оптимальное челчисло л должны быть определены эмпирически.
Недавно мы использовали этот анализ для изучения того, как фокусное адгезии сигнализации белка cdGAP регулирует mechanosensing и durotaxis 11. Очевидно, существуют многочисленные клеточные компоненты в дополнение к координационных спаек, таких как цитоскелета элементов, компонентов с торговлей людьми белок и ионных каналов, участвующих в механической сигнализации и, таким образом, может также способствовать регулированию durotaxis 13 - 15. Каждый из этих компонентов может быть легко оценена в нашей системе с использованием аналогичных подходов RNAi. Кроме того, этот анализ очень поддается введением различных фармакологических активаторов или ингибиторов. Анализ также может быть адаптирована для обеспечения более сложных форм анализа, таких как включение флуоресцентно-меченных белков в сочетании с FRET или FRAP подходов, исследование динамики белка и пространственно-временную активацию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается NIH R01 GM47607, CA163296 и NSF 1334493 в CET. Мы благодарим членов лаборатории Тернера за критическое прочтение рукописи. Все данные, представленные в данном отчете были воспроизведены разрешения Вормер др. 2014 11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12 mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
References
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).
- Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).
- Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).
- Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).
