Abstract
Sammensætningen og mekaniske egenskaber af den ekstracellulære matrix er meget varierende mellem vævstyper. Denne bindevæv stroma diversitet i høj grad konsekvenser celle adfærd til at regulere normale og patologiske processer, herunder celledeling, differentiering, vedhæftning signalering og retningsbestemt migration. I denne henseende er det medfødte evne af visse celletyper migrerer mod et stivere, eller mindre kompatibel matrix omtales som durotaxis substrat. Dette fænomen spiller en vigtig rolle under fosterudviklingen, sårheling og cancer cell invasion. Her beskriver vi en enkel assay at studere durotaxis in vitro ved hjælp af polydimethylsiloxan (PDMS) substrater. Fremstilling af den beskrevne durotaxis kamre skaber en stivhed grænseflade mellem relativt blødt PDMS gel og en stiv dækglas. I eksemplet forudsat, har vi brugt disse durotaxis kamre til at demonstrere en rolle for cdc42 / Rac1 GTPase aktiverende protei, cdGAP, i mechanosensing og durotaxis regulering i humane U2OS osteosarcomceller. Denne analyse er let tilpasses til andre celletyper og / eller knockdown af andre proteiner af interesse til at udforske deres respektive roller i mechanosignaling og durotaxis.
Introduction
Den ekstracellulære matrix (ECM) består af en kompleks række af strukturelle og tværbindingsmidler proteiner, herunder kollagen, fibronectin og laminin. Selv om det vel er fastslået, at ECM indeholder vigtige strukturstøtte til cellulære væv, er der stigende tegn på, at cellerne reagerer aktivt til fysiske ændringer i deres ECM miljø til at regulere diverse cellulære processer, herunder celle overlevelse, differentiering og celle migration. For eksempel kan forskelle i stivhed ECM køre mesenkymale stamceller mod forskellige afstamninger, med bløde substrater (~ 1 kPa) fremme neurogene slægter mens stive (~ 25 kPa) substrater fremme osteogen differentiering 1. Ligeledes er en stigning i det stromale matrix stivhed vist sig at fremme mamma epitelcelle tumorigenese og invasion i det omgivende væv 2,3.
Et særligt interessant aspekt af denne mechanosignAling aktivitet medfører en proces kendt som durotaxis, hvor celler migrerer fortrinsvis mod en mere stiv substrat 4,5. Celler fornemmer konstant de fysiske egenskaber af deres ekstracellulære miljø gennem integrin receptor binding til ECM. Dette på sin side fremmer akkumulering af talrige strukturelle og signalproteiner til deres cytoplasmatiske domæner fremme dannelsen af klæbende strukturer kendt som fokale adhæsioner eller fokale kontakter 6,7. Da integriner har ingen iboende enzymatisk aktivitet, er signaler videreformidles fra ECM gennem disse accessoriske proteiner for at koordinere cellens reaktion på deres skiftende miljø 8. Derfor identifikation og karakterisering af de centrale proteiner involveret i reguleringen mechanosignaling og durotaxis er et vigtigt område for undersøgelse.
Forskellige modelsystemer er blevet udviklet til at studere durotaxis in vitro, men de fleste harudnyttede collagen-coatede polyacrylamid substrater 4. Fremstilling af polyacrylamid substrater, kan imidlertid være teknisk udfordrende og collagen anvendes i disse assays skal være kemisk tværbundet til substratet 9. Polydimethylsiloxan (PDMS) substrater har vist sig at udvise sammenlignelige mekaniske egenskaber til polyacrylamid substrater 10. Imidlertid er PDMS substrater fremstilles ved simpel blanding et forhold mellem basen til tværbinderen og disse substrater kan overtrækkes med ECM-proteiner uden behov for kemisk tværbinding, hvorved PDMS en lettere værktøj til at studere virkningerne af stivhed på celleopførsel. Heri beskriver vi, hvordan man forbereder en simpel durotaxis kammer, hvor en blød PDMS substrat er integreret med en stiv dækglas.
Analysen, som beskrevet nedenfor, giver en hurtig og enkel metode til at studere durotaxis. Til denne undersøgelse brugte vi humane U2OS osteosarcomceller kombineret med siRNA-medieretknockdown af cdGAP at undersøge den rolle, som denne fokal adhæsion protein i durotaxis 11. Vigtigere er det, kan denne protokol let tilpasses individuelle behov. Andre celletyper kan anvendes i stedet for de U2OS celler og helst protein kan blive skubbet ned eller overudtrykt at bestemme virkningerne på celleopførsel under durotaxis. Endvidere kan denne protokol tilpasses til at inkorporere fluorescens mærkede proteiner til at analysere deres dynamik og adfærd ved hjælp FRAP eller FRET tilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Durotaxis Chambers
- Til fremstilling af en 6-brønds vævskulturplade, tarere vægten med en 50 ml konisk rør. Afvej ca. 10 g PDMS baseopløsning i 50 ml rør (opløsningen er ganske viskos).
- For en 90: 1 substrat (Opfyldelse af ~ 1 kPa), opdele den målte vægt af PDMS baseopløsning i røret 90 for at bestemme den korrekte mængde tværbinder opløsning nødvendig. Tilsæt beregnede mængde PDMS tværbinder løsning på det samme rør.
Eksempel: 10 g / 90 = 0,11 g. Tilføj 0,11 g PDMS tværbinder løsning på PDMS baseopløsning.
BEMÆRK: basen og tværbinder løsninger både leveres i PDMS sættet. - Kraftigt blande PDMS base / tværbinder blandingen i 5 minutter ved stuetemperatur med en lille spatel. På dette stadium blandingen vil indeholde et stort antal luftbobler.
- Centrifugeres PDMS substratet i en bordcentrifuge i 5 minutter ved 50 x g ved stuetemperatur for at fjerne bubbles. Hvis der stadig er bobler efter 5 min, centrifugeres igen.
- 1 ml af 90: 1 PDMS substrat til hver brønd i vævskulturbehandlet 6-brønds plade. Eventuelle resterende luftbobler til stede i PDMS kan elimineres på dette stadium ved at poppe dem ved hjælp af en 21 G nål. Lad PDMS at sprede i 30 minutter i brønden.
- Kog 12 mm glas # 1 dækglas i destilleret vand i 5 min. Gentag to gange og gemme dækglassene i destilleret vand.
- Placer en, tørret dækglas i hver brønd i vævskulturpladen ved forsigtigt at røre den ene side af dækglasset i PDMS opløsningen så drop dækglasset på PDMS. Som dækglasset sig, vil de begynde at PDMS gribe ind over kanterne af dækglasset, men vil ikke helt dække det. Dette vil generere en grænseflade mellem PDMS og glas efter hærdning (se figur 1A, B).
- Inkubér pladen ved 70 ° C i en ovn i 16 timer for at hærde (hærde) PDMS. Placer plate i en cellekultur hætte og UV sterilisere i 10 minutter.
BEMÆRK: Det er bedst at gøre pladerne inden for et par dages brug. Imidlertid kan pladerne være indpakket i parafilm uden puffer og opbevaret ved 4 ° C i op til 2 uger uden nogen mærkbar nedgang i kvalitet.
2. Celleudpladning
BEMÆRK: Hvis studere virkningen af siRNA-medieret knockdown, udføre knockdown anvendelse af fabrikantens instruktioner eller det optimerede protokol for celletypen af valg.
- Coat hver durotaxis kammer med 1 ml 10 ug / ml fibronectin i PBS uden calcium og magnesium i 1 time ved 37 ° C. Alternativt kan fibronectin påføres dagen før analyse ved at inkubere PDMS med 10 ug / ml fibronectin i PBS i 16 timer ved 4 ° C. Sikre, at hele overfladen er neddykket i fibronectin i PBS-opløsning.
- Forbered varmedenatureret 1% BSA. 0,5 g BSA afvejes og opløse den i 50 ml PBS.Filtersteriliser opløsningen gennem et 0,22 um filter og varme ved 80 ° C i 12 min.
Bemærk: Forbered denne løsning dagen før til celle plettering og opbevares ved 4 ° C. - Aspirer fibronectin opløsningen og vask 3 gange med PBS. Der tilsættes 1 ml varmedenatureret BSA i PBS til hver brønd og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Trypsinisér og tælle celler af valg medens durotaxis kamre blokerer med varmedenatureret BSA.
- Plade 1 x 10 5 celler i et volumen på 2 ml i hver brønd af durotaxis kammeret, ved hjælp af mediet er nødvendig for den særlige celletype af valg. Lade cellerne adhærere og spredes på substratet i 4 timer i en befugtet inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
BEMÆRK: U2OS celler rutinemæssigt opretholdt i DMEM med 10% FBS, suppleret med 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat og 10 IU / ml penicillin, 10 ug / ml streptomycin.
BEMÆRK: celleantallet anvendt i dette eksempel er optimeret tilU2OS celler. Optimering for andre celletyper kan være påkrævet. Denne tæthed giver cellerne plads nok til at migrere uden signifikante interaktioner med andre celler.
3. Levende-celle Imaging
- Optræde live cell imaging på et omvendt mikroskop, ved hjælp af fase kontrast med en 10X målsætning. Mikroskopet skal være forsynet med en lukket miljø, befugtet kammer, hvilket tillader styring af temperatur ved 37 ° C og 5% CO2 under langvarig billeddannelse.
- Efter at cellerne har spredt i ca. 3,5 time, samle pladen i mikroskopet kammeret. Lad prøven (r) at ækvilibrere i kammeret i 30 min.
- Opsæt automatiseret, multi-point besøger på den tilgængelige mikroskop, hvis. Fokus på grænsefladen mellem de 90: 1 PDMS og dækglas og vælg peger på billedet hele interfacet med et gennemsnit på 40 point pr durotaxis kammer. Billede cellerne hver 10 min i op til 16 timer.
BEMÆRK: region af interesse vil blive vist som to linjer, med den ydre linie svarende til kanten af dækglasset og den indre linje svarende til den faktiske grænsefladen mellem PDMS og dækglasset. Se figur 1B.
4. Data Analysis
- Generere et regneark som vist i tabel 1.
- Tæl antallet af hændelser krydsende fra PDMS til glasoverfladen og omvendt fra hver film genereret. Registrere antallet af hændelser krydsende i den relevante kolonne i Excel-regneark.
BEMÆRK: En passage tilfælde defineres som cellekernen passerer over grænsen mellem PDMS og glas i begge retninger. - For at kvantificere flere passager, tælle antallet af gange cellen krydsede grænsefladen. Dette antal skal registreres i excel kolonnen, der svarer til substratet, hvor cellen blev placeret i slutningen af filmen. Gentag analysen for hver celle, der krydser grænsefladen i tHan film. Udeluk celler, der migrerer ud af synsfeltet under billeddannelse.
BEMÆRK: Det er også vigtigt at kontrollere ved celletælling ved begyndelsen af forsøget, at cellerne er i stand til at klæbe lige til fibronectincoatede PDMS og dækglas overflader. - Beregn procentdelen af celler, der er migreret fra PDMS til glasoverfladen (dvs. undergik durotaxis). Tilføj det antal krydser hændelser fra blød til hård og de begivenheder, flere overgangssteder, der sluttede på hårde og dividere med det samlede antal hændelser krydsende.
- Beregn procentdelen af flere passager ved at dividere antallet af flere passager med det samlede antal afgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skematisk af durotaxis kammeret er vist i figur 1A. Blød PDMS substrat (en 90: 1 blanding af PDMS base at tværbinder opløsninger) er spredt i en 6-brønds skål og et dækglas anbringes oven på PDMS, som derefter dækker delvist den øvre overflade af dækglasset, hvorved der skabes en grænseflade mellem de to substrater af forskellig overholdelse. Stivheden af den bløde PDMS substratet er ~ 1 kPa, der kan sammenlignes med den typiske overholdelse af hjernevæv, mens stivheden af glas er ca. 1-2 GPa 1. Et fase kontrast billede af grænsefladen mellem PDMS og glas er vist med de hvide pile i figur 1B. Stjernerne betegne to kontrol RNAi celler migrerer mod hårdere underlag. Den pjaltet kant, der kan ses (sort pil) svarer til kanten af dækglasset.
At kvantificere data bør et Microsoft Excel-regneark genereres som i tabel 1 </ strong>. Antallet af hændelser krydsende skal tælles og organiseret i den tilsvarende kolonne. Nogle af filmene genererede kan ikke anvendes til kvantificering. En film kan udelades fra kvantificering, hvis der er en boble i PDMS, der forstyrrer en udvikling eller celler, hvis cellerne for tæt pakket, hvilket resulterer i kollisioner, der kan drastisk påvirke celle retningsbestemmelse. Celledeling bør også overvåges, da dette kan også åbenlyst påvirke celle bevægelse.
Typisk vil de fleste vedhængende celletyper fortrinsvis migrere mod et stivere substrat 2,4,12. Til at begynde at forstå den molekylære mekanisme, hvormed celler reagere på mekaniske signaler i deres miljø, kan specifikke proteiner blive slået ned med siRNA. I vores eksempel, omkring 70% af de kontrolforanstaltninger siRNA-behandlede celler udviste durotaxis figur 2A. I slående kontrast, da cdGAP blev slået ned ved hjælp RNAi, cellerne havde ingen præferenceom, hvorvidt de migrerede på hårde eller bløde substrat figur 2A. Desuden cdGAP Knockdown cellerne krydsede grænsen flere gange, mens kontrol siRNA behandlede celler generelt kun krydsede grænsen én gang, figur 2B. Repræsentative spor af kontrol siRNA celler viser, at cellerne generelt vandrer tværs over grænsen en gang og fortrinsvis opholdt sig på mere stiv overflade i forhold til cdGAP siRNA-behandlede celler, der ikke demonstrerer en præference for enten stivhed og krydsede grænsen flere gange Figur 2C.
Figur 1. Skematisk af Durotaxis kammeret oprettet. (A) Soft PDMS spredes i hver brønd i en 6-brønds skål og et dækglas anbringes oven på PDMS. PDMS vil gribe ind over siderne af toppen af dækglasset, BEFmalm det hærder, at danne en grænseflade mellem de to substrater. Durotaxis bestemmes ved at udføre retningen af cellerne passerer PDMS / glas-grænsefladen. (B) repræsentant fase kontrast billede, der viser grænsefladen mellem de bløde PDMS og stift glassubstrat. Stjernerne viser kontrol RNAi-behandlede U2OS celler, der undergår durotaxis. De hvide pilespidser betegne grænsefladen mellem PDMS og dækglas og pilen angiver kanten af dækglas under PDMS. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Skematisk af Microsoft Excel-regneark oprettet. Kolonnerne er etableret for at omfatte filmnummer, siRNA, antal celler, der er migreret fra den bløde PDMSstive glassubstrat eller omvendt, samt det samlede antal analyserede celler. Kolonner er også oprettet for cellerne, der krydser interface flere gange og ender på enten de bløde PDMS eller glas substrat. Hvis en celle migrerer på tværs af grænsen flere gange, er antallet af flere krydsende begivenheder af disse celler optaget i kolonnen af substratet, hvorpå cellen er placeret i slutningen af filmen.
Figur 2. Knockdown af cdGAP i U2OS celler forårsager et tab af durotaxis. (A) Kontrollen siRNA behandlede celler migrerer fortrinsvis på den stive glas substrat, mens cdGAP siRNA behandlede celler ikke udviste nogen præference. (B) Styring siRNA behandlede celler krydsede grænsen mellem PDMS og glas en gang. Men cdGAP RNAi-behandlede celler migreret frem og tilbage på tværs af boundary flere gange. (C) Spor af repræsentative celler behandlet med enten kontrol eller cdGAP siRNA blev genereret ved hjælp af Manuel sporing plugin i ImageJ. P-værdier blev bestemt under anvendelse af en t-test og fejl søjler repræsenterer 95% konfidensinterval. Gengivet med tilladelse fra Wormer et al. 2014 11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri beskrives en enkel assay at studere durotaxis i migrerende celler. En stor styrke i denne analyse er den nemme forberede durotaxis kamre ved hjælp af PDMS. Stivheden af substraterne kan nemt manipuleres ved at ændre forholdet mellem PDMS baseopløsning til tværbinder for at tillade undersøgelse af forskellige stivheder i assayet. En potentiel begrænsning af systemet er imidlertid, at cellerne kun udsat for en enkelt ændring i substratet stivhed i modsætning til oplever stivhed gradient, der leveres af mere avancerede systemer 4. Det er vigtigt, i modsætning polyacrylamid substrater, ECM komponenter behøver ikke at være kemisk tværbundet til PDMS. Faktisk fibronectincoating svarer omtrent på begge PDMS og glasoverflader, som bestemt ved farvning med et antistof specifikt til fibronectin 11. Da tidligere undersøgelser har vist, at celler opfører sig på samme på enten PDMS eller polyacrylamid substrater, anvendelsen of PDMS substrater giver en meget lettere model med at studere mechanotransduction i celler 10,12.
Det vigtigste skridt i forberedelsen af de PDMS substrater er at sikre, at basen og tværbinderen løsninger grundigt blandes. Hvis de ikke er blandet godt nok, så substraterne ikke helt helbrede efter varmebehandling. Dette vil resultere i dækglasset at synke for langt ind i PDMS eller dækglasset drivende i PDMS under billedbehandling. Hvis centrifugering kraft er for høj, kan løsningerne basis- og tværbinder adskilt i røret. Dette kan afhjælpes ved at reducere centrifugering hastighed eller ved afgasning af blandingen i 30 minutter ved hjælp af et vakuumkammer. Endelig celledensitet er kritisk, da alt for mange celler vil påvirke deres evne til at sprede fuldt ud og til at durotax uhindret ved kontakt med naboceller. Tætheden rapporteret heri er optimeret til U2OS celler. Men hvis der anvendes andre celletyper, optimal cell-numre skal bestemmes empirisk.
Vi har for nylig brugt denne analyse til at undersøge, hvordan omdrejningspunktet vedhæftning signalering protein cdGAP regulerer mechanosensing og durotaxis 11. Det er klart, der er mange cellulære komponenter ud over fokale sammenvoksninger, såsom cytoskeletelementer, komponenter protein menneskehandel og ionkanaler, der er involveret i mekanisk signalering og kan således også bidrage til reguleringen af durotaxis 13-15. Hver af disse komponenter kan let evalueres i vores system under anvendelse af lignende fremgangsmåder RNAi. Desuden er denne assay er meget modtagelig for indførelse af forskellige farmakologiske aktivatorer eller inhibitorer. Assayet kan også tilpasses til at tillade mere sofistikerede former for analyse, såsom inkorporering af fluorescens-mærkede proteiner, i kombination med FRET eller FRAP metoder, for at studere protein dynamik og spatio-temporale aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af NIH R01 GM47607, CA163296 og NSF 1.334.493 til CET. Vi takker medlemmer af Turner laboratorium for kritisk læsning af manuskriptet. Alle er vist i denne rapport data blev gengivet med tilladelse fra Wormer et al. 2014 11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12 mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
References
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).
- Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).
- Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).
- Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).
