Abstract
Kompositionen och mekaniska egenskaperna hos den extracellulära matrisen är mycket variabla mellan vävnadstyper. Denna bindväv stroma mångfald kraftigt påverkan cellens beteende för att reglera normala och patologiska processer inklusive celltillväxt, differentiering, vidhäftning signalering och riktad migration. I detta avseende, att den inneboende förmågan hos vissa celltyper migrerar mot en styvare eller mindre eftergivliga matrissubstratet benämnes durotaxis. Detta fenomen spelar en viktig roll under fosterutvecklingen, sårreparation och cancercellinvasion. Här beskriver vi en enkel analys för att studera durotaxis, in vitro, användning av polydimetylsiloxan (PDMS) substrat. Framställning av den beskrivna durotaxis kamrarna skapar en styvhet gränssnitt mellan den relativt mjuka PDMS gel och en stel täckglas. I exemplet har vi använt dessa durotaxis kammare för att visa en roll för cdc42 / RAC1 GTPase aktiverande protei, cdGAP i mechanosensing och durotaxis reglering i mänskliga U2OS osteosarkomceller. Denna analys kan lätt anpassas till andra typer och / eller knockdown av andra proteiner intressecell att utforska sina respektive roller i mechanosignaling och durotaxis.
Introduction
Den extracellulära matrisen (ECM) är sammansatt av en komplex matris av strukturella och tvärbindnings proteiner inkluderande kollagen, fibronektin och laminin. Även om det är väl etablerat att ECM ger viktiga strukturellt stöd för cellulära vävnader, det finns allt fler bevis som tyder på att celler aktivt svara på fysiska förändringar i sin ECM miljö att reglera olika cellulära processer, inklusive cellöverlevnad, differentiering och cellmigration. Till exempel kan skillnader i styvhet ECM driva mesenchymala stamceller mot olika härstamningar, med mjuka substrat (~ 1 kPa) främjar neurogena härstamningar medan styva (~ 25 kPa) substrat främja osteogen differentiering 1. På liknande sätt har en ökning av den stromala matrisen styvhet visats befrämja juver epitelceller tumorigenes och invasion in i den omgivande vävnaden 2,3.
En särskilt intressant aspekt av denna mechanosignAling aktivitet resulterar i en process som kallas durotaxis, i vilka celler migrerar företrädesvis mot en mer styvt substrat 4,5. Celler ständigt känner de fysiska egenskaperna hos deras extracellulära miljön genom integrinreceptorbindning till ECM. Detta, i sin tur, gynnar ansamling av många strukturella och signalerande proteiner till sina cytoplasmatiska domäner för att driva bildningen av vidhäftande strukturer kända som fokala kontakter eller fokala kontakter 6,7. Eftersom integriner har någon inneboende enzymatisk aktivitet, signaler förmedlas från ECM genom dessa proteiner att samordna cellens svar på deras föränderlig miljö 8. Följaktligen är identifiering och karakterisering av de viktigaste proteiner involverade i regleringen mechanosignaling och durotaxis ett viktigt område för utredning.
Olika modellsystem har utvecklats för att studera durotaxis in vitro, men de flesta harutnyttjade kollagenbelagda polyakrylamid substrat 4. Emellertid kan framställningen av polyakrylamid substraten vara tekniskt utmanande och kollagenet som användes i dessa analyser måste vara kemiskt tvärbunden till substratet 9. Polydimetylsiloxan (PDMS) substrat har visat sig uppvisa jämförbara mekaniska egenskaper till polyakrylamid substraten 10. Emellertid är PDMS substrat framställes genom enkel blandning av ett förhållande av basen för att tvärbindningsmedel och dessa substrat kan beläggas med ECM-proteiner utan behov av kemisk tvärbindning, vilket gör PDMS ett enklare verktyg för att studera effekterna av styvhet på cellbeteende. Häri beskriver vi hur du förbereder en enkel durotaxis kammare, i vilken en mjuk PDMS substrat är integrerad med en stel glastäck.
Analysen, som beskrivs nedan, ger en snabb och enkel metod för att studera durotaxis. För denna studie har vi använt humana U2OS osteosarkomceller kombination med siRNA-medieradknockdown av cdGAP att studera betydelsen av detta fokus adhesionsprotein i durotaxis 11. Viktigt, kan detta protokoll lätt anpassas till individuella behov. Andra celltyper kan användas i stället för U2OS cellerna och vilket protein som helst kan slås ner eller överuttryckt att bestämma effekterna på cellbeteende under durotaxis. Dessutom kan detta protokoll anpassas för att införliva fluorescerande taggade proteiner för att analysera deras dynamik och beteenden med hjälp av FRAP eller FRET metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av Durotaxis Chambers
- För att framställa en 6-brunnsvävnadsodlingsplatta, tarera balans med en 50-ml koniskt rör. Väg in ca 10 g av PDMS baslösningen i 50-ml rör (lösningen är ganska viskös).
- För en 90: 1-substrat (Överensstämmelse av ~ 1 kPa), dela upp den uppmätta vikten av PDMS baslösningen i röret genom 90 att bestämma den korrekta mängden tvärbindningsmedel-lösning behövs. Lägg den beräknade mängden PDMS tvärbindare lösningen till samma rör.
Exempel: 10 g / 90 = 0,11 g. Lägg 0,11 g av PDMS tvärbindningslösningen till PDMS baslösningen.
OBS: Basen och tvärbindande lösningar båda ges i PDMS kit. - Med kraft blanda PDMS bas / tvärbindare blandningen under 5 min vid RT med användning av en liten spatel. I detta skede blandningen kommer att innehålla ett stort antal luftbubblor.
- Centrifugera PDMS substratet i en bordscentrifug under 5 min vid 50 x g vid RT för avlägsnande av bubbles. Om det fortfarande finns bubblor efter 5 minuter, centrifugera igen.
- Pipettera 1 ml 90: 1 PDMS substrat i varje brunn i vävnadsodlingsbehandlad 6-brunnar. Eventuella återstående luftbubblor i PDMS kan gallras ut i detta skede genom att spräcka dem med en 21 G-nål. Låt PDMS att sprida under 30 minuter i brunnen.
- Koka 12 mm glas # 1 täck i destillerat vatten i 5 minuter. Upprepa två gånger och lagra täckglas i destillerat vatten.
- Placera en, torkade täck i varje brunn i vävnadsodlingsplatta genom att försiktigt trycka på en sida av täck i PDMS lösningen sedan släppa täck på PDMS. Som täckglas lägger sig, kommer PDMS börjar inkräkta över kanterna på täckglaset, men kommer inte helt täcka det. Detta kommer att generera ett gränssnitt mellan PDMS och glas efter härdning (se figur 1A, B).
- Inkubera plattan vid 70 ° C i en ugn under 16 h för att härda (stelna) PDMS. Placera plate på en cellkultur huva och UV sterilisera i 10 minuter.
OBS: Det är bäst att göra plattorna inom ett par dagars användning. Emellertid kan plattorna vara insvept i Parafilm utan någon buffert och förvarades vid 4 ° C i upp till två veckor utan någon märkbar minskning i kvalitet.
2. Cell Plätering
OBS: Om att studera effekten av siRNA-medierad knockdown, utför knockdown med hjälp av tillverkarens instruktioner eller optimerat protokoll för celltypen av val.
- Coat varje durotaxis kammare med 1 ml av 10 | ig / ml fibronektin i PBS utan kalcium och magnesium för en timme vid 37 ° C. Alternativt kan fibronektin appliceras dagen före analys genom att inkubera PDMS med 10 | ig / ml fibronektin i PBS under 16 h vid 4 ° C. Se till att hela ytan är nedsänkt i fibronektin i PBS-lösning.
- Förbered värmedenaturerad 1% BSA. Väg 0,5 g BSA och lös den i 50 ml PBS.Filtrera sterilisera lösningen genom ett 0,22 pm filter och värm vid 80 ° C under 12 minuter.
Anmärkning: Bered denna lösning dagen före cell plätering och förvara vid 4 ° C. - Aspirera fibronektinlösningen och tvätta 3 gånger med PBS. Tillsätt 1 ml av värmedenaturerad BSA i PBS till varje brunn och inkubera under 30 min vid RT.
- Trypsinize och räkna celler av val medan durotaxis kamrarna blockerar med värmedenaturerat BSA.
- Plansch 1 x 10 5 celler i en volym av 2 ml i varje brunn i durotaxis kammaren, med hjälp av media som krävs för den särskilda celltypen av val. Låta cellerna vidhäfta och sprida på substratet för 4 h i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% CO2.
Anmärkning U2OS celler rutinmässigt i DMEM med 10% FBS, supplementerat med 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, och 10 lU / ml penicillin, 10 | ig / ml streptomycin.
OBS: Cellantalet som används i detta exempel är optimerad förU2OS celler. Optimering för andra celltyper kan krävas. Denna densitet ger cellerna tillräckligt med utrymme för att migrera utan signifikanta interaktioner med andra celler.
3. Live-cell imaging
- Uppträda live cell imaging på ett inverterat mikroskop, använder faskontrast med en 10X mål. Mikroskopet bör vara försedd med en sluten miljö, fuktig kammare, vilket möjliggör kontroll av temperaturen vid 37 ° C och 5% CO2 under långtids avbildning.
- Efter att cellerna har spridit för ca 3,5 h, montera plattan i mikroskopet kammaren. Låt provet (er) att jämvikta i kammaren under 30 minuter.
- Ställ in automatiserad, multi-point besöker på mikroskop om det finns. Fokus på gränssnittet mellan 90: 1 PDMS och glastäck och välj pekar på bilden hela gränssnittet med ett genomsnitt på 40 poäng per durotaxis kammaren. Image cellerna var 10 min för upp till 16 timmar.
OBS: Den förnyadegion av intresse kommer att visas som två rader, med den yttre linjen motsvarar kanten av täckglas och den inre linjen som motsvarar den faktiska gränsytan mellan PDMS och täckglas. Se figur 1B.
4. Dataanalys
- Generera ett kalkylblad såsom i tabell 1.
- Räkna antalet korsningshändelser från PDMS till glasytan och omvänt från varje film genereras. Registrera antalet korsningshändelser i lämplig kolumn i Excel-ark.
OBS: En korsning händelse definieras som cellkärnan passerar över gränsen mellan PDMS och glas i endera riktningen. - För att kvantifiera flera korsningar, räkna antalet gånger cellen korsade gränssnittet. Detta nummer ska registreras i Excel kolumn motsvarar substratet på vilket cellen var belägen i slutet av filmen. Upprepa analysen för varje cell som korsar gränssnittet i than film. Uteslut celler som migrerar ut ur synfältet under avbildning.
OBS: Det är också viktigt att genom cellräkning i början av experimentet, att cellerna kan fästa lika till fibronektinbelagda PDMS och glas täckytor. - Beräkna procentandelen celler som migrerat från PDMS till glasytan (dvs gick durotaxis). Tillsätt antalet korsa händelser från mjuka till hårda och många korsande händelser som avslutades den hårt och dividera med det totala antalet korsande händelser.
- Beräkna andelen flera gånger passera genom att dividera antalet flera korsningar med det totala antalet överfarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk bild av durotaxis kammaren visas i Figur 1A. Mjuk PDMS substrat (en 90: 1 blandning av PDMS bas för att tvärbindningslösningar) sprids i en 6 väl skålen och ett täckglas placeras på toppen av PDMS, som sedan delvis täcker den övre ytan på täckglas, och därigenom skapa en gränsyta mellan de två substraten av olika efterlevnad. Styvheten av den mjuka PDMS substratet är ~ 1 kPa, vilket är jämförbart med den typiska efterlevnad av hjärnvävnad, medan styvheten hos glas är ca 1-2 GPa ett. En faskontrastbild av gränssnittet mellan PDMS och glas visas av de vita pilspetsar i figur 1B. Asteriskerna markerar två kontroll RNAi celler migrerar mot hårdare underlag. Den trasiga kanten som kan ses (svart pil) motsvarar kanten av täckglas.
För att kvantifiera data bör en Microsoft Excel genereras som i tabell 1 </ strong>. Antalet korsande händelser bör räknas och organiseras i motsvarande kolumn. Några av filmerna som genereras kan inte användas för kvantifiering. En film kan utelämnas från kvantifiering om det finns en bubbla i PDMS som stör en celler pågår eller om cellerna är alltför tätt packade, vilket resulterar i kollisioner som drastiskt kan påverka cellrikt. Celldelning bör också övervakas, eftersom detta kan också öppet påverka cellrörelse.
Vanligtvis kommer de flesta vidhäftande celltyper företrädesvis migrerar mot en styvare substrat 2,4,12. Att börja förstå den molekylära mekanism genom vilken celler svarar på mekaniska signaler i sin omgivning, kan specifika proteiner slås ner med siRNA. I vårt exempel, cirka 70% av kontroll siRNA-behandlade celler uppvisade durotaxis figur 2A. I slående kontrast, när cdGAP slogs ner med RNAi, cellerna hade ingen preferensom huruvida de migrerade på hård eller mjuk substrat Figur 2A. Vidare cdGAP knockdown celler korsade gränsen flera gånger, medan kontroll siRNA behandlade celler i allmänhet bara korsade gränsen en gång, figur 2B. Representativa spår av kontroll siRNA celler visar att cellerna migrerar allmänhet över gränsen en gång och företrädesvis stannade på styvare ytan jämfört med cdGAP siRNA-behandlade celler som inte visar en preferens för antingen styvhet och korsade gräns flera gånger figur 2C.
Figur 1. Schematisk av Durotaxis kammaren inrättas. (A) Mjuk PDMS sprids i varje brunn i en 6-brunnsskål och ett täckglas placeras på toppen av PDMS. PDMS kommer inkräkta över sidorna av den övre delen av täckglas, befmalm det härdar, för att bilda ett gränssnitt mellan de två substraten. Durotaxis bestäms genom poängsättning riktningen på cellerna passerar PDMS / glas gränssnittet. (B) Representativa faskontrastbild visar gränsytan mellan de mjuka PDMS och styva glassubstrat. Asteriskerna visar kontroll RNAi behandlade U2OS celler som genomgår durotaxis. De vita pilspetsar anger gränssnittet mellan PDMS och täckglas och pilen indikerar kanten av glaset täck under PDMS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Schematisk av Microsoft Excel inrättas. Kolumnerna inrättas för att inkludera filmen nummer, siRNA används, antalet celler som migrerat från de mjuka PDMSden stela glassubstrat eller vice versa, liksom det totala antalet analyserade celler. Kolumner också inrättas för de celler som korsar gränssnitts flera gånger och slutar på antingen mjuka PDMS eller glassubstrat. Om en cell migrerar tvärs gräns flera gånger, är antalet multipla korsnings händelser av dessa celler in i kolonnen av substratet på vilken cellen var belägen vid slutet av filmen.
Figur 2. Knockdown av cdGAP i U2OS celler orsakar en förlust av durotaxis. (A) Kontroll siRNA behandlade celler migrerar företrädesvis på den styva glassubstrat, medan cdGAP siRNA behandlade celler inte uppvisade några preferenser. (B) Kontroll siRNA behandlade celler korsade gränsen mellan PDMS och glas gång. Men cdGAP RNAi-behandlade celler migrerade fram och tillbaka över boundary flera gånger. (C) Spår av representativa celler behandlades med antingen kontroll eller cdGAP siRNA genererades med hjälp av Manuell spårning plugin i ImageJ. P-värdena bestämdes med användning av ett Students t-test och fel staplarna representerar 95% konfidensintervall. Reproducerat med tillstånd från Wormer et al. 2014 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri beskriver vi en enkel analys för att studera durotaxis i migrera celler. En stor styrka med denna analys är det lätt att framställa durotaxis kamrarna med hjälp av PDMS. Styvheten av substraten lätt kan manipuleras genom att ändra förhållandet av PDMS baslösningen till tvärbindare för att medge studier av olika trögheter i analysen. Men det är en potentiell begränsning av systemet som cellerna är utsatta för endast en enda förändring i substrat styvhet i stället för att uppleva en styvhet gradient som tillhandahålls av mer sofistikerade system 4. Viktigt är till skillnad från polyakrylamid substrat, de ECM-komponenter inte behöver vara kemiskt tvärbunden till PDMS. I själva verket är ungefär ekvivalent både PDMS och glasytorna fibronektin beläggning, såsom bestämt genom färgning med en antikropp specifik för fibronektin 11. Sedan tidigare studier har visat att celler beter sig på samma på antingen PDMS eller polyakrylamid substrat, användning of PDMS substrat ger en mycket enklare modell med att studera mechanotransduction i celler 10,12.
Det viktigaste steget i framställningen av PDMS substrat är att se till att basen och de tvärbindande lösningarna blandas ordentligt. Om de inte blandas väl nog, då substraten kommer inte helt bota vid värmebehandling. Detta kommer att resultera i täck sjunker alltför långt in i PDMS eller täck drivande i PDMS under avbildning. Om centrifugeringskraft är för hög, kan bas- och tvärbindningslösningar separat i röret. Detta kan avhjälpas genom att reducera centrifugehastigheten eller genom avgasning av blandningen under 30 min med användning av en vakuumkammare. Slutligen, är celldensitet kritisk, eftersom alltför många celler kommer att påverka deras förmåga att sprida sig helt och durotax obehindrat genom kontakt med angränsande celler. Densiteten redovisas häri var optimerad för U2OS celler. Om emellertid andra celltyper används, optimalt cell siffror måste bestämmas empiriskt.
Vi har nyligen använt denna analys för att studera hur fokus vidhäftning signalering protein cdGAP reglerar mechanosensing och durotaxis 11. Uppenbarligen finns det många cellkomponenter förutom fokala kontakter, såsom cytoskeletala element, protein människohandel komponenter och jonkanaler som är involverade i mekanisk signalering och därmed kan också bidra till regleringen av durotaxis 13-15. Var och en av dessa komponenter kan lätt utvärderas i vårt system med liknande RNAi metoder. Dessutom är denna analys är mycket mottagliga för införandet av olika farmakologiska aktivatorer eller inhibitorer. Analysen kan också anpassas för att möjliggöra mer sofistikerade former av analys, såsom införlivandet av fluorescerande-märkta proteiner, i kombination med FRET eller FRAP metoder för att studera proteindynamik och spatiotemporala aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH R01 GM47607, CA163296 och NSF 1334493 till CET. Vi tackar medlemmar i Turner laboratorium för kritisk läsning av manuskriptet. Alla data som visas i denna rapport återges med tillstånd från Wormer et al. 2014 11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12 mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
References
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).
- Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).
- Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).
- Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).
