Abstract
細胞外マトリックスの組成及び機械的特性は、組織型間で高度に可変です。この結合組織の間質の多様性に大きく影響を与える細胞の挙動細胞増殖、分化、接着シグナリングおよび方向性のある移動を含む正常および病理学的過程を調節するために。この点において、特定の細胞型の生来の能力がdurotaxisと呼ばれる堅い、以下に準拠マトリクス基板に向かって移動します。この現象は、胚発生、創傷修復及び癌細胞浸潤の間に重要な役割を果たしています。ここでは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）基板を用いて、in vitroで 、durotaxisを研究するための簡単なアッセイを説明します。室durotaxis記載の製造は比較的柔らかいPDMSゲルと硬質カバーガラスとの間に剛性のインターフェースを作成します。提供された例では、CDC42 / Rac1のGTPアーゼ活性化proteの役割を実証するために、これらのdurotaxis室を使用していましたcdGAP、で、mechanosensingと人間のU2OS骨肉腫細胞におけるdurotaxis規制インチこのアッセイは、他の細胞型および/またはmechanosignalingとdurotaxisにおけるそれぞれの役割を探求するための利益の他のタンパク質のノックダウンに容易に適合可能です。
Introduction
細胞外マトリックス（ECM）は、コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンを含む構造と架橋タンパク質の複雑な配列で構成されています。それは十分にECMは細胞組織のための重要な構造的支持を提供することが確立されているが、細胞が活発に細胞生存、分化および細胞遊走を含む多様な細胞プロセスを調節するために、それらのECM環境の物理的変化に応答することを示す証拠が増えてきています。硬い（〜25キロパスカル）の基板は骨形成分化1を促進しながら、例えば、ECMの剛性の違いは、ソフト基板（〜1キロパスカル）神経性系統を促進して、異なる系統に向けて、間葉系幹細胞を駆動することができます。同様に、間質マトリックスの剛性の増加は、周囲の組織2,3に乳腺上皮細胞の腫瘍形成および浸潤を促進することが示されています。
このmechanosignの特に興味深い点細胞がよりリジッド基板4,5の方に優先的に移行するdurotaxis、として知られているプロセスでの活動結果をaling。細胞は常に、ECMに結合するインテグリン受容体を介して、それらの細胞外環境の物理的特性を感知します。これは、順番に、接着斑または焦点コンタクト6,7として公知の接着剤構造の形成を駆動するために、それらの細胞質ドメインに、多数の構造的およびシグナル伝達タンパク質の蓄積を促進します。 インテグリンは全く固有の酵素活性を有していないので、信号がその環境変化〜8セルの応答を調整するために、これらのアクセサリータンパク質を介して、ECMから中継されます。従って、mechanosignalingとdurotaxisの調節に関与する重要なタンパク質の同定および特徴付けは、研究の重要な領域です。
様々なモデル系は 、in vitroでdurotaxisを研究するために開発されてきたが、ほとんどが持っていますコラーゲンコートポリアクリルアミド基材4を用いました。しかし、ポリアクリルアミド基質の製造は技術的に困難であることができ、これらのアッセイで使用されるコラーゲンは、 基板 9に化学的に架橋する必要があります。ポリジメチルシロキサン（PDMS）基板、ポリアクリルアミド基板10に匹敵する機械的特性を示すことが示されています。しかし、PDMS基板は、単に架橋剤を塩基の比を混合することによって調製され、これらの基板は、このようにPDMS細胞挙動に対する剛性の影響を研究するための容易なツールを作製する、化学的架橋を必要とせずに、ECMタンパク質でコーティングすることができます。ここで、我々はソフトPDMS基板は、硬質ガラスカバースリップで一体化された単純なdurotaxis室を準備する方法について説明します。
アッセイは、以下に概説するように、durotaxisを研究するために迅速かつ簡単な方法を提供します。この研究のために、我々は、siRNA媒介と組み合わせ、人間のU2OS骨肉腫細胞を使用しましたdurotaxis 11でこの焦点接着タンパク質の役割を研究するcdGAPのノックダウン。重要なことに、このプロトコルは、容易に個々の要件に適合させることができます。他の細胞型は、U2OS細胞に置換されてもよく、任意のタンパク質をノックダウンまたはdurotaxis中の細胞の挙動に影響を決定するために過剰発現することができます。さらに、このプロトコルは、FRAPまたはFRETの手法を使用してダイナミックス及び挙動を分析するためにタグ付けされた蛍光タンパク質を組み込むように適合されてもよいです。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Durotaxisチェンバースの調製
- 1つの6ウェル組織培養プレートを調製するために、50 mlのコニカルチューブとのバランスを風袋引き。 50 mlチューブ中のPDMSベース溶液約10グラムを秤量（溶液は非常に粘性があります）。
- 90：1の基板（〜1キロパスカルのコンプライアンス）、必要に応じて架橋剤溶液の正確な量を決定するために90によってチューブ内のPDMS塩基溶液の測定された重量を分割。同じチューブにPDMSの架橋剤溶液の計算された量を追加します。
例：10グラム/ 90 = 0.11グラム。 PDMSベースのソリューションへのPDMS架橋剤溶液の0.11グラムを追加します。
注：ベースと架橋剤溶液は、両方のPDMSキットで提供されています。 - 精力的に小さなへらを使用して室温で5分間、PDMSベース/架橋剤混合物を混ぜます。この段階で、混合物を多数の気泡を含むであろう。
- BUBを除去するために、室温で50×gで5分間、卓上遠心機でPDMS基板を遠心BLES。残っている場合は、再び5分、遠心分離後に泡。
- 90 mlのピペット1：組織培養の各ウェルに1 PDMS基板を6ウェルプレートを処理しました。 PDMS中に存在する任意の残存する気泡が21 G針を使用してそれらをポップすることにより、この段階で除去することができます。 PDMSは、ウェル中の30分間の広がりを許可します。
- ボイル12ミリメートルのガラス＃5分間蒸留水で1カバースリップ。 2回繰り返し、蒸留水にカバースリップを格納します。
- 静かにPDMS上にカバーガラスをドロップし、PDMS溶液にカバースリップの片側をタッチすることで、組織培養プレートの各ウェルに1、乾燥したカバーガラスを配置します。カバーガラスが安定するように、PDMSはカバーガラスの縁の上に侵入し始めますが、それを完全にカバーしています。これは、（ 図1A、B参照）硬化後、PDMSとガラスの間のインターフェイスを生成します。
- （硬化）PDMSを硬化させる16時間オーブンで70℃でプレートをインキュベートします。 PLATを配置細胞培養フードとUVの電子は、10分間滅菌します。
注：これは、使用の数日以内にプレートを作るのがベストです。しかし、プレートは任意のバッファなしパラフィルムで包み、品質の顕著な低下させることなく2週間まで4℃で保存することができます。
2.細胞播種
注：siRNA媒介ノックダウンの効果を研究する場合は、製造元の指示や選択の細胞型に最適化されたプロトコルを使用してノックダウンを行います。
- 各コートは、37°Cで1時間、カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBS中10μg/ mlのフィブロネクチン1mlのチャンバdurotaxis。あるいは、フィブロネクチン、4℃で16時間、PBS中10μg/ mlのフィブロネクチンでPDMSをインキュベートすることによって、分析前に一日適用することができます。全面をPBS溶液中のフィブロネクチンに沈めていることを確認します。
- 熱変性1％BSAを準備します。 0.5グラムのBSAを秤量し、PBS 50ml中に溶解します。フィルターは、12分間80℃で0.22μmのフィルターと熱を通して溶液を滅菌します。
注：前に4℃での細胞播種と店に一日、この溶液を調製します。 - フィブロネクチン溶液を吸引し、PBSで3回洗浄します。各ウェルにPBS中の熱変性BSAを1ml加え、室温で30分間インキュベートします。
- durotaxis室が熱変性BSAでブロックしている一方でトリプシン処理し、選択の細胞をカウントします。
- プレートの選択の特定の細胞型に必要なメディアを使用してdurotaxis室の各ウェルに2ミリリットルの容量で、1×10 5細胞 、。細胞が付着し、5％CO 2で37℃の加湿インキュベーター中で4時間、基板上に塗布することを許可します。
注：U2OS細胞を日常的に2mMのL-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、および10 IU / mlのペニシリン、を10μg/ mlのストレプトマイシンを補充した、10％FBSを含むDMEM中で維持されています。
注：この例で使用される細胞数は、のために最適化されU2OS細胞。他の細胞型のための最適化が必要とされ得ます。この密度は、細胞を他の細胞との相互作用の重要なことなく移行するための十分なスペースを提供します。
3.ライブセルイメージング
- 10倍の対物レンズとの位相差を使用して、倒立顕微鏡でライブセルイメージングを実行します。顕微鏡は、長期的画像化の間に37℃の温度を制御し、5％CO 2を可能に囲まれた環境、加湿チャンバーを装着しなければなりません。
- 細胞は約3.5時間に広がった後、顕微鏡室にプレートを組み立てます。サンプル（s）は30分間チャンバー内で平衡化することを許可します。
- 利用可能な場合、顕微鏡に訪問し、自動化、マルチポイントを設定します。 90との間のインターフェイスに焦点を当て：1 PDMSとカバーガラスとdurotaxis室あたり40点の平均とすべてのインターフェイスの周りに画像にポイントを選択します。画像セルまでの16時間ごとに10分。
注：再興味のある祇園は、カバーガラスのエッジとPDMSとカバーガラスとの間の実際のインタフェースに対応する内側のラインに対応する外側のラインで、二行として表示されます。 図1Bを参照してください 。
4.データ解析
- 表1のように 、スプレッドシートを生成します。
- 生成された各ムービーからガラス表面およびその逆に、PDMSから交差イベントの数をカウントします。 Excelスプレッドシート内の適切な列に交差するイベントの数を記録します。
注：交差イベントがいずれかの方向にPDMSとガラスの間の境界を通過する細胞の核として定義されます。 - 複数の交差を定量化するために、細胞を界面を越えた回数をカウントします。その数は、細胞は、映画の最後に位置された基板に対応するExcelの列に記録する必要があります。トンのインターフェイスを横断するセル毎に解析を繰り返し彼の映画。撮像中に視野の外に移動する細胞を除外します。
注：これは、細胞は、フィブロネクチンでコーティングされたPDMSとカバーガラスの表面に均等に付着することができることを、実験の開始時に細胞計数によって、検証することも重要です。 - （ すなわち、durotaxisを受けた）ガラス表面にPDMSから遊走した細胞の割合を計算します。ソフトからハードまでのイベントと交差イベントの合計数で、ハードと除算に終了した複数の交差事象を通過する数を追加します。
- 交差の総数で複数の交差の数を分割して複数の交差の割合を計算します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
durotaxisチャンバの概略図は 、図1Aに示されています。ソフトPDMS基板を、（90：ソリューションを架橋するために、PDMSベースの1混合物）を6ウェル皿に広げ、カバーガラスがそれによってインターフェースを作成し、部分的にカバーガラスの上面を覆うPDMSの上に配置されます異なるコンプライアンスの2枚の基板の間。ソフトPDMS基板の剛性は、ガラスの剛性は約1 GPaで1~2であるが、脳組織の典型的な適合性に匹敵する約1キロパスカルです。 PDMSとガラスとの界面の位相コントラスト画像は、図1Bの白い矢印で示されています。アスタリスクは難しく基板に向かって移行する二つの制御のRNAi細胞を意味します。見ることができるギザギザのエッジ（黒矢印）はカバーガラスのエッジに対応。
データを定量化するために、Microsoft Excelのスプレッドシートは 、表1のように生成する必要があります</ strong>の。交差事象の数をカウントし、対応する列に編成されるべきです。生成された映画のいくつかは、定量化のために使用することができません。細胞の進行を妨害するか、PDMS中の気泡がある場合、映画を定量化から省略することができる細胞があまりに密集している場合は、大幅に細胞指向性に影響を与えることができ、衝突が生じます。これはまた、あからさまに細胞運動に影響を与えることができるように細胞分裂も、監視する必要があります。
通常、ほとんどの接着細胞タイプは、優先的に剛性の高い基板2,4,12に向かって移動します。細胞がその環境での機械的な合図に応答する分子機構を理解するために開始するには、特定のタンパク質は、siRNAを用いてノックダウンすることができます。この例では、コントロールsiRNA処理細胞の約70％は、図2A durotaxis示しました。 cdGAPがRNAiを用いたノックダウンされた印象的な対照的に、細胞には好みがなかったです彼らはハードまたはソフト基板図2Aに移行かどうかの。また、cdGAPノックダウン細胞は、一般的に一度だけ図2Bの境界を越え対照siRNAで処理した細胞に対し、境界を複数回交差しました。対照siRNA細胞の代表的なトラックは、剛性のいずれかの優先を示し、境界を複数回図2Cを越えなかったcdGAP siRNA処理細胞と比較して、細胞は、一般的に一度、優先的境界を越えて移動するより剛性の表面にとどまったことを示しています。
セットアップDurotaxis室の図1の回路図。（A）ソフトPDMSを6ウェルディッシュの各ウェルに広がっており、カバーガラスは、PDMSの上に配置されます。 PDMSは、カバーガラスの上部の側面の上にBEFを侵害しますそれは、2つの基板の間の界面を形成するために、硬化鉱石。 DurotaxisはPDMS /ガラス界面を横切る細胞の方向性を採点することによって決定されます。 （B）ソフトPDMS及び剛性ガラス基板との界面を示す代表的な位相コントラスト画像。アスタリスクはdurotaxisを受けて制御するRNAi処理したU2OS細胞を示します。 。白矢じりは、PDMSとカバーガラスとの間のインターフェースを表し、矢印は、PDMSの下にカバーガラスの端を示し、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1. Microsoft Excelスプレッドシートの概略を設定します。列は、映画の数を含めるために設立され、siRNAは、使用ソフトPDMSから移動した細胞の数硬質ガラス基板またはその逆、ならびに分析した細胞の総数。カラムは、インターフェイスを複数回を渡り、柔らかいPDMSまたはガラス基板のいずれかで終了セルに対して設定されています。セル境界を複数回横切って移動する場合は、これらの細胞の複数の交差事象の数は、セルは、映画の終わりに位置した際に基板の欄に記録されます。
U2OS細胞におけるcdGAPの図2.ノックダウンはdurotaxisの損失の原因となる。cdGAP siRNA処理細胞は、任意の好みを示さなかったのに対し、（A）コントロールsiRNA処理細胞は、剛性のガラス基板上に優先的に移行します。 （B）対照siRNAで処理した細胞は、一度、PDMSとガラスの間の境界を越えました。しかし、cdGAPのRNAi処理細胞は、B全体で前後に移行しましたoundary複数回。コントロール、またはcdGAP siRNAのいずれかで処理した代表的な細胞の（C）トラックはImageJの中のマニュアルトラッキングプラグインを使用して作成しました。 p値はスチューデントのt検定を用いて測定し、エラーバーは95％信頼区間を表します。駆虫剤ら。2014年11から許可を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで我々は、細胞の移行にdurotaxisを研究するための単純なアッセイを説明します。このアッセイの主な強みは、PDMSを用いdurotaxisチャンバを調製する容易さです。基板の剛性を容易にアッセイにおける様々な剛性の研究を可能にするために、架橋剤にPDMSベース溶液の比率を変えることによって操作することができます。しかし、システムの潜在的な制限は、より洗練されたシステム4によって提供される剛性勾配を経験とは対照的に、細胞が唯一の基質剛性の単一の変化にさらされていることです。重要なのは、ポリアクリルアミド基質とは異なり、ECM成分は、化学的に架橋されたPDMSにする必要はありません。フィブロネクチン11に特異的な抗体で染色することによって決定されるように実際に、フィブロネクチンコーティングは、PDMSおよびガラス表面の両方にほぼ等しいです。以前の研究では、細胞は、PDMSまたはポリアクリルアミド基質のいずれかで同じように動作することを使用のOを示しているので、F PDMS基板10,12細胞でメカノを研究するとはるかに簡単にモデルを提供します。
PDMS基板の製造において最も重要なステップは、ベースと、架橋剤溶液が完全に混合されることを保証することです。彼らは十分に混合されない場合は、基板が完全に熱処理により硬化しません。これは、PDMSまたは撮像中にPDMSに漂流カバースリップにすぎ沈んでカバースリップになります。遠心力が高すぎると、基材と架橋剤の溶液を管に分離することができます。これは、遠心分離速度を減少させることによって、または、真空チャンバを用いて30分間混合物を脱気することによって改善することができます。あまりにも多くの細胞が完全に拡散すると、隣接する細胞との接触によって妨害されずdurotaxする能力に影響を与える最後に、細胞密度は、非常に重要です。本明細書で報告密度は、U2OS細胞用に最適化しました。しかし、他の細胞型が使用される場合、最適なセルL番号は、経験的に決定されなければなりません。
我々は最近、局所接着シグナル伝達タンパク質cdGAPがmechanosensingを調節し、11 durotaxis方法を研究するために、このアッセイを使用しています。 15 -明らかに、そのようなもdurotaxis 13の制御に寄与することができるので、機械的シグナル伝達に関与するとされている細胞骨格要素、タンパク質輸送のコンポーネントとイオンチャネルなどの接着斑に加えて、多数の細胞成分があります。これらのコンポーネントの各々は、容易に類似のRNAiアプローチを用いて、我々のシステムで評価することができます。さらに、このアッセイは、様々な薬理学的活性剤または阻害剤の導入に非常に適しています。アッセイはまた、タンパク質のダイナミクスと時空間活性化を研究するために、FRETまたはFRAPのアプローチと組み合わせて、例えば、蛍光タグ化タンパク質の取り込みのような分析のより洗練された形態を可能にするように適合させることができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
この作品は、NIH R01 GM47607、CA163296およびCETにNSF 1334493によってサポートされています。私たちは、原稿の重要な読書のためのターナーラボのメンバーに感謝します。このレポートに表示されるすべてのデータは、駆虫剤ら。2014年11から許可を得て再現されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12 mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
References
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).
- Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).
- Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).
- Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).
