Abstract
As propriedades mecânicas da composição e da matriz extracelular são altamente variáveis entre tipos de tecidos. Este tecido conjuntivo diversidade estroma grandemente impactos comportamento celular para regular os processos normais e patológicos, incluindo a proliferação celular, diferenciação, migração e adesão de sinalização direccional. A este respeito, a capacidade inata de determinados tipos de células para migrar em direcção um substrato mais rígido, ou menos complacente matriz é referida como durotaxis. Este fenómeno desempenha um papel importante durante o desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas e a invasão de células do cancro. Aqui, nós descrevemos um ensaio simples para estudar durotaxis, in vitro, utilizando PDMS (polidimetilsiloxano) substratos. Preparação do descrito durotaxis câmaras cria uma interface entre a rigidez do gel PDMS relativamente macio e uma lamela de vidro rígida. No exemplo fornecido, temos usado estes durotaxis câmaras para demonstrar um papel para o cdc42 / Rac1 GTPase ativando proteem, cdGAP, em mechanosensing e durotaxis regulamentação em células U2OS osteossarcoma humano. Este ensaio é facilmente adaptável a outros tipos e / ou knockdown de outras proteínas de interesse celulares para explorar seus respectivos papéis na mechanosignaling e durotaxis.
Introduction
A matriz extracelular (ECM) é constituído por uma matriz complexa de proteínas estruturais e de reticulação, incluindo colagénio, fibronectina e laminina. Embora seja bem estabelecido que a ECM fornece um suporte estrutural importante para os tecidos celulares, há evidências crescentes de que indicam que as células respondem activamente a mudanças físicas no seu ambiente de ECM para regular processos celulares, incluindo diversas sobrevivência celular, diferenciação e migração da célula. Por exemplo, diferenças na rigidez do ECM podem conduzir as células estaminais mesenquimais para linhagens diferentes, com substratos macios (~ 1 kPa) a promoção de linhagens neurogénicos enquanto substratos rígidos (~ 25 kPa) promover a diferenciação osteogénica 1. Da mesma forma, foi demonstrado um aumento na rigidez da matriz estromal para promover a tumorigénese célula epitelial mamaria e invasão do tecido circundante 2,3.
Um aspecto particularmente interessante deste mechanosignaling resultados da actividade em um processo conhecido como durotaxis, em que as células migram preferencialmente para um substrato mais rígido 4,5. Células sentir constantemente as características físicas do ambiente extracelular através da ligação do receptor de integrina ao ECM. Este, por sua vez, promove a acumulação de numerosas proteínas estruturais e de sinalização para os seus domínios citoplasmáticos para conduzir a formação de estruturas adesivas conhecidas como adesões focais ou contactos focais 6,7. Dado que as integrinas não têm actividade enzimática inerente, os sinais são transmitidos a partir do ECM através destas proteínas acessórias para coordenar a resposta da célula ao seu ambiente em mudança 8. Consequentemente, a identificação e caracterização das proteínas-chave envolvidas na regulação mechanosignaling durotaxis e é uma área importante de investigação.
Vários sistemas de modelos têm sido desenvolvidos para estudar durotaxis in vitro, mas a maioria têmutilizados substratos de poliacrilamida revestidos com colagénio 4. No entanto, a preparação dos substratos de poliacrilamida pode ser tecnicamente exigente e o colagénio utilizado nestes ensaios devem ser quimicamente reticulado ao substrato 9. Polidimetilsiloxano (PDMS) substratos têm mostrado exibir propriedades mecânicas comparáveis aos substratos de poliacrilamida a 10. No entanto, os substratos PDMS são preparadas simplesmente misturando uma proporção de base para o agente de reticulação e esses substratos podem ser revestidos com proteínas de ECM sem a necessidade de reticulação química, tornando assim mais fácil PDMS uma ferramenta para estudar os efeitos de rigidez no comportamento de células. Aqui, nós descrevemos como preparar uma câmara durotaxis simples em que um substrato macio PDMS é integrado com uma lamela de vidro rígida.
O ensaio, conforme descrito abaixo, proporciona um método rápido e simples para estudar durotaxis. Para este estudo foram utilizadas células de osteossarcoma U2OS humanos, combinado com siRNA mediadaknockdown de cdGAP para estudar o papel desta proteína de adesão focal em durotaxis 11. É importante ressaltar que este protocolo pode ser facilmente adaptado às necessidades individuais. Outros tipos celulares podem ser substituídos para as células U2OS e qualquer proteína pode ser batido ou sobre-expresso para determinar os efeitos sobre o comportamento das células durante durotaxis. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para incorporar proteínas fluorescente etiquetado para analisar sua dinâmica e comportamento usando FRAP ou FRET abordagens.
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Protocol
1. Preparação de Durotaxis Chambers
- Para preparar uma placa de 6 poços de cultura de tecidos, tarar a balança com um tubo cónico de 50 ml. Pesar aproximadamente 10 g de solução de base de PDMS no tubo de 50 ml (a solução é bastante viscosa).
- Para uma 90: 1 substrato (Conformidade de ~ 1 kPa), dividir o peso medido da solução de base de PDMS no tubo por 90 para determinar a quantidade correcta de agente reticulante solução necessário. Adicionar a quantidade calculada da solução de agente reticulante PDMS ao mesmo tubo.
Exemplo: 10 g / 90 = 0,11 g. Adicionar 0,11 g da solução de agente de reticulação à solução PDMS base de PDMS.
NOTA: A base e do agente reticulante soluções são ambos fornecidos no kit de PDMS. - Misturar vigorosamente a mistura de base / agente de reticulação de PDMS durante 5 min à temperatura ambiente usando uma pequena espátula. Nesta fase, a mistura conterá um grande número de bolhas de ar.
- Centrifuga-se o substrato de PDMS numa centrífuga de bancada durante 5 minutos a 50 xg à temperatura ambiente para remover a bubbles. Se ainda houver bolhas após a 5 min, centrifugar novamente.
- Pipete 1 mL de 90: 1 PDMS substrato em cada poço de cultura de tecidos de 6 cavidades tratadas placa. As bolhas de ar restantes presentes nos PDMS pode ser eliminado nesta fase por popping-los usando uma agulha 21 G. Permitir que o PDMS para espalhar durante 30 min no poço.
- Ferva 12 milímetros de vidro # 1 lamelas em água destilada por 5 min. Repita duas vezes e armazenar as lamelas em água destilada.
- Coloque um, secou-se a lamela em cada poço da placa de cultura de tecidos tocando suavemente um lado da lamela na solução, em seguida, deixar cair o PDMS lamela para o PDMS. À medida que a lamela se instala, o PDMS começará a invadir ao longo dos bordos da lamela, mas não se cobri-lo completamente. Isto vai gerar uma interface entre o PDMS e de vidro após a cura (ver Figura 1A, B).
- Incubar a placa a 70 ° C num forno durante 16 horas para curar (Harden) do PDMS. Coloque o plate em uma capa de cultura de células e UV esterilizar durante 10 min.
NOTA: É melhor fazer as placas dentro de alguns dias de uso. No entanto, as placas podem ser envoltos em parafilme sem qualquer tampão e armazenado a 4 ° C durante até 2 semanas, sem qualquer queda significativa na qualidade.
2. celular Galvanização
NOTA: Se se estudar o efeito do knockdown mediada por siRNA, executar o knockdown utilizando as instruções do fabricante ou o protocolo optimizado para o tipo de célula de escolha.
- Revestimento durotaxis cada câmara com 1 ml de 10 ug / ml de fibronectina em PBS sem cálcio e magnésio durante 1 hora a 37 ° C. Alternativamente, a fibronectina pode ser aplicado no dia antes da análise por incubação das PDMS com 10 ug / ml de fibronectina em PBS durante 16 horas a 4 ° C. Certifique-se de toda a superfície é submersa na solução de fibronectina em PBS.
- Prepare desnaturado termicamente 1% BSA. Pesar 0,5 g de BSA e dissolvê-lo em 50 ml de PBS.Filtro de esterilizar a solução através de um filtro de 0,22 um e de calor a 80 ° C durante 12 min.
Nota: Preparar esta solução no dia antes da célula de galvanização e armazenar a 4 ° C. - Aspirar a solução de fibronectina e lavar 3 vezes com PBS. Adicionar 1 ml de BSA desnaturado por calor em PBS a cada poço e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
- Trypsinize e contar as células de escolha, enquanto as câmaras durotaxis estão bloqueando com o calor desnaturado BSA.
- Placa 1 x 10 5 células em um volume de 2 ml em cada poço da câmara durotaxis, usando os meios necessários para o tipo particular de célula de escolha. Permitir que as células aderir e espalhada sobre o substrato durante 4 horas numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO 2.
NOTA: As células U2OS são rotineiramente mantidas em DMEM com 10% de FBS, suplementado com 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, e 10 UI / ml de penicilina, 10 ug / ml de estreptomicina.
NOTA: O número de células utilizado neste exemplo é optimizado paraU2OS células. Optimização para outros tipos de células pode não ser necessária. Esta densidade dá as células espaço suficiente para migrar sem interações significativas com outras células.
Imagem 3. Em células vivas
- Execute imagens de células vivas em um microscópio invertido, usando contraste de fase com uma objetiva de 10X. O microscópio deve ser equipado com uma câmara humidificada ambiente fechado, permitindo o controlo de temperatura a 37 ° C e 5% de CO 2 durante o exame a longo prazo.
- Depois que as células se espalharam por cerca de 3,5 horas, montar a placa na câmara de microscópio. Deixar a amostra (s) para equilibrar na câmara durante 30 min.
- Configure automatizado, multi-ponto de visitação no microscópio, se disponível. Concentre-se na interface entre as 90: 1 PDMS ea lamela de vidro e escolher aponta para imagem em todo o interface com um média de 40 pontos por durotaxis câmara. Imagem das células a cada 10 minutos até 16 horas.
NOTA: A região de interesse aparece como duas linhas, com a linha exterior, correspondente ao bordo da lamela e a linha interna correspondente à interface real entre o PDMS e a lamela. Ver Figura 1B.
Análise 4. Dados
- Gerar uma planilha como na Tabela 1.
- Contar o número de eventos de passagem a partir dos PDMS à superfície do vidro e vice-versa de cada filme gerado. Grave o número de eventos de passagem na coluna apropriada na planilha excel.
NOTA: Um evento de cruzamento é definido como o núcleo da célula, passando através da fronteira entre o PDMS e de vidro em um ou outro sentido. - Para quantificar múltiplos cruzamentos, contar o número de vezes que a célula atravessada a interface. Este número deve ser gravado na coluna Excel correspondente ao substrato sobre o qual a célula foi localizado no final do filme. Repita a análise para cada célula que atravessa a interface em tfilme que ele. Excluir células que migram para fora do campo de visão durante o exame.
NOTA: É também importante para verificar, por contagem de células no início da experiência, as células que são capazes de aderir igualmente aos PDMS revestido com fibronectina e superfícies de lamela de vidro. - Calcula-se a percentagem de células que migraram a partir de PDMS para a superfície do vidro (isto é, submetidos a durotaxis). Adicione o número de cruzar eventos de suave a difícil e os múltiplos eventos de passagem, que terminou no disco e dividir pelo número total de eventos de passagem.
- Calcula-se a percentagem de passagens múltiplas através da divisão do número de passagens múltiplas pelo número total de cruzamentos.
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Representative Results
Um esquema da câmara durotaxis é mostrado na Figura 1A. Substrato PDMS macio (uma 90: 1 mistura de base de PDMS de reticulador soluções) é espalhada em uma 6 bem prato e uma lamela de vidro é colocado no topo do PDMS, que, em seguida, cobre parcialmente a superfície superior da lamela, criando, assim, uma interface entre os dois substratos de conformidade diferente. A rigidez do substrato macio PDMS é ~ 1 kPa, o que é comparável ao cumprimento típica do tecido do cérebro, enquanto que a rigidez de vidro é de cerca de 1-2 GPa 1. Uma imagem de contraste de fase da interface entre o PDMS e de vidro é mostrada pelas setas brancas na Figura 1B. Os asteriscos denotam duas células controle de RNAi que migram para o substrato mais difícil. A aresta irregular que pode ser visto (seta preta) corresponde ao bordo da lamela.
Para quantificar os dados, uma planilha do Microsoft Excel devem ser gerados como na Tabela 1 </ strong>. O número de eventos de passagem devem ser contadas e organizadas na coluna correspondente. Alguns dos filmes obtidos não podem ser utilizados para efeitos de quantificação. Um filme poderá ser omitido da quantificação, se houver uma bolha no PDMS que interfere com um progresso células ou se as células forem muito densamente, resultando em colisões que podem influenciar drasticamente direccionalidade célula. A divisão celular também deve ser monitorado, pois isso também pode influenciar abertamente o movimento celular.
Tipicamente, os tipos de células aderentes mais preferencialmente irão migrar em direcção um substrato mais rígido 2,4,12. Para começar a entender o mecanismo molecular pelo qual as células respondem a estímulos mecânicos no seu ambiente, proteínas específicas pode ser derrubado usando siRNA. No nosso exemplo, cerca de 70% das células tratadas com siRNA de controlo exibiram durotaxis Figura 2A. Em flagrante contraste, quando cdGAP foi derrubado usando RNAi, as células não tinham preferênciaquanto ao facto de que migraram para o substrato Figura 2A dura ou mole. Além disso, as células de knockdown cdGAP cruzado as várias vezes de contorno, enquanto que as células tratadas ARNsi de controlo, geralmente, apenas uma vez atravessada a fronteira, Figura 2B. Faixas representativos de células siRNA de controlo mostram que as células em geral migra entre o limite de uma vez e, preferencialmente, ficou na superfície mais rígida em comparação com as células tratadas com siRNA cdGAP que não demonstram uma preferência para qualquer rigidez e cruzou a várias vezes contorno Figura 2C.
Figura 1. Esquema da câmara Durotaxis configurado. (A) macio PDMS é espalhada em cada poço de um prato de 6 poços e uma lamela de vidro é colocado no topo do PDMS. Os PDMS vai sobrepor ao longo dos lados da parte superior da lamela, befminério que endurece para formar uma interface entre os dois substratos. Durotaxis é determinado marcando a direcionalidade das células que atravessam a interface de PDMS / vidro. Imagem de contraste de fase representativa mostrando a interface entre o PDMS moles e substrato de vidro rígida (B). Os asteriscos mostram células U2OS tratados com ARNi de controlo submetidos a durotaxis. As setas brancas indicam a interface entre o PDMS e lamela de vidro e a seta indica a borda da lamela de vidro sob o PDMS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Esquema de planilha do Microsoft Excel criado. As colunas são estabelecidos para incluir o número de filmes, siRNA utilizado, o número de células que migraram das PDMS maciospara substrato de vidro rígida ou vice-versa, bem como o número total de células analisadas. Colunas também são configurados para as células que cruzam as interfaces várias vezes e terminam em ambos os PDMS macios ou o substrato de vidro. Se uma célula migra entre os vários tempos de contorno, o número de eventos múltiplos de passagem destas células é gravado na coluna do substrato sobre o qual a célula foi localizado no final do filme.
Figura 2. Queda de cdGAP em células U2OS provoca uma perda de durotaxis. (A) As células de controlo tratadas siRNA migram preferencialmente para o substrato de vidro rígida, enquanto que as células tratadas cdGAP siRNA não apresentam qualquer preferência. Células tratadas (B) Controlo de siRNA cruzou a fronteira entre o PDMS e de vidro uma vez. No entanto, as células tratadas com RNAi cdGAP migrado e para trás em todo o boundary várias vezes. (C) Faixas de células representativas tratados com tanto controle, ou cdGAP siRNA foram gerados usando o plugin de rastreamento manual em ImageJ. Os valores de p foram determinadas usando o teste t de um estudante e erros de barras representam o intervalo de confiança de 95%. Reproduzido com permissão a partir de 2014 11 Wormer et al.. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui nós descrevemos um ensaio simples para estudar durotaxis em células migrando. Uma grande força deste ensaio é a facilidade de preparação das câmaras durotaxis utilizando PDMS. A rigidez dos substratos pode ser facilmente manipulado por alteração da proporção de solução de base de PDMS de agente de reticulação para permitir o estudo de vários elementos de rigidez no ensaio. No entanto, uma limitação potencial do sistema é que apenas as células são expostas a uma única mudança na rigidez do substrato em oposição a experimentar um gradiente de rigidez que é fornecido por sistemas mais sofisticados 4. Importante, ao contrário de substratos de poliacrilamida, os componentes da ECM não tem que ser quimicamente reticulado ao PDMS. Com efeito, o revestimento de fibronectina é aproximadamente equivalente em ambos os PDMS e as superfícies de vidro, conforme determinado por coloração com um anticorpo específico para a fibronectina 11. Uma vez que estudos anteriores mostraram que as células se comportam da mesma, quer em substratos de PDMS ou de poliacrilamida, a utilização óf PDMS substratos fornece um modelo muito mais fácil com a qual a estudar mechanotransduction em células 10,12.
O passo mais importante na preparação dos substratos PDMS é para garantir que a base e as soluções do agente reticulante são completamente misturados. Se eles não são misturados muito bem, em seguida, os substratos não irá curar completamente em cima do tratamento térmico. Isso resultará na lamela afundando longe demais para o PDMS ou a lamela à deriva nas PDMS durante o exame. Se a força de centrifugação é demasiado elevada, as soluções de base e de agente reticulante pode separar no tubo. Isto pode ser remediado através da redução da velocidade de centrifugação ou por desgasificação da mistura durante 30 min, utilizando uma câmara de vácuo. Finalmente, a densidade celular é crítico, como muitas células irá influenciar a sua capacidade de se espalhar e totalmente desimpedido ao durotax por contacto com as células vizinhas. A densidade aqui relatados foi optimizado para as células U2OS. No entanto, se forem utilizados outros tipos de células, cel ideall números terá de ser determinada empiricamente.
Temos recentemente utilizado este ensaio para estudar como a adesão focal sinalização proteína cdGAP regula mechanosensing e durotaxis 11. Claramente, existem vários componentes celulares, além de adesões focais, tais como elementos do citoesqueleto, componentes de proteína e de tráfico de canais iónicos que estão envolvidos na sinalização mecânica e, portanto, podem também contribuir para a regulação da durotaxis 13 - 15. Cada um destes componentes pode ser prontamente avaliada no nosso sistema de ARNi utilizando abordagens semelhantes. Além disso, este ensaio é muito favorável para a introdução de vários activadores ou inibidores farmacológicos. O ensaio também pode ser adaptado para permitir a formas mais sofisticadas de análise, tais como a incorporação de proteínas fluorescentemente marcado, em combinação com abordagens de FRET ou FRAP, para estudar a dinâmica das proteínas e activação espaço-temporal.
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Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo NIH R01 GM47607, CA163296 e NSF 1334493 a CET. Agradecemos a membros do laboratório Turner para a leitura crítica do manuscrito. Todos os dados apresentados neste relatório foram reproduzidas com permissão a partir de 2014 11 Wormer et al..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12 mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
References
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