Abstract
Le proprietà meccaniche e composizione della matrice extracellulare sono molto variabili tra i tipi di tessuto. Questo connettivo diversità stroma del tessuto notevolmente comportamento impatti cella per regolare i processi normali e patologiche tra cui la proliferazione cellulare, la differenziazione, la segnalazione di adesione e la migrazione direzionale. A questo proposito, la capacità innata di certi tipi di cellule a migrare verso un substrato matrice rigida, o meno compatibile è indicato come durotaxis. Questo fenomeno ha un ruolo importante durante lo sviluppo embrionale, la riparazione delle ferite e l'invasione delle cellule tumorali. Qui, descriviamo un test semplice per studiare durotaxis, in vitro, utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) substrati. Preparazione del descritto durotaxis camere crea un'interfaccia tra la rigidità relativamente morbido gel PDMS e un vetrino di vetro rigida. Nell'esempio fornito, abbiamo usato queste durotaxis alloggiamenti per dimostrare un ruolo per il Cdc42 / Rac1 GTPasi prote attivazionein, cdGAP, in mechanosensing e durotaxis regolazione nelle cellule umane U2OS osteosarcoma. Questo test è facilmente adattabile ad altri tipi e / o atterramento di altre proteine di interesse cellulari per esplorare i loro rispettivi ruoli nel mechanosignaling e durotaxis.
Introduction
La matrice extracellulare (ECM) è costituito da una serie complessa di proteine strutturali e reticolazione compreso collagene, fibronectina e laminina. Anche se è noto che l'ECM fornisce un importante supporto strutturale per tessuti cellulari, ci sono sempre più prove per indicare che le cellule rispondono attivamente ai cambiamenti fisici nel loro ambiente ECM per regolare i processi cellulari diversi, tra cui la sopravvivenza cellulare, la differenziazione e la migrazione delle cellule. Ad esempio, le differenze nella rigidità della ECM può guidare le cellule staminali mesenchimali verso differenti linee, con i substrati molli (~ 1 kPa) promuovono lignaggi neurogene mentre rigidi (~ 25 kPa) substrati di promuovere la differenziazione osteogenica 1. Analogamente, un aumento della rigidità matrice stromale ha dimostrato di promuovere la tumorigenesi mammaria cellule epiteliali ed invasione nel 2,3 tessuto circostante.
Un aspetto particolarmente interessante di questo mechanosignrisultati dell'attività aling in un processo noto come durotaxis, in cui le cellule migrano preferenzialmente verso un substrato più rigido 4,5. Le cellule rilevano costantemente le caratteristiche fisiche del loro ambiente extracellulare attraverso recettore integrina legame alla ECM. Questo, a sua volta, promuove l'accumulo di numerose proteine strutturali e segnalazione ai loro domini citoplasmatici per guidare la formazione di strutture adesive note come adesioni focali o contatti focali 6,7. Dal momento che le integrine non hanno attività enzimatica intrinseca, i segnali vengono inoltrati dal ECM attraverso queste proteine accessorie per coordinare la risposta delle cellule al loro ambiente mutevole 8. Di conseguenza, l'identificazione e la caratterizzazione delle proteine chiave coinvolte nella regolazione mechanosignaling e durotaxis è un'importante area di ricerca.
Vari sistemi modello sono stati sviluppati per studiare durotaxis in vitro, ma la maggior parte hannoutilizzati collagene rivestite poliacrilammide substrati 4. Tuttavia, la preparazione dei substrati di poliacrilammide può essere tecnicamente impegnativo e il collagene utilizzato in questi saggi deve essere chimicamente reticolato al substrato 9. Polidimetilsilossano (PDMS) substrati hanno dimostrato di presentare proprietà meccaniche paragonabili ai substrati di poliacrilammide 10. Tuttavia, substrati PDMS vengono preparate semplicemente miscelando un rapporto della base di reticolante e questi substrati possono essere rivestiti con proteine ECM senza la necessità di reticolazione chimica, rendendo così più facile PDMS uno strumento per studiare gli effetti di rigidità sul comportamento cellulare. Qui, si descrive come preparare una semplice camera di durotaxis in cui un substrato morbido PDMS è integrato con un coprioggetto vetro rigido.
Il saggio, come indicato di seguito, fornisce un metodo rapido e semplice per lo studio durotaxis. Per questo studio abbiamo utilizzato cellule di osteosarcoma U2OS umane combinate con siRNA-mediataatterramento di cdGAP per studiare il ruolo di questa proteina di adesione focale durotaxis 11. È importante sottolineare che questo protocollo può essere facilmente adattato alle esigenze individuali. Altri tipi cellulari possono essere sostituiti per le cellule U2OS e qualsiasi proteina possono essere abbassati o overexpressed per determinare gli effetti sul comportamento cellulare durante durotaxis. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per incorporare le proteine fluorescenti tag per analizzare le loro dinamiche e comportamento utilizzando FRAP o preoccuparsi approcci.
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Protocol
1. Preparazione di Durotaxis Chambers
- Per preparare un 6-pozzetti di coltura tissutale, tarare la bilancia con un tubo da 50 ml. Pesare circa 10 g della soluzione di base PDMS nel tubo da 50 ml (la soluzione è abbastanza viscoso).
- Per 90: 1 substrato (Compliance di ~ 1 kPa), dividere il peso misurato della soluzione di base PDMS nel tubo 90 per determinare la corretta quantità di soluzione reticolante necessaria. Aggiungere la quantità calcolata di soluzione reticolante PDMS al tubo stesso.
Esempio: 10 g / 90 = 0,11 g. Aggiungere 0,11 g della soluzione reticolante PDMS alla soluzione di base PDMS.
NOTA: La base e reticolante soluzioni sono entrambi forniti nel kit PDMS. - Mescolare energicamente la miscela base / reticolante PDMS per 5 minuti a temperatura ambiente usando una piccola spatola. A questo punto la miscela contiene un gran numero di bolle d'aria.
- Centrifugare il substrato PDMS in una centrifuga da banco per 5 min a 50 xg a temperatura ambiente per rimuovere l'bubbles. Se ci sono ancora bolle dopo 5 min, centrifuga di nuovo.
- Pipettare 1 ml di 90: 1 PDMS substrato in ciascun pozzetto della coltura di tessuti trattati 6 pozzetti. Eventuali bolle d'aria residue presenti nei PDMS possono essere eliminate in questa fase estraendo usando un ago 21 G. Lasciare le PDMS a diffondere per 30 minuti nel pozzo.
- Bollire 12 millimetri di vetro # 1 coprioggetto in acqua distillata per 5 min. Ripetere due volte e memorizzare i coprioggetti in acqua distillata.
- Mettere uno, coprioggetto secco in ciascun pozzetto della piastra di coltura tissutale toccando delicatamente un lato del vetrino nella soluzione PDMS poi cadere il vetrino sui PDMS. Come il coprioggetto deposita, PDMS cominceranno ad invadere sui bordi del vetrino, ma non copre completamente. Questo genera un'interfaccia tra le PDMS e vetro dopo la polimerizzazione (vedere Figura 1A, B).
- Incubare la piastra a 70 ° C in un forno per 16 ore per curare (indurimento) PDMS. Posizionare il plate in una cappa di coltura cellulare e UV sterilizzare per 10 min.
NOTA: E 'meglio per rendere le piastre entro un paio di giorni di utilizzo. Tuttavia, le piastre possono essere avvolte in Parafilm senza tampone e conservati a 4 ° C fino a 2 settimane senza alcuna diminuzione nella qualità.
2. Cella placcatura
NOTA: Se studiare l'effetto di knockdown siRNA-mediata, eseguire il colpo con le istruzioni del produttore o il protocollo ottimizzato per il tipo cellulare di scelta.
- Coat ogni durotaxis camera con 1 ml di 10 mg / ml in PBS fibronectina senza calcio e magnesio per 1 ora a 37 ° C. In alternativa, la fibronectina può essere applicato il giorno prima dell'analisi incubando le PDMS con 10 ug / ml in PBS fibronectina per 16 ore a 4 ° C. Assicurarsi che l'intera superficie è immersa nel fibronectina in soluzione PBS.
- Preparare calore denaturato 1% di BSA. Pesare 0,5 g BSA e scioglierlo in 50 ml di PBS.Filtro sterilizzare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron e riscaldare a 80 ° C per 12 min.
Nota: Preparare questa soluzione il giorno prima cella di placcatura e conservare a 4 ° C. - Aspirare la soluzione fibronectina e lavare 3 volte con PBS. Aggiungere 1 ml di calore denaturato BSA in PBS ad ogni pozzetto ed incubare per 30 minuti a RT.
- Trypsinize e contare le cellule di scelta, mentre le camere durotaxis stanno bloccando con il calore denaturato BSA.
- Piastra 1 x 10 5 cellule in un volume di 2 ml in ciascun pozzetto della camera durotaxis, utilizzando il supporto desiderato per il particolare tipo di cellula di scelta. Permettono alle cellule di aderire e diffondere sul substrato per 4 ore in un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO 2.
NOTA: cellule U2OS sono normalmente mantenute in DMEM con 10% FBS, supplementato con 2 mM L-glutammina, 1 mM sodio piruvato, e 10 UI / ml di penicillina, 10 mg / ml di streptomicina.
NOTA: il numero di cellule usato in questo esempio è ottimizzato perCellule U2OS. Ottimizzazione per altri tipi di cellule può essere richiesto. Questa densità dà le cellule sufficiente per migrare senza interazioni significative con altre cellule.
Imaging 3. Live-cell
- Eseguire l'imaging cellulare dal vivo su un microscopio invertito, con contrasto di fase con un obiettivo 10X. Il microscopio deve essere dotato di un ambiente, camera umidificata chiusa, permettendo il controllo di temperatura a 37 ° C e 5% CO 2 durante l'imaging a lungo termine.
- Dopo che le cellule si sono diffuse per circa 3,5 ore, montare la placca nella camera microscopio. Lasciare il campione (s) per equilibrare nella camera per 30 min.
- Impostare automatizzato, multi-punto in visita sul microscopio, se disponibile. Focus su l'interfaccia tra le 90: 1 PDMS e il vetrino di vetro e scegliere i punti per l'immagine in tutto l'interfaccia con una media di 40 punti per durotaxis camera. Immagine le cellule ogni 10 min per un massimo di 16 ore.
NOTA: Il regione di interesse apparirà come due linee, con la linea esterna corrispondente al bordo del vetrino e la linea interna corrispondente all'interfaccia effettiva tra le PDMS e il vetrino. Vedere la Figura 1B.
Analisi 4. I dati
- Generare un foglio di calcolo come nella tabella 1.
- Contare il numero di eventi di attraversamento dalle PDMS alla superficie di vetro e viceversa da ogni film generato. Registrare il numero di eventi di attraversamento nell'apposita colonna nel foglio di calcolo Excel.
NOTA: Un evento di crossing è definito come il nucleo cellulare passando sopra il confine tra le PDMS e vetro in entrambe le direzioni. - Per quantificare attraversare più, contare il numero di volte che la cella è transitato dall'interfaccia. Tale numero deve essere registrato nella colonna di Excel corrispondente al substrato su cui la cella era situato alla fine del film. Ripetere l'analisi per ogni cellula che attraversa l'interfaccia in tfilm che. Escludere le cellule che migrano fuori dal campo visivo durante l'imaging.
NOTA: È anche importante verificare, da cellule contando all'inizio dell'esperimento, che le cellule sono in grado di aderire ugualmente ai PDMS fibronectina rivestite coprioggetto e superfici di vetro. - Calcolare la percentuale di cellule che migrato da PDMS alla superficie del vetro (cioè, durotaxis subito). Aggiungere il numero di attraversare gli eventi da morbido a duro e gli eventi di attraversamento più che si sono concluse sul disco e dividere per il numero totale di eventi di attraversamento.
- Calcolare la percentuale di attraversare più dividendo il numero di attraversare più volte per il numero totale di incroci.
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Representative Results
Uno schema della camera durotaxis è mostrato nella Figura 1A. Substrato PDMS molle (90: 1 miscela di base di PDMS a reticolante soluzioni) si sviluppa in un piatto 6 pozzo e un vetrino di vetro è posto sulla parte superiore delle PDMS, che poi ricopre parzialmente la superficie superiore del vetrino, creando un'interfaccia tra i due substrati di conformità diverso. La rigidità del substrato PDMS morbido è ~ 1 kPa, che è paragonabile alla conformità tipica del tessuto cerebrale, mentre la rigidità del vetro è di circa 1-2 GPa 1. Un contrasto di fase dell'interfaccia tra le PDMS e vetro è indicata dalle frecce bianche in Figura 1B. Gli asterischi indicano due celle controllo RNAi migrazione verso il substrato più duro. Il bordo frastagliato che può essere visto (freccia nera) corrisponde al bordo del vetrino.
Per quantificare i dati, un foglio elettronico Microsoft Excel dovrebbe essere generato come in Tabella 1 </ strong>. Il numero di eventi di attraversamento deve essere contato e organizzata nella colonna corrispondente. Alcuni dei film generati non possono essere utilizzati per la quantificazione. Un film può essere omesso dalla quantificazione se c'è una bolla nelle PDMS che interferisce con un progresso cellule o se le cellule sono troppo densamente imballati, causando collisioni che possono influenzare drasticamente direzionalità cellule. La divisione cellulare dovrebbe essere monitorata, in quanto questo può anche influenzare apertamente il movimento delle cellule.
In genere, tipi di cellule più aderenti saranno preferenzialmente migrare verso un substrato rigido 2,4,12. Per cominciare a capire il meccanismo molecolare con cui le cellule rispondono agli stimoli meccanici nel loro ambiente, proteine specifiche possono essere abbattuti con siRNA. Nel nostro esempio, circa il 70% delle cellule trattate con siRNA controllo esposto durotaxis 2A Figura. In stridente contrasto, quando cdGAP è stato abbattuto con RNAi, le cellule avevano preferenzasul fatto che la migrazione sul duro o morbido substrato figura 2A. Inoltre, le cellule knockdown cdGAP attraversato le più volte di confine, mentre le cellule trattate controllo siRNA in genere solo attraversato il confine una volta, la figura 2B. Brani rappresentativi di cellule siRNA di controllo mostrano che le cellule in generale migrano attraverso il confine una volta e preferenzialmente rimasti sulla superficie più rigida rispetto alle cellule cdGAP siRNA-trattati che non hanno dimostrato una preferenza per uno dei due rigidità e hanno attraversato il confine più volte la figura 2C.
Figura 1. Schema della camera Durotaxis impostato. (A) morbido PDMS si sviluppa in ciascun pozzetto di un piatto 6 pozzetti e vetrino coprioggetti è posto sulla parte superiore delle PDMS. I PDMS si invadere sopra i lati della parte superiore del vetrino, befdi minerale che indurisce per formare un'interfaccia tra i due substrati. Durotaxis è determinata notando la direzionalità delle cellule che attraversano l'interfaccia PDMS / vetro. (B) contrasto di fase immagine rappresentante che mostra l'interfaccia tra i PDMS molli e substrato di vetro rigida. Gli asterischi indicano controllo RNAi trattato con cellule U2OS sottoposti durotaxis. Le frecce bianche indicano l'interfaccia tra i PDMS e coprioggetto di vetro e la freccia indica il bordo del vetrino di vetro sotto il PDMS. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. Schema di Microsoft Excel foglio di calcolo istituito. Le colonne sono stabiliti per includere il numero di film, siRNA usato, il numero di cellule che la migrazione dalle PDMS morbideal supporto rigido vetro o viceversa, così come il numero totale di cellule analizzate. Le colonne sono anche istituito per le cellule che attraversano l'interfaccia più volte e finiscono su entrambi i PDMS molli o il substrato di vetro. Se una cella migra attraverso le più volte al contorno, il numero di eventi multipli attraversamento di queste cellule viene registrato nella colonna del substrato su cui la cella era situato alla fine del film.
Figura 2. Knockdown di cdGAP in cellule U2OS causa una perdita di durotaxis. (A), le cellule di controllo siRNA trattate migrano preferenzialmente sul substrato di vetro rigida, mentre le cellule trattate cdGAP siRNA non mostrano alcuna preferenza. Cellule trattate (B) Controllo siRNA attraversato il confine tra i PDMS e vetro una volta. Tuttavia, le cellule cdGAP RNAi trattate migrati avanti e indietro attraverso la boundary più volte. (C) Le tracce di cellule rappresentative trattati con il controllo, o cdGAP siRNA sono stati generati utilizzando il plugin di monitoraggio Manuale in ImageJ. I valori di p sono stati determinati utilizzando test t di uno studente e errori barre rappresentano l'intervallo di confidenza del 95%. Riprodotto con il permesso da Wormer et al. 2014 11. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui descriviamo un semplice test per studiare durotaxis in migrazione delle cellule. Un punto di forza di questo saggio è la facilità di preparazione delle camere durotaxis con PDMS. La rigidità dei substrati può essere facilmente manipolata modificando il rapporto di soluzione di base PDMS a reticolante per consentire lo studio di varie rigidità nel test. Tuttavia, una potenziale limitazione del sistema è che le cellule sono esposte a un solo cambiamento di rigidità del substrato rispetto a sperimentare un gradiente rigidità che viene fornito da sistemi più sofisticati 4. È importante sottolineare che, a differenza di substrati poliacrilammide, i componenti ECM non devono essere chimicamente reticolato a PDMS. Infatti, il rivestimento fibronectina è approssimativamente equivalente su entrambi i PDMS e le superfici di vetro, come determinato mediante colorazione con un anticorpo specifico per la fibronectina 11. Da studi precedenti hanno dimostrato che le cellule si comportano allo stesso su entrambi PDMS o substrati poliacrilammide, l'uso of PDMS substrati fornisce un modello molto più facile con cui studiare meccanotrasduzione nelle cellule 10,12.
Il passo più importante nella preparazione dei substrati PDMS è quello di garantire che il reticolante soluzioni base e vengono accuratamente miscelati. Se non sono mescolati abbastanza bene, poi i substrati non saranno completamente curare in seguito al trattamento termico. Ciò comporterà il vetrino affondare troppo nei PDMS o il vetrino alla deriva nei PDMS durante l'imaging. Se la forza centrifuga è troppo alta, le soluzioni basiche e reticolante possono separare nel tubo. Questo può essere risolto riducendo la velocità di centrifugazione o mediante degasaggio della miscela per 30 minuti usando una camera a vuoto. Infine, la densità delle cellule è un fattore critico, come troppe cellule influenzano la loro capacità di diffondersi pienamente e per durotax indisturbato dal contatto con le cellule vicine. La densità qui riportate è stato ottimizzato per le cellule U2OS. Tuttavia, se si utilizzano altri tipi di cellule, cel ottimalenumeri l dovranno essere determinati empiricamente.
Abbiamo recentemente usato questo test per studiare come l'adesione focale segnalazione proteina cdGAP regola mechanosensing e durotaxis 11. Chiaramente, ci sono numerosi componenti cellulari in aggiunta alle adesioni focali, come elementi del citoscheletro, componenti di traffico di proteine e canali ionici che sono coinvolti nella segnalazione meccanica e quindi può anche contribuire alla regolazione di durotaxis 13-15. Ciascuno di questi componenti potrebbero essere prontamente valutata nel nostro sistema utilizzando approcci simili RNAi. Inoltre, questo test è molto suscettibile all'introduzione di vari attivatori o inibitori farmacologici. Il test può essere adattato anche per consentire forme più sofisticate di analisi, come l'incorporazione di proteine fluorescenti-taggato, in combinazione con approcci FRET o FRAP, per studiare la dinamica delle proteine e l'attivazione spazio-temporale.
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Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto da NIH R01 GM47607, CA163296 e NSF 1.334.493 di CET. Ringraziamo i membri del laboratorio Turner per la lettura critica del manoscritto. Tutti i dati riportati nella presente relazione sono stati riprodotti da permesso da Wormer et al. 2014 11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12 mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
References
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