Abstract
Les propriétés mécaniques et la composition de la matrice extracellulaire sont très variables entre les différents types de tissus. Cette diversité de stroma de tissu conjonctif considérablement le comportement des cellules des impacts pour réguler les processus normaux et pathologiques, y compris la prolifération cellulaire, la différenciation, la signalisation de l'adhésion et la migration directionnelle. À cet égard, la capacité innée de certains types de cellules de migrer vers un substrat rigide, ou moins conforme matrice est appelée durotaxis. Ce phénomène joue un rôle important au cours du développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies et l'invasion des cellules cancéreuses. Ici, nous décrivons un test simple à étudier durotaxis, in vitro, utilisant polydiméthylsiloxane (PDMS) substrats. Préparation de la durotaxis décrit chambres crée une interface entre la rigidité du gel de PDMS relativement mou et une lamelle de verre rigide. Dans l'exemple fourni, nous avons utilisé ces durotaxis chambres de démontrer un rôle pour le cdc42 / Rac1 activation GTPase protedans, cdGAP, dans les mécanorécepteurs et durotaxis la réglementation dans les cellules d'ostéosarcome humain U2OS. Ce test est facilement adaptable à d'autres types et / ou knockdown d'autres protéines cellulaires d'intérêt à explorer leurs rôles respectifs dans mechanosignaling et durotaxis.
Introduction
La matrice extracellulaire (ECM) est constitué d'un ensemble complexe de protéines de structure de réticulation et y compris le collagène, la fibronectine et la laminine. Bien qu'il soit bien établi que l'ECM fournit un soutien structurel important pour les tissus cellulaires, il est de plus en plus de preuves pour indiquer que les cellules réagissent activement aux changements physiques de leur environnement ECM pour réguler divers processus cellulaires, y compris la survie cellulaire, la différenciation et la migration cellulaire. Par exemple, les différences dans la rigidité de l'ECM peuvent conduire les cellules souches mésenchymateuses vers différentes lignées, avec des substrats souples (~ 1 kPa) promotion lignées neurogéniques tout raides (~ 25 kPa) substrats favorisent la différenciation ostéogénique 1. De même, a montré une augmentation de la rigidité de la matrice du stroma, de promouvoir la tumorigenèse mammaire de cellules épithéliales et dans l'invasion des tissus environnants 2,3.
Un aspect particulièrement intéressant de la présente mechanosignrésultats de l'activité de aling dans un processus connu sous le nom durotaxis, dans lequel les cellules migrent préférentiellement vers un substrat plus rigide. 4,5 Les cellules détectent en permanence les caractéristiques physiques de leur environnement extracellulaire par récepteur d'intégrine de liaison à l'ECM. Ceci, à son tour, favorise l'accumulation de nombreuses protéines de structure et de signalisation de leurs domaines cytoplasmiques pour entraîner la formation de structures adhésives connues sous le nom adhésions focales focales ou des contacts 6,7. Depuis intégrines ont pas d'activité enzymatique inhérente, les signaux sont relayés de l'ECM à travers ces protéines accessoires pour coordonner la réponse de la cellule à leur environnement changeant 8. En conséquence, l'identification et la caractérisation des protéines clés impliquées dans la régulation mechanosignaling et durotaxis est un domaine de recherche important.
Différents systèmes de modèles ont été mis au point pour étudier durotaxis in vitro, mais la plupart ontutilisés substrats de Polyacrylamide enrobé de collagène 4. Cependant, la préparation des substrats de Polyacrylamide peut être techniquement difficile et le collagène utilisé dans ces essais doit être chimiquement réticulé sur le substrat neuf. Polydiméthylsiloxane (PDMS) substrats se sont révélés présenter des propriétés mécaniques comparables aux substrats de Polyacrylamide à 10. Toutefois, les substrats PDMS sont préparées en mélangeant simplement un rapport de la base pour agent de réticulation et de ces substrats peuvent être revêtus avec des protéines d'ECM sans la nécessité d'une reticulation chimique, ce qui rend PDMS un outil plus facile à étudier les effets de la rigidité sur le comportement de la cellule. Ici, nous décrivons comment préparer une chambre de durotaxis simple dans lequel un substrat de PDMS souple est intégré avec une lamelle de verre rigide.
L'essai, comme indiqué ci-dessous, fournit une méthode simple et rapide pour étudier durotaxis. Pour cette étude, nous avons utilisé des cellules d'ostéosarcome de U2OS humaines combinées avec le siRNA médiationknockdown de cdGAP pour étudier le rôle de cette protéine d'adhésion focale dans durotaxis 11. Surtout, ce protocole peut être facilement adapté aux besoins individuels. Autres types de cellules peuvent être substitués pour les cellules U2OS et toute protéine peuvent être renversés ou surexprimés pour déterminer les effets sur le comportement des cellules pendant durotaxis. En outre, ce protocole peut être adapté pour incorporer des protéines par fluorescence marqués d'analyser leur dynamique et leur comportement à l'aide FRAP ou FRET approches.
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Protocol
1. Préparation de durotaxis Chambers
- Pour préparer un 6 puits plaque de culture de tissu, tarer la balance avec un tube conique de 50 ml. Peser environ 10 g de la solution de base PDMS dans le tube de 50 ml (la solution est tout à fait visqueux).
- Pour un 90: 1 substrat (conformité de ~ 1 kPa), diviser le poids mesuré de la solution de base PDMS dans le tube par 90 pour déterminer le montant exact de la solution de réticulation nécessaire. Ajouter la quantité calculée d'agent de réticulation de la solution de PDMS dans le même tube.
Exemple: 10 g / 90 = 0,11 g. Ajouter 0,11 g de la solution d'agent de reticulation PDMS à la solution de base PDMS.
REMARQUE: Les solutions de la base et réticulation sont tous deux fournis dans le kit PDMS. - Mélanger vigoureusement le mélange base / agent de réticulation PDMS pendant 5 min à température ambiante à l'aide d'une petite spatule. A ce stade, le mélange contiendra un grand nombre de bulles d'air.
- Centrifuger le substrat PDMS dans une centrifugeuse de paillasse pendant 5 min à 50 g à RT pour enlever le Bubbles. Si il ya des bulles encore après la 5 min, centrifuger à nouveau.
- Introduire à la pipette 1 ml de 90: 1 PDMS substrat dans chaque puits de la culture de tissus traités plaque à 6 puits. Les bulles d'air restant présent dans les PDMS peuvent être éliminés à ce stade par les éclater en utilisant une aiguille 21 G. Autoriser les PDMS à se répandre pendant 30 min dans le puits.
- Faire bouillir 12 mm verre # 1 lamelles dans de l'eau distillée pendant 5 min. Répétez deux fois et stocker les lamelles dans de l'eau distillée.
- Placez une, lamelle séchée dans chaque puits de la plaque de culture tissulaire en touchant doucement d'un côté de la lamelle dans la solution PDMS puis déposez la lamelle sur le PDMS. Comme la lamelle retombée, les PDMS vont commencer à empiéter sur les bords de la lamelle, mais ne couvrira pas complètement. Cela va générer une interface entre les PDMS et verre après le durcissement (voir Figure 1A, B).
- Incuber la plaque à 70 ° C dans un four pendant 16 heures pour guérir (durcir) les PDMS. Placer le plate dans une hotte de culture cellulaire et stériliser UV pendant 10 min.
NOTE: Il est préférable de faire les plaques dans quelques jours d'utilisation. Cependant, les plaques peuvent être enveloppés dans du Parafilm sans tampon et conservés à 4 ° C pendant jusqu'à 2 semaines sans diminution notable de la qualité.
2. Cellule Placage
NOTE: Si l'étude de l'effet de knockdown de siRNA médiation, effectuer l'effet de choc en utilisant les instructions du fabricant ou le protocole optimisé pour le type de choix de cellule.
- Enrober chaque durotaxis chambre avec 1 ml de 10 pg / ml de fibronectine dans du PBS sans calcium et de magnésium pendant 1 heure à 37 ° C. En variante, la fibronectine peut être appliqué le jour avant l'analyse par incubation des PDMS avec 10 ug / ml de fibronectine dans du PBS pendant 16 heures à 4 ° C. Assurez-vous que toute la surface est immergée dans la fibronectine dans une solution de PBS.
- Préparer 1% de BSA dénaturée à la chaleur. Peser 0,5 g de BSA et le dissoudre dans 50 ml de PBS.Filtre stériliser la solution à travers un filtre de 0,22 pm et de la chaleur à 80 ° C pendant 12 min.
Note: Préparer cette solution la veille à la cellule de placage et conserver à 4 ° C. - Aspirer la solution de fibronectine et laver 3 fois avec PBS. Ajouter 1 ml de BSA dénaturée par la chaleur dans du PBS à chaque puits et incuber pendant 30 min à température ambiante.
- Trypsiniser et compter les cellules de choix, tandis que les chambres de durotaxis bloquent avec le BSA dénaturée par la chaleur.
- Plate 1 x 10 5 cellules dans un volume de 2 ml dans chaque puits de la chambre de durotaxis, en utilisant le support requis pour le type particulier de cellule de choix. Permettre aux cellules d'adhérer et se répandent sur le substrat pendant 4 heures dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec 5% de CO 2.
REMARQUE: U2OS cellules sont couramment maintenues dans du DMEM avec 10% de FBS, supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, et 10 UI / ml de pénicilline, 10 ug / ml de streptomycine.
NOTE: Le nombre de cellules utilisé dans cet exemple est optimisée pourU2OS cellules. Optimisation pour d'autres types de cellules peut être nécessaire. Cette densité donne les cellules assez de place pour migrer sans interactions importantes avec d'autres cellules.
3. imagerie des cellules vivantes
- Effectuer imagerie des cellules vivantes sur un microscope inversé, en utilisant contraste de phase avec un objectif 10X. Le microscope doit être équipé d'une chambre humidifiée environnement clos, permettant le contrôle de la température à 37 ° C et 5% de CO 2 lors de l'imagerie à long terme.
- Après que les cellules se sont propagées pendant environ 3,5 heures, assembler la plaque dans la chambre de microscope. Laisser l'échantillon (s) à équilibrer dans la chambre pendant 30 minutes.
- Mettre en place automatisée, multi-point en visite sur le microscope si disponible. Concentrez-vous sur l'interface entre les 90: 1 PDMS et la lamelle de verre et choisir les points à l'image tout autour de l'interface avec une moyenne de 40 points par durotaxis chambre. Image les cellules toutes les 10 minutes jusqu'à 16 h.
NOTE: La rerégion d'intérêt apparaît sous la forme de deux lignes, avec la ligne extérieure correspondant au bord de la lamelle couvre-objet et la ligne interne correspondant à l'interface réelle entre les PDMS et la lamelle. Voir Figure 1B.
Analyse des données 4.
- Générer un tableur comme dans le tableau 1.
- Comptez le nombre d'événements de passage des PDMS à la surface du verre et vice versa à partir de chaque film généré. Notez le nombre d'événements de passage dans la colonne appropriée dans la feuille de calcul Excel.
REMARQUE: Un événement de passage est défini comme le noyau de la cellule en passant au-dessus de la limite entre les PDMS et le verre dans les deux sens. - Pour quantifier plusieurs passages, compter le nombre de fois que la cellule a traversé l'interface. Ce nombre devrait être enregistrée dans la colonne Excel correspondant au substrat sur lequel la cellule se trouvait à la fin du film. Répétez l'analyse pour chaque cellule qui traverse l'interface en tfilm il. Exclure les cellules qui migrent hors du champ de vision au cours de l'imagerie.
NOTE: Il est également important de vérifier, par comptage au début de l'expérience cellule, que les cellules sont capables d'adhérer de manière égale aux PDMS revêtues de fibronectine et les surfaces de lamelle de verre. - Calculer le pourcentage de cellules qui ont migré à partir de PDMS à la surface du verre (par exemple, a subi durotaxis). Ajouter le nombre de traverser les événements de doux à dur et les multiples événements de passage qui se sont terminées sur le disque et diviser par le nombre total d'événements de passage.
- Calculer le pourcentage de multiples passages en divisant le nombre de multiples passages par le nombre total de passages.
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Representative Results
Un schéma de la chambre de durotaxis est représentée sur la Figure 1A. Substrat de PDMS souple (un 90 mélange 1 de la base PDMS agent de reticulation solutions) est réparti dans une boîte de 6 puits et une lamelle de verre est placée sur le dessus du PDMS, qui couvre alors partiellement la surface supérieure de la lamelle couvre-objet, en créant ainsi une interface entre les deux substrats différents de conformité. La rigidité du substrat de PDMS est doux ~ 1 kPa, ce qui est comparable à la conformité typique des tissus du cerveau, tandis que la rigidité du verre est de l'ordre de 1 à 2 GPa 1. Une image de contraste de phase de l'interface entre les PDMS et le verre est représentée par les flèches blanches sur la figure 1B. Les astérisques indiquent deux cellules de contrôle de l'ARNi migrant vers le substrat dur. Le bord irrégulier qui peut être vu (flèche noire) correspond au bord de la lamelle.
Pour quantifier les données, un tableur Microsoft Excel doit être généré comme dans le tableau 1 </ strong>. Le nombre d'événements de passage doit être compté et organisé dans la colonne correspondante. Certains des films générés ne peuvent être utilisés pour la quantification. Un film peut être omis de la quantification, si il ya une bulle dans les PDMS qui interfère avec une progression des cellules ou si les cellules sont trop denses, résultant dans des collisions qui peuvent radicalement influencer directionnalité cellulaire. La division cellulaire devrait également être surveillée, car cela peut également influencer ouvertement le mouvement des cellules.
Typiquement, les types cellulaires les plus adhérentes seront préférentiellement migrer vers un substrat rigide 2,4,12. Pour commencer à comprendre le mécanisme moléculaire par lequel les cellules répondent aux signaux mécaniques dans leur environnement, les protéines spécifiques peuvent être renversés en utilisant siRNA. Dans notre exemple, environ 70% des cellules traitées siARN contrôle expose durotaxis Figure 2A. En contraste frappant, quand cdGAP a été renversé en utilisant l'ARNi, les cellules avaient aucune préférencequant à savoir si ils ont migré sur le substrat dur ou mou Figure 2A. En outre, les cellules knockdown cdGAP franchi les limites à plusieurs reprises, tandis que les cellules traitées siRNA contrôle général seulement traversé la frontière une fois, la figure 2B. Pistes représentatifs de cellules de siARN de contrôle montrent que les cellules migrent généralement à travers la frontière une fois et préférentiellement restés à la surface plus rigide par rapport aux cellules cdGAP siRNA-traités qui ne démontrait pas une préférence pour la rigidité et traversé plusieurs fois aux limites figure 2C.
Figure 1. Schéma de la chambre durotaxis mis en place. (A) souple PDMS est répartie dans chaque puits d'une plaque à 6 puits et une lamelle de verre est placé sur le dessus du PDMS. Les PDMS empiéteront sur les côtés de la partie supérieure de la lamelle, avminerai elle durcit, pour former une interface entre les deux substrats. Durotaxis est déterminée par la directivité en marquant des cellules qui traversent l'interface PDMS / verre. (B) de l'image à contraste de phase représentatif montrant l'interface entre les PDMS gazeuses et substrat de verre rigide. Les astérisques indiquent les cellules d'ARNi U2OS traité subissant durotaxis commande. Les flèches blanches représentent l'interface entre les PDMS et lamelle de verre et la flèche indique le bord de la lamelle de verre sous les PDMS. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1. Schéma du tableur Microsoft Excel mis en place. Les colonnes sont établis pour inclure le numéro de film, siRNA utilisé, le nombre de cellules ayant migré des PDMS mousà substrat rigide en verre ou vice versa, ainsi que le nombre total de cellules analysées. Les colonnes sont également mis en place pour les cellules qui traversent les plusieurs fois d'interface et se terminent soit sur les PDMS mous ou le substrat de verre. Si une cellule migre à travers les limites de multiples fois, le nombre de multiples événements de passage de ces cellules est enregistré dans la colonne du substrat sur lequel la cellule a été observée à la fin du film.
Figure 2. Renversement de cdGAP U2OS dans les cellules entraîne une perte de durotaxis. (A) cellules de contrôle traitées siRNA migrent préférentiellement sur le substrat de verre rigide, alors que les cellules traitées cdGAP siARN ne présentaient aucune préférence. Cellules traitées (B) siRNA contrôle ont franchi la frontière entre les PDMS et le verre une fois. Cependant, les cellules cdGAP ARNi-traités ont migré avant et en arrière à travers le boundary plusieurs fois. (C) Les titres représentatifs de cellules traitées avec soit le contrôle, ou cdGAP siRNA ont été générés en utilisant le plugin de suivi manuel dans ImageJ. Les valeurs p ont été déterminées en utilisant un test t de l'élève et les erreurs barres représentent l'intervalle de confiance de 95%. Reproduit avec la permission de Wormer et al. 2014 11. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici, nous décrivons un test simple pour étudier durotaxis dans les cellules de la migration. Une des grandes forces de ce test est la facilité de préparation des chambres de durotaxis utilisant PDMS. La rigidité des substrats peut être facilement manipulé en changeant le rapport de la solution de base PDMS agent de reticulation afin de permettre l'étude des diverses rigidités dans le dosage. Cependant, une limitation potentielle du système est que les cellules ne sont exposés à un seul changement de rigidité substrat par opposition à éprouver un gradient de rigidité qui est fourni par des systèmes plus sophistiqués 4. Il est important, à la différence des substrats de Polyacrylamide, les composants de la MEC ne doivent pas être chimiquement réticulé au PDMS. En effet, le revêtement de fibronectine est approximativement équivalent sur les deux PDMS et les surfaces de verre, telle que déterminée par coloration avec un anticorps spécifique à la fibronectine 11. Etant donné que des études antérieures ont montré que les cellules se comportent de la même soit sur des substrats PDMS ou de Polyacrylamide, l'utilisation of PDMS substrats fournit un modèle beaucoup plus facile avec pour étudier mécanotransduction dans les cellules 10,12.
L'étape la plus importante dans la préparation des substrats PDMS est d'assurer que la base et les solutions d'agents de reticulation sont bien mélangés. Si elles ne sont pas assez bien mélangés, puis les substrats ne seront pas guérir complètement lors du traitement thermique. Cela se traduira par la lamelle d'amortissement trop loin dans les PDMS ou la lamelle couvre-objet à la dérive dans les PDMS lors de l'imagerie. Si la force de centrifugation est trop élevé, les solutions basiques et de réticulation peut se séparer dans le tube. Cela peut être résolu en réduisant la vitesse de centrifugation ou par dégazage du mélange pendant 30 min en utilisant une chambre à vide. Enfin, la densité cellulaire est critique, car trop de cellules vont influencer leur capacité de se propager pleinement et sans entrave à durotax par contact avec les cellules voisines. La densité rapportée ici a été optimisé pour les cellules U2OS. Toutefois, si d'autres types cellulaires sont utilisés, cel optimalenuméros de l devront être déterminées empiriquement.
Nous avons récemment utilisé cet essai pour étudier comment l'adhésion focale de signalisation des protéines cdGAP réglemente les mécanorécepteurs et durotaxis 11. De toute évidence, il ya de nombreux composants cellulaires, en plus de les adhésions focales, tels que des éléments du cytosquelette, les composants de la traite des protéines et des canaux ioniques qui sont impliqués dans la signalisation mécanique et peuvent donc également contribuer à la régulation de durotaxis 13 - 15. Chacun de ces composants peut être aisément évaluée en utilisant le système d'ARNi approches similaires. En outre, ce test est très souple pour l'introduction de divers activateurs ou d'inhibiteurs pharmacologiques. Le test peut également être adapté pour permettre des formes plus sophistiquées d'analyse tels que l'incorporation de protéines étiquetées par fluorescence, en combinaison avec de FRET ou FRAP approches, pour étudier la dynamique des protéines et l'activation spatio-temporelle.
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Acknowledgments
Ce travail est soutenu par le NIH R01 GM47607, CA163296 et NSF 1.334.493 de CET. Nous remercions les membres du laboratoire Turner pour une lecture critique du manuscrit. Toutes les données présentées dans ce rapport ont été reproduits avec l'autorisation de Wormer et al. 2014 11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12 mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
References
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