Abstract
De samenstelling en de mechanische eigenschappen van de extracellulaire matrix sterk uiteen weefseltypen. Dit bindweefsel stroma diversiteit grote invloed cel gedrag normaal en pathologische processen, waaronder proliferatie, differentiatie, hechting signalering en directionele migratie te reguleren. In dit verband, het aangeboren vermogen van bepaalde celtypen migreren naar een stijver of minder compatibele matrix substraat wordt genoemd durotaxis. Dit fenomeen speelt een belangrijke rol tijdens de embryonale ontwikkeling, wondgenezing en kankercel invasie. We beschrijven hier een eenvoudige test om durotaxis studie, in vitro, met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten. Bereiding van de beschreven durotaxis kamers creëert een stijfheid interface tussen de relatief zachte gel PDMS en een stijf glazen dekglaasje. In het voorbeeld hebben we deze durotaxis kamers gebruikt om een rol voor de Cdc42 tonen / Rac1 GTPase activerende protein, cdGAP in mechanosensing en durotaxis regelgeving in menselijke U2OS osteosarcoomcellen. Deze test is gemakkelijk aan te passen aan andere typen cellen en / of knock-down van andere eiwitten van de belangen van hun respectieve rollen verkennen in mechanosignaling en durotaxis.
Introduction
De extracellulaire matrix (ECM) bestaat uit een complexe reeks van structurele en verknopen van proteïnen zoals collageen, fibronectine en laminine. Hoewel het goed is vastgesteld dat de ECM levert belangrijke structurele steun voor cellulaire weefsels, is er steeds meer bewijs om aan te geven dat cellen actief inspelen op de fysieke veranderingen in hun ECM-omgeving om diverse cellulaire processen zoals overleving van de cel, differentiatie en celmigratie reguleren. Zo kunnen verschillen in stijfheid van de ECM mesenchymale stamcellen rijdt richting verschillende geslachten, met zachte substraten (~ 1 kPa) bevordering neurogene lineages terwijl stijve (~ 25 kPa) substraten te bevorderen osteogene differentiatie 1. Ook is een toename van de stromale matrix stijfheid aangetoond mammaire epitheelcellen tumorigenese en invasie in het omringende weefsel 2,3 promoten.
Een bijzonder interessant aspect van deze mechanosignaling activiteit leidt tot een proces dat durotaxis, waarbij cellen preferentieel migreren naar een stijver substraat 4,5. Cellen constant zin de fysische eigenschappen van de extracellulaire omgeving via integrine receptor binding aan de ECM. Dit bevordert op zijn beurt de ophoping van talrijke structurele en signaaleiwitten hun cytoplasmatische domeinen van de vorming van lijm structuren bekend als focale adhesies of focale contacten 6,7 drijven. Omdat integrinen zijn geen inherente enzymatische activiteit worden signalen doorgegeven vanuit het ECM door deze additionele eiwitten de reactie van de cel om hun veranderende omgeving 8 coördineren. Dienovereenkomstig is de identificatie en karakterisering van de belangrijkste eiwitten die betrokken zijn bij het reguleren mechanosignaling en durotaxis is een belangrijk onderzoeksgebied.
Verschillende modelsystemen ontwikkeld studeren durotaxis in vitro, maar de meeste hebbengebruikt met collageen beklede substraten polyacrylamide 4. Echter, de bereiding van de polyacrylamide substraten technische uitdaging en collageen die in deze testen moeten chemisch verknoopt aan het substraat 9 zijn. Polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten bleken vergelijkbare mechanische eigenschappen vertonen om de substraten 10 polyacrylamide. Echter PDMS substraten bereid door eenvoudig mengen van een verhouding van de base om verknopingsmiddel en deze substraten kunnen worden bekleed met ECM eiwitten zonder chemische verknoping, waardoor PDMS makkelijker instrument om de effecten van starheid celgedrag bestuderen. Hierin beschrijven we hoe een eenvoudige durotaxis kamer waarin een zachte PDMS substraat is geïntegreerd met een stijve glazen dekglaasje bereiden.
De test, zoals hieronder wordt uiteengezet, verschaft een snelle en eenvoudige methode om durotaxis bestuderen. Voor deze studie gebruikten we de menselijke U2OS osteosarcoomcellen gecombineerd met siRNA-gemedieerdeknockdown van cdGAP om de rol van deze focale adhesie eiwit bestuderen durotaxis 11. Belangrijk is, kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast aan de individuele behoeften. Andere celtypen kunnen worden gesubstitueerd voor de U2OS cellen en elk eiwit kan worden neergeslagen of overexpressie gebracht om de effecten op celgedrag tijdens durotaxis bepalen. Bovendien kan dit protocol worden aangepast aan fluorescent gemerkte eiwitten te nemen om hun dynamiek en gedrag met behulp van FRAP of FRET benaderingen te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Durotaxis Chambers
- Een 6-well weefselkweek plaat voor te bereiden, tarra de balans met een 50 ml conische buis. Weeg ongeveer 10 g PDMS basisoplossing in de 50 ml buis (de oplossing vrij viskeus).
- Voor een 90: 1 substraat (Overeenstemming van ~ 1 kPa), verdeel het gemeten gewicht van de PDMS basisoplossing in de buis 90 door de juiste hoeveelheid verknopingsmiddel oplossing nodig te bepalen. Voeg de berekende hoeveelheid PDMS crosslinker oplossing dezelfde buis.
Voorbeeld: 10 g / 90 = 0,11 g. Voeg 0,11 g PDMS crosslinker oplossing van het PDMS basisoplossing.
Opmerking: De basis en crosslinker oplossingen zijn beide voorzien in het PDMS kit. - Krachtig mengen de PDMS base / crosslinker mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met een kleine spatel. In dit stadium zal het mengsel een groot aantal luchtbellen bevatten.
- Centrifugeer de PDMS substraat in een benchtop centrifuge gedurende 5 minuten bij 50 xg bij kamertemperatuur om het verwijderen bubBles. Als er nog steeds belletjes na 5 min, centrifuge opnieuw.
- Pipetteer 1 ml van 90: 1 PDMS substraat in elk putje van weefselkweek behandelde 6-wells plaat. Eventuele resterende luchtbellen aanwezig in het PDMS kan in dit stadium worden geëlimineerd door popping ze met behulp van een 21 G naald. Laat de PDMS spreiden gedurende 30 min in de put.
- Kook 12 mm glazen dekglaasjes # 1 in gedestilleerd water gedurende 5 min. Herhaal tweemaal en bewaar de dekglaasjes in gedistilleerd water.
- Plaats een gedroogd dekglaasje in elk putje van de weefselkweekplaat door voorzichtig aanraken van één kant van het dekglaasje in het PDMS oplossing dan vallen het dekglaasje op het PDMS. Aangezien het dekglaasje afwikkelt, zal de PDMS beginnen te tasten over de randen van het dekglaasje, maar niet volledig bedekken. Dit zal een interface tussen de PDMS en glazen na uitharding te genereren (zie Figuur 1A, B).
- Incubeer de plaat bij 70 ° C in een oven gedurende 16 uur om uit te harden (harden) het PDMS. Leg het plate in een celkweek kap en UV steriliseren 10 min.
NB: Het beste is om de platen te maken binnen een paar dagen van gebruik. Echter de platen in Parafilm gewikkeld zonder buffer en opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken zonder merkbare vermindering van de kwaliteit.
2. Cell Plating
Opmerking: Als het bestuderen van het effect van siRNA-gemedieerde knockdown Voer de knockdown volgens de instructies van de fabrikant of geoptimaliseerd protocol voor het celtype gekozen.
- Coat elk durotaxis kamer met 1 ml van 10 ug / ml fibronectine in PBS zonder calcium en magnesium gedurende 1 uur bij 37 ° C. Alternatief kan de fibronectine worden toegepast op de dag voorafgaand aan analyse door het incuberen van de PDMS met 10 ug / ml fibronectine in PBS gedurende 16 uur bij 4 ° C. Zorg ervoor dat het gehele oppervlak is ondergedompeld in de fibronectine in PBS oplossing.
- Bereid hitte-gedenatureerd 1% BSA. Weeg 0,5 g BSA en oplossen in 50 ml PBS.Filter steriliseren van de oplossing door een 0,22 urn filter en verwarm bij 80 ° C gedurende 12 min.
Opmerking: Bereid deze oplossing de dag voorafgaand aan plateren en opslag cel bij 4 ° C. - Zuig het fibronectine oplossing en was 3 maal met PBS. Voeg 1 ml van hitte gedenatureerd BSA in PBS aan elk putje en incubeer gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
- Trypsinize en te tellen cellen van keuze, terwijl de durotaxis kamers blokkeren met de hitte gedenatureerd BSA.
- Plaat 1 x 10 5 cellen in een volume van 2 ml in elk putje van de durotaxis kamer via de media die voor het specifieke celtype naar keuze. Laat de cellen te hechten en verspreiden op het substraat 4 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
OPMERKING: U2OS cellen worden routinematig aangehouden in DMEM met 10% FBS, aangevuld met 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, en 10 IU / ml penicilline, 10 ug / ml streptomycine.
Opmerking: Het aantal cellen in dit voorbeeld is geoptimaliseerd voorU2OS cellen. Optimalisatie voor andere celtypen vereist zijn. Deze dichtheid geeft de cellen voldoende ruimte te migreren zonder significante interacties met andere cellen.
3. live-cell imaging
- Live cell imaging op een omgekeerde microscoop, met behulp van fase contrast met een 10x doelstelling. De microscoop moet worden voorzien van een afgesloten milieu, bevochtigde kamer, waardoor temperatuurregeling bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende langdurige imaging.
- Nadat de cellen hebben verspreid voor ongeveer 3,5 uur, de montage van de plaat in de microscoop kamer. Laat het monster (s) equilibreren in de kamer gedurende 30 min.
- Het opzetten van geautomatiseerde, multi-point een bezoek op de microscoop, indien beschikbaar. Richten zich op het raakvlak tussen de 90: 1 PDMS en het glas dekglaasje en kies punten om de afbeelding rondom de interface met een gemiddelde van 40 punten per durotaxis kamer. Afbeelding de cellen elke 10 minuten gedurende maximaal 16 uur.
OPMERKING: Het opnieuwgion plaats verschijnt als twee lijnen met de buitenste lijn overeenkomt met de rand van het dekglaasje en de binnenleiding voor het werkelijke interface tussen de PDMS en het dekglaasje. Zie figuur 1B.
4. Data Analysis
- Genereer een spreadsheet zoals in tabel 1.
- Tel het aantal events oversteek van de PDMS het glasoppervlak en vice versa van elke film gegenereerd. Noteer het aantal kruising gebeurtenissen in de juiste kolom in het Excel-spreadsheet.
Opmerking: Een kruising event wordt gedefinieerd als de celkern die over de grens tussen de PDMS en glas in beide richtingen. - Om meerdere kruisingen kwantificeren, tel het aantal keren dat de cel stak de interface. Dit aantal dient te worden geregistreerd in de kolom excel overeenkomt met het substraat waarop de cellen werd aan het einde van de film. Herhaal de analyse voor elke cel die de interface kruisen in tHij film. Uitsluiten cellen die migreren uit het gezichtsveld tijdens de beeldvorming.
Opmerking: Het is van belang om, door cellen te tellen bij het begin van het experiment dat de cellen kunnen eveneens hechten aan de met fibronectine gecoate PDMS en glazen dekglaasje oppervlakken. - Bereken het percentage cellen dat gemigreerd van PDMS het glasoppervlak (dwz onderging durotaxis). Voeg het aantal oversteken gebeurtenissen van zacht naar hard en de meervoudige kruising gebeurtenissen die eindigde op harde en delen door het totaal aantal kruising evenementen.
- Bereken het percentage meervoudige kruisingen door het aantal meervoudige kruisingen door het totaal aantal kruisingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schema van de durotaxis kamer wordt getoond in figuur 1A. Soft PDMS substraat (een 90: 1 mengsel van PDMS base oplossingen verknopingsmiddel) is verdeeld in een 6 putjes en een glazen dekglaasje geplaatst bovenop de PDMS, die vervolgens gedeeltelijk bedekt het bovenoppervlak van het dekglaasje waardoor een interface creëren tussen de twee substraten van verschillende compliance. De stijfheid van het zachte PDMS substraat ~ 1 kPa, vergelijkbaar met de typische naleving van hersenweefsel, terwijl de stijfheid van glas is ongeveer 1-2 GPa 1. Een fase contrast beeld van het grensvlak tussen de PDMS en glas wordt aangegeven door de witte pijlen in figuur 1B. De sterretjes duiden beide control RNAi cellen migreren naar de hardere substraat. De gerafelde rand die te zien (zwarte pijl) komt overeen met de rand van het dekglaasje.
Om de gegevens te kwantificeren, moet een Microsoft Excel-spreadsheet worden gegenereerd zoals in tabel 1 </ strong>. Het aantal kruising evenementen moeten worden geteld en georganiseerd in de overeenkomstige kolom. Sommige van de gegenereerde films kunnen niet worden gebruikt voor kwantificering. Een film kan worden weggelaten kwantificering als er een luchtbel in het PDMS die interfereert met cellen vooruitgang of als de cellen te dicht verpakt, waardoor botsingen die drastisch kan beïnvloeden cel richtingsgevoeligheid. Celdeling moet ook gecontroleerd worden, want dit kan ook openlijk beïnvloeden cel beweging.
Gewoonlijk zullen de meeste hechtende celtypen preferentieel migreren naar een stijver substraat 2,4,12. Om te beginnen met het moleculaire mechanisme waarmee cellen reageren op mechanische signalen in hun omgeving te begrijpen, kunnen specifieke eiwitten worden neergeslagen met behulp van siRNA. In ons voorbeeld, ongeveer 70% van de controle-siRNA behandelde cellen vertoonden durotaxis figuur 2A. In schril contrast, toen cdGAP werd neergehaald met behulp van RNAi, de cellen hadden geen voorkeurof zij migreerden naar het harde of zachte ondergrond Figuur 2A. Bovendien is de cdGAP knockdown cellen staken de grens meerdere malen, terwijl controle siRNA behandelde cellen in het algemeen alleen stak de grens eenmaal figuur 2B. Representatieve sporen of control siRNA-cellen blijkt dat de cellen doorgaans migreren over de grens eenmaal en bij voorkeur bleef het meer rigide oppervlak tegenover cdGAP siRNA behandelde cellen die geen voorkeur voor stijfheid heeft aangetoond en stak de grens meerdere malen Figuur 2C.
Figuur 1. Schematische voorstelling van de Durotaxis kamer ingesteld. (A) Soft PDMS is verdeeld in elk putje van een 6-putjes en een glazen dekglaasje wordt bovenop de PDMS geplaatst. De PDMS zal aantasten over de zijkanten van de bovenkant van het dekglaasje, beferts het verhardt, een interface tussen de twee substraten te vormen. Durotaxis wordt bepaald door het scoren van de gerichtheid van de cellen die de PDMS / glas interface. (B) Representatieve beeld fasecontrast toont het grensvlak tussen de zachte PDMS en stijf glazen substraat. De sterretjes tonen controle-RNAi behandelde U2OS cellen ondergaan durotaxis. De witte pijlen geven de interface tussen de PDMS en glazen dekglaasje en de pijl geeft de rand van het glas dekglaasje onder het PDMS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. Schematische voorstelling van Microsoft Excel spreadsheet opgezet. Kolommen worden opgericht om de film te vermelden, siRNA gebruikt, het aantal cellen die gemigreerd van de zachte PDMSmet stijve glazen substraat of vice versa, alsmede het totale aantal geanalyseerde cellen. Kolommen worden ook opgezet voor de cellen die de interface meerdere keren steken en eindigen op zowel de zachte PDMS of het glazen substraat. Als een cel migreert over de grens meerdere malen, wordt het aantal meervoudige gebeurtenissen overschrijding van deze cellen die in de kolom van het substraat waarop de cellen werd aan het einde van de film.
Figuur 2. Knockdown van cdGAP in U2OS cellen veroorzaakt een verlies van durotaxis. (A) controle siRNA behandelde cellen migreren bij voorkeur op de stijve glazen substraat, terwijl cdGAP siRNA behandelde cellen vertoonden geen voorkeur. (B) controle siRNA behandelde cellen stak de grens tussen de PDMS en glas keer. Echter, cdGAP RNAi-behandelde cellen migreerden heen en weer over de boundary meerdere keren. (C) Tracks van representatieve cellen behandeld met ofwel controle of cdGAP siRNA werden gegenereerd met behulp van de handleiding volgen plugin in ImageJ. De p-waarden werden bepaald met een t-toets en fouten balken geven het 95% betrouwbaarheidsinterval. Overgenomen met toestemming van Wormer et al. 2014 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hierin beschrijven we een eenvoudige test om durotaxis bestuderen migrerende cellen. Een grote kracht van deze test is het gemak van de voorbereiding van de durotaxis kamers met behulp van PDMS. De stijfheid van de substraten kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd door de verhouding van PDMS base oplossing verknopingsmiddel voor de studie van diverse starheid in de test toe. Echter, een mogelijke beperking van het systeem is dat cellen alleen worden blootgesteld aan een enkele verandering in substraat stijfheid tegenstelling tot het ervaren van een stijfheid gradiënt die wordt geleverd door meer geavanceerde systemen 4. Belangrijk tegenstelling polyacrylamide substraten, de ECM componenten hebben geen chemisch verknoopt met PDMS zijn. Inderdaad, de fibronectine coating is ongeveer gelijk aan zowel de PDMS en glazen oppervlakken, zoals bepaald door kleuring met een antilichaam specifiek voor fibronectine 11. Aangezien eerdere studies hebben aangetoond dat cellen hetzelfde gedragen aan beide PDMS of polyacrylamide substraten, het gebruik of PDMS substraten biedt een veel eenvoudiger model waarmee mechanotransductie in cellen 10,12 bestuderen.
De belangrijkste stap in de voorbereiding van het PDMS substraten te waarborgen dat de basis en de crosslinker oplossingen goed gemengd. Als ze niet voldoende worden gemengd, daarna de substraten niet volledig genezen na warmtebehandeling. Dit resulteert in het dekglaasje zinken te ver in het PDMS of dekglaasje drijven in het PDMS tijdens de beeldvorming. Als het centrifugeren kracht te hoog is, kan de basis en crosslinker oplossingen gescheiden in de buis. Dit kan worden opgelost door vermindering van de snelheid centrifugatie of door ontgassen van het mengsel gedurende 30 min met een vacuümkamer. Tenslotte cel dichtheid is van cruciaal belang, omdat er te veel cellen hun vermogen om volledig te verspreiden en te durotax ongehinderd door contact met naburige cellen zal beïnvloeden. De dichtheid hierin gemeld werd geoptimaliseerd voor U2OS cellen. Indien andere celtypen worden gebruikt, optimale CELl getallen moet empirisch worden bepaald.
We hebben onlangs gebruikt deze test om te onderzoeken hoe de focal adhesion signalering eiwit cdGAP reguleert mechanosensing en durotaxis 11. Duidelijk is dat talloze cellulaire componenten naast focale adhesies, zoals cytoskeletelementen, eiwittransport componenten en ionenkanalen die betrokken zijn bij mechanische signalering en daarmee kan ook bijdragen aan de regulering van durotaxis 13 - 15. Al deze componenten kunnen gemakkelijk worden geëvalueerd ons systeem met vergelijkbare RNAi benaderingen. Bovendien, deze test is zeer ontvankelijk voor de introductie van verscheidene farmacologische remmers of activatoren. De test kan ook worden aangepast om meer geavanceerde analysevormen zoals de incorporatie van fluorescent-gemerkte eiwitten, in combinatie toe met FRET of FRAP benaderingen eiwit dynamiek en spatio-temporeel activatie bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door NIH R01 GM47607, CA163296 en NSF 1.334.493 te CET. Wij danken de leden van de Turner lab voor kritische lezing van het manuscript. Alle in dit rapport gegevens werden overgenomen met toestemming van Wormer et al. 2014 11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12 mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
References
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).
- Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).
- Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).
- Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).
