Abstract
I denna studie, är bakteriell nanocellulosa (BNC) som produceras av bakterier Gluconacetobacter xylinus syntetiseras och impregneras in situ med järnoxidnanopartiklar (IONP) (Fe 3 O 4) för att ge en magnetisk bakteriell nanocellulosa (MBNC). Syntesen av MBNC är en exakt och särskilt utformade flerstegsprocess. Kortfattat, bakteriell nanocellulosa (BNC) pellicles bildas från bevarade G. xylinus stam enligt våra experimentella krav på storlek och morfologi. En lösning av järn (III) kloridhexahydrat (FeCl3 · 6H 2 O) och järn (II) klorid tetrahydrat (FeCl2 · 4H 2 O) med en 2: 1 molförhållande bereds och späds i deoxygenerat hög renhet vatten. En BNC hinna införes därefter i kärlet med reaktanterna. Denna blandning omröres och upphettas vid 80 ° C i ett silikonoljebad och ammoniumhydroxid (14%) tillsätts sedan genom att släppa för att fälla utferrojoner in i BNC mesh. Det sista steget tillåter formning in situ magnetitnanopartiklar (Fe 3 O 4) inuti bakterienanocellulosa nät för att ge magnetiska egenskaper till BNC hinna. En toxikologisk analys användes för att utvärdera biokompatibiliteten hos BNC-IONP pellikel. Polyetylenglykol (PEG) användes för att täcka de IONPs i syfte att förbättra deras biokompatibilitet. Svepelektronmikroskopi (SEM) bilder visade att IONP lokaliserades företrädesvis i fibrill interlacing utrymmen i BNC matris, men några av dem var också finns längs BNC band. Magnetisk kraft mikroskop mätningar utförda på MBNC upptäckte närvaron magnetiska domänerna med hög och svag intensitet magnetfält, vilket bekräftar den magnetiska karaktär MBNC hinna. Youngs modulvärden som erhölls i detta arbete är också i en rimlig överensstämmelse med de som rapporterats för flera blodkärl i tidigare studier.
Introduction
Den bacterian nanocellulosa (BNC) syntetiseras av Acetobacter xylinum-stam, även känd som Gluconacetobacter xylinus, och deponeras i form av filmer eller pellicles på luft-vätskegränsytan under stationär odling. Dessa BNC pellicles anta formen av behållaren där de odlas, och deras tjocklek beror på det antal dagar i odling. A. xylinus använder glukos i mediet för syntes av cellulosa mikrofibriller genom en process för polymerisation och efterföljande kristallisation. Polymerisationen av glukosrester utföres vid det bakteriella extracellulära membranet där glukan kedjor extruderas från enstaka porer fördelade över cellhölje. Kristallisation av de cellulosa mikrofibriller förekommer i det extracellulära utrymmet med bildandet av glukan kedja ark genom van der Waals-bindning, följt av stapling av arken genom H-bindning 1.
Magnetic nanopartiklar som integreras för att en BNC matris kan manipuleras enkelt genom ett yttre magnetfält för att öka den kraft som är nödvändig för att rikta och begränsa glatta muskelceller (SMC) innehållande magnetiska nanopartiklar, vid skadade platsen av artärväggen. Denna strategi håller SMC bort från andra vävnader, och håller cellerna på plats mot kraften som utövas av blodflödet. Det har visats att SMC spelar en viktig roll i vasoelasticity av blodkärlet, där de bildar rikligt skikt belägna huvudsakligen i tunica media 2.
Den metod som används för syntes av MBNC involverar BNC hinnan nedsänkt och omrördes i en lösning av järn (III) klorid-hexahydrat och järn (II) kloridtetrahydrat vid 80 ° C. Ammoniumhydroxid tillsätts till att bilda järnoxidnanopartiklar inuti BNC mesh. Tillsats av ammoniumhydroxid ändrar färg på lösningen från orange till svart. Den IONPs kompakta tillsammans längs BNC fibrills med en icke-enhetlig fördelning.
Detta protokoll är inriktat på utformningen av en bakteriell nanocellulosa magnetisk nanopartiklar hinna, som vi kallar magnetisk bakteriell nanocellulosa (MBNC), som är avsedd att användas som ett substitut för saknade, skadade eller skadade blodkärl med liten diameter. HS Barud och medarbetare har nyligen publicerat en liknande arbete för att producera en BNC-baserad flexibel magnetisk papper genom att blanda BNC pellicles i en stabil vattendispersion av PEG och superpara järnoxid nanopartiklar 3. Här beskriver vi produktionen av bakteriecellulosa och dess impregnering in situ med magnetiska nanopartiklar. En cytotoxicitetsanalys baseras på detektering av enstaka DNA-strängbrott användes för att testa biokompatibiliteten hos BNC och MBNC pellicles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av Bakteriell Nanocellulosa (BNC)
Notera: Alla steg utförs under aseptiska förhållanden, om inte annat anges.
- Förbereda odlingsmedium.
- Förbereda 500 ml flytande odlingsmedium genom att kombinera 25 g jästextrakt, 15 g pepton, 125,0 g mannitol och 500 ml vatten med hög renhet. Autoklavera denna blandning vid 120 ° C under 20 min och förvara vid 4 ° C.
- Bereda 100 ml av halvfasta media genom att tillsätta 15 g agar till 5,0 g jästextrakt, 3,0 g pepton, 25,0 g mannitol, och 100 ml vatten med hög renhet. Autoklavera denna blandning vid 120 ° C under 20 min. Gång autoklaveras, deposition 5 ml av blandningen i en 90 mm x 16 mm plastpetriskål. Låt lösningen gel vid 4 ° C och förvara vid denna temperatur tills vidare användning.
- Rehydrera G. xylinus stam bevaras i frystorkade ampuller genom att tillsätta 1 ml flytande odlingsmedium och pipettera upp ochner, såsom anges med tillverkarens instruktioner.
- Ympa petriskålar innehållande halvfasta medier med små droppar av bakteriesuspensionen med hjälp av en ympning slinga. Se till att inokulatet täcker hela petriskålen genom att flytta slinga i ett sick-sack riktning från kanten till mitten av skålen.
- Inkubera petriskålar vid 26 ° C under 72 h i en inkubator utan CO2. När inkubationsperioden är fullständig, små vita kolonier är synliga. Om kolonierna inte omedelbart används, förvara petriskålar vid 4 ° C genom att försegla locket med Parafilm och placera skålarna upp och ned. Kolonierna kan lagras på detta sätt i upp till 6 månader.
- Överför 2 ml av det flytande odlingsmediet som framställts i steg (1.1.1) i varje brunn i en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta. Ta två kolonier med en ympning nål från ympade petriskålar i steg (1,3) och placera dem i den första brunn i vävnadsodlingsplattan. REPEAT samma procedur för de återstående 23 brunnarna.
- Inkubera vävnadsodlingsplatta vid 30 ° C under 7 dagar. Detta kommer att ge totalt 24 BNC pellicles med diameter på 16 mm och en tjocklek av ca 2-3 mm i diameter, såsom visas i figur 1.
Obs: Inte störa bakteriekulturen vid något tillfälle under inkubationstiden, t ex genom att skaka plattorna. Under inkubationstiden, G. xylinus extruderar glukopyranos sockermolekyler för att bilda en polymer kristallint nät i luft-vätskegränssnittet, som antar formen och storleken på kolven under statiska odlingsbetingelser. Denna polymermatris, som kallas bakteriell nanocellulosa (BNC), är iögonenfallande vid slutet av inkubationsperioden. - Samla BNC pellicles från tillväxtmedier och sterilisera dem i 200 ml 1% NaOH-lösning under 1 h vid 50 ° C, för att avlägsna alla spår av G. xylinus. Eventuellt, rör om denna lösning vid 300 varv per minut med användning av en magnetisk stångoch en omrörningsplatta. Kassera NaOH-lösning och tillsätt 200 ml av nyberedd 1% NaOH-lösning. Upprepa samma process en gång eller tills BNC pellicles i lösning förvärvar en genomskinligt utseende.
- Skölj BNC pellicles med vatten tre gånger och lagra dem i vatten med hög renhet vid RT. Se till BNC pellicles är helt nedsänkt i vattnet och är inte tillåtna att torka när som helst.
- Autoklavera BNC pellicles vid 121 ° C under 20 min.
Obs: En subkutan studie på råtta som utförs av Märtson och medarbetare in vivo visade icke-nedbrytnings tecken på BNC efter 60 veckor implantation. I själva verket är BNC nedbrytbart i naturen genom mikrobiella och svampenzymer, som är frånvarande i däggdjur. Å andra sidan, kan den biologiska nedbrytbarheten av BNC vara resultatet av mekaniska, kemiska och biologiska processer som försvagar mikrofibrill nätverket in vivo 4.
2. Syntes av polymerbelagdaJärnoxid Nanopartiklar och dess deponering i en bakteriell Nanocellulosa Membrane
- Bubbla 1000 ml vatten med hög renhet med kvävgas för att avlägsna eventuellt löst syre i vattnet och ersätta den med kväve.
- Använda en tre-halsad rundbottnad kolv för att framställa en lösning i ett 2: 1 molförhållande av järn (III) klorid-hexahydrat (FeCl3 · 6H 2 O) och järn (II) kloridtetrahydrat (FeCl2 · 4H 2 O) utspädd med deoxygenerat hög renhet vatten. Till exempel använder 5,4 g FeCl 3 · 6H 2 O och 1,98 g FeCl2 · 4H 2 O i 10 ml deoxygenerad hög renhet vatten. Om detta preparat vänder alltför viskös och svår att röra, använda 0,54 g FeCl 3 · 6H 2 O och 0,198 g FeCl2 · 4H 2 O i 20 ml deoxygenerad hög renhet vatten.
Obs: Minska exponeringstiden för FeCl2 · 4H 2 O till luft genom att väga denna chemical förening så snabbt som möjligt. När de har införts i tre-halsad rundbottnad kolv, stäng tre-halsad rundbottnad kolv med septum proppar tills den är ansluten till kväve gasförsörjning och kondensröret. - Använd två halsarna på fartyget för att ge en konstant ingång och utgång av kvävgas genom att ansluta kvävgastillförseln till en nålas i en septum propp och fixeras till fartygets halsar.
- Placera en BNC hinna som framställdes tidigare i steg 1,5 (15,6 mm diameter och 2-3 mm tjocklek) i kärlet med reaktanterna. Kontrollera att provet är fullständigt nedsänkt i vätskan.
- Anslut den återstående hals fartyget till ett kylrör. Dessutom använder ett torkrör fyllt med vattenfritt kalciumsulfat ovanpå kondensröret. Kör vatten genom kondensröret.
- Täta alla ningar med vakuum fett.
- Värm lösningen i ett silikonoljebad till 80 ° C med användning av en omrörningskokplatta och hålla denna temperatur tills steg 2,10. Använda en liten magnetisk omrörarstav för att blanda reaktanterna vid 350 rpm under 5 min. Kontrollera att BNC är lämpligt impregnerad med ferrolösning och reaktantema är helt upplöst. Hålla omröring av blandningen fram till slutet av experimentet.
Notera: Använd en termometer för att kontrollera temperaturen hos den silikonolja. Det bör vara stabil till 80 ° C. - Öka omröringen hastighet till 700 varv per minut och tillsätt (genom att släppa), i ett tidsintervall på 5 min, 5 ml ammoniumhydroxid (NH4OH, 14%) till 10 ml av järnlösningen med användning av en pipetterings nål, som har varit också stansas i en septum propp. Efter tillsats av ammoniumhydroxid, färgen på lösningen förändras från gul / orange till svart.
- Fortsätta omröring av lösningen vid 80 ° C under ytterligare 5 min. Undvika höghastighets rörelserna för att bibehålla integriteten av provet. Höga hastigheter, dvs., högre än 1000 varv per minut, kan förstöraprovexemplaret.
- Sänka temperaturen hos lösningen till 30 ° C med användning av temperaturregler botten av omrörning värmeplatta och hålla omröring i ytterligare 5 min. Stäng sedan den varma plattan. Vid denna punkt har den IONP införlivats i BNC nätet.
- Kyl blandningen ner till rumstemperatur och separera de magnetiska nanopartiklar (MNP) och BNC med hjälp av en stark permanentmagnet (t.ex. en Tesla). För att göra detta, överföra blandningen till ett kärl kolv och sedan, samtidigt som magneten nära fartyget håller MNP och BNC på plats medan dekantering supernatanten.
Obs: Var försiktig vid hantering av starka magneter, eftersom de kan vara skadliga när de används på fel sätt. För steg (2,12) - (2,14) och (2,16) använda deoxygenerat högrent vatten beredd tidigare i (2,1) för att förhindra partiklar från oxidation. - Suspendera MNP och BNC i 100 ml vatten. Skaka lösningen för att avlägsna alla MNP som inte är starkt införlivas BNC. Dekantera supernatant igen genom att hålla MNP och BNC på plats med hjälp av magneten.
- Tvätta MNP och BNC flera gånger med vatten tills supernatanten når neutralt pH (pH ~ 7), mätt med användning av en kolorimetrisk remsa.
- Separera magnetiskt funktion BNC eller magnetisk bakteriell nanocellulosa (MBNC) från MNP använder pincett och skölj MBNC flera gånger med vatten tills vattnet är klart.
- Sterilisera MBNC genom att exponera MBNC O / N för UV (110-280 nm).
- Autoklav 500 ml deoxygenerat högrent vatten vid 120 ° C under 20 minuter och förvara MBNC i 20 ml av detta vatten.
- Aseptiskt, sänk ned provet i en% av PEG och rör om under 2 h vid RT (37 ° C). Detta förfarande förbättrar biokompatibilitet och stabiliteten hos järnoxidnanopartiklar deponeras i BNC, särskilt de som är utsatta på ytan 5-7. PEG beläggningen kommer att fördelas över MBNC 3D nätverket.
Notera: Naked IONP är lätt oxideras i luftgrund av deras höga kemiska aktivitet 8. Även om PEG anses vara en icke-biologiskt nedbrytbart material, dess kemiska stabilitet beror på de tillämpade biologiska förhållanden, såsom vattenhalt, pH, temperatur, närvaro av enzymer, reaktiva syrespecies, reaktiva kvävearter, och andra 9.
3. Karakterisering av BNC och MBNC Pellicles
- Mekaniska egenskaper
- Utför normal lastning och lossning nanoindentation test med en Berkovich indenter. Radien för Berkovich diamant indenter är 20 nm.
- Använda smält kiseldioxid och volfram för att kalibrera kontaktyta som en funktion av indrag djup vid RT. Under provningen, montera prover på fördjupningen med hjälp av lim. Indenter närmade proven i sin tjockleksriktning.
- Slumpmässigt välja indrag platser på prov ytor. Håll avståndet mellan 2 indrag mellan 200-300 mm.
- Applicera lasten tillprov i steg och registrera motsvarande förskjutning av indenter. Analysera kurvan för belastning mot djupet för att hitta den Youngs modul.
- Utföra nanoindentation testet av proverna i närvaro av avjoniserat vatten (Dl-vatten), och testet genom att applicera belastningshastigheter mellan 0,0001 mN / sek och 0,005 mN / sekund, med toppbelastning mellan 0,01 mN och 0,60 mN.
- Använda en vätskecell och hålla proven under vätskor miljön. Denna unika inställning för nanomechanical karakterisering nedsänkt i en vätska miljö är idealisk för att effektivt simulera räckvidden biomekaniska funktionalitet BNC och MBNC membran.
- Strukturell karaktärisering genom SEM
- Karakterisera nanocellulosa fiberstrukturen genom svepelektronmikroskopi (SEM).
- Lyofilisera proverna under 24 h vid -80 ° C. Sedan montera på SEM dubbar, spotta med Au-Pd film för 10 sek och analysera med hjälp av SEM.
- Tar bilder vid en förstoring av 22,000Xoch 60,000X, med en accelerationsspänning på 5 kV.
- magnetiska domänerna
- Tillåta MBNC pellicles till helt torrt vid RT, och därefter utsätta under 5 min till en permanentmagnet (en Tesla).
- Omedelbart genomföra den magnetiska kraften mätningar med en bio-AFM enligt tillverkarens protokoll.
- För varje mätning, fånga Först topografi funktioner och förvärva de magnetiska domänerna under ett andra pass. Skaffa båda mätningarna med bio-AFM i kontaktfri läge.
- Magnetisk karakterisering av nanopartiklarna skall utföras med hjälp vibrerande provmagnetometer (VSM) i det fysikaliska egenskapsmätningar system (PPMS) av Quantum Design, vid RT (300 K), med ett magnetfält inom intervallet -10000 till 10000 Oe.
- Cytocompatibility
- Utsädes humana glatta muskelceller från aorta (HASMC) i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta vid en densitet av 1,0x10
- Använda populationer av obehandlade och väteperoxid behandlade celler som negativa och positiva kontroller, respektive.
- Utför Comet analys enligt tillverkarens protokoll och de riktlinjer som föreslås av A. Azqueta & AR Collins 10.
- Använda nukleinsyran färgämnet SYBR Gold i denna analys för att inskjuta och fluorescent märka DNA som finns i de elektroforesbehandlade provexemplaren enligt tillverkarens protokoll.
Notera: Celler som inte genomgår någon DNA-skada i närvaro av BNC och MBNC prover, kommer att visa en fluorescerande runda grön nukleoid, medan DNA skadade celler kommer att ha långa kometer - positiva prover kommer att ha nucleoids (chefen för kometen) följt av svansar som innehåller fragmenterat DNA-material (procentandel av DNA i svansen).
- Utsädes humana glatta muskelceller från aorta (HASMC) i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta vid en densitet av 1,0x10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inkubationstiden för G. xylinus var totalt 9 dagar, men pellicles började bildas tidigare och var tydlig efter ca 2 dagar. Den makroskopiska utseendet på BNC visas i figur 1, vars form härmar den av skålen odlade kulturen. Figur 2 beskriver förfarandet för framställning av BNC-IONP pellicles, där sammanfattningar de huvudsakliga steg som ingår i protokollet ovan, såväl som konfigurationen av huvudkomponenterna.
SEM-bilder användes för att lösa mikro, morfologi, och rumslig fördelning av fibrerna i BNC (Figur 3) och IONP distribution i funktionalis BNC (Figur 4). BNC bildas av fina band (ca 50 nm i diameter) som bildar öppna porer i hela nätverket utan ett definierat mönster. Den IONP är preferentiellt located mellan porerna bildade genom fibrill interlacing, som bildar kluster av 100 nm eller mer i storlek. Individuell IONP är också bundna längs banden. Den MBNC uppvisar en mindre sammanpressad fibrillstruktur jämfört med BNC, förmodligen på grund IONP föra samman BNC: s band. Magnetisk kraft mikroskop användes för att rekonstruera den magnetiska profil vid topografi MBNC (Figur 5A, B). Stora porer av 500 nm diameter eller större bildas i MBNC, som inte observerades i obehandlade BNC (figur 5A). Detta är i överensstämmelse med iakttagelserna i SEM mikro där MBNC visar en mer porös struktur än den omodifierade BNC. En magnetisk kraft gradient med två domäner med olika magnetisering upptäcktes över MBNC ytan (Figur 5B), vars kontrast inte korrelerar med toppar och dalar som bildas av IONP-rika regioner i MBNC topografiska bilder (Figur 5A). Hög och svag Intensity magnetfält betecknas enligt gult och grönt i figur 5B resp. Hysteresslingan av de nanopartiklar, som mäts inbäddade i den bakteriella nanocellulosa, visas i figur 5 tillhandahåller bevis för att alla IONPs var superparamagnetiska vid RT, med ingen hysteres.
HASMC odlades i närvaro av BNC och MBNC att testa någon skadlig effekt på livskraften hos enskilda celler som en följd av exponering för dessa främmande material. Omfattningen av skador i enskilda celler kvantifierades genom detektion av DNA-strängbrott (Figur 6). Resultaten jämfördes med HASMC odlas under normala odlingsbetingelser av 37 ° C, 95% luft och 5% CO 2 (negativ kontroll) och att HASMC med väteperoxid-inducerad genotoxicitet (100 ^ M H2O 2) under 30 min ( positiv kontroll). Parade jämförelser med hjälp av t-test visade thpå effekterna av MBNC på cellviabiliteten var signifikant skiljer sig från de som induceras med väteperoxid behandling HASMC (p -värde <0,001, ***).
Figur 1. Makroskopiska aspekter av bakteriell nanocellulosa. BNC pellicles har erhållits efter en 11-dagars inkubationstid, som är ca. 3 mm i tjocklek. Inkubationstiden beror på kraven för den avsedda användningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Tillverkning av magnetiskt funktion bakteriell nanocellulosa. Järnoxid nanopartiklar är monterade och jag ncorporated in situ inom BNC, vilket ger en MBNC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. SEM-bild av BNC. BNC visar ett finmaskigt nät och icke-aggregerade band med storlekar av 50 nm eller mindre. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. SEM-bild av BNC-IONP hinna. Järnoxid nanopartiklar (IONP) är företrädesvis positionerade mellan de sammanflätade band.d / 52.951 / 52951fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. AFM topografi MBNC och magnetiska strukturer domän. (A) Surface topografi MBNC visar fläckar av mycket paketerade nanopartiklar, som står ovanför nanofibril strukturen. (B) Gula och gröna områden anger två områden med olika magnetisering av hög och svag intensitet magnetfält respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Omfattningen av DNA-skada i HASMC efter att exponeringentill BNC och MBNC respektive. PosCtl betecknar HASMC som genomgick väteperoxidbehandling i jämförande syfte. NegCtl betecknar HASMC växer under normala odlingsbetingelser. De skadliga effekterna av den MBNC på HASMC livskraft var signifikant skiljer sig från dem som observerats i PosCtl (p-värde <0,001, ***). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tjockleken och storleken av BNC hinnan lätt kan manipuleras genom att ändra inkubationstiden och storleken på kolven i vilket det odlas under statisk odling. De microproperties av BNC, såsom porositet, kan modifieras genom att ändra syreförhållande i statisk odling. Högre syrehalter ger hårdare BNC 11. A. Bodin och medarbetare producerade rör av BNC med ett bristningstryck på upp till 880 mm Hg genom att ändra syreförhållande från atmosfäriskt syre till 100% syre under jäsningsprocessen av G. xylinus 12. På liknande sätt kan porositeten hos BNC också införas genom att inkorporera porogener såsom paraffinvax mikrosfärer in i fermenteringsprocessen. Den resulterande porositet och por sammankoppling i detta fall kommer att bero på porogen storlek 13.
Det porösa nätverket av BNC gör att de kan funktionaliseras med nanopartiklar, till exempel, för läkemedelstillförselmedel. I vår studie har vi funktion BNC med IONP genom att syntetisera och växande in situ nanopartiklarna i BNC membranet, för att genomföra en magnetisk protokoll för snabb cellrekrytering och fastsättning i BNC-baserade ställningar. Nanomechanical test visar att nanoskala svaret hos BNC beter sig på liknande sätt med blodkärl 14 med en mycket låg elasticitetsmodul, E BNC = 0,0025 GPa inuti proven till 0,04 GPa vid ytan. De erhållna värdena ligger inom intervallet med de som observerats av Fu et al. 15.
Överskottet av IONP kunde lätt avlägsnas från BNC grund av den höga porositeten hos materialet. SEM-fotografier visade att nanopartiklarna är i huvudsak fördelat i de utrymmen som bildas av fibriller sammanflätning och spridda längs banden. Koncentrationen av järn arter som används i detta protokoll gav hög tätt förpackade IONP, som sammanförde BNC: s band. Detta resulterade i enMBNC med större porer än de av den omodifierade BNC. Olsson et al., Som använde olika koncentrationer av FeSO 4 / CoCl2 salter med samma volymandel av BNC i syntesen av cellulosa nanofibril aerogel, rapporterade en liknande ökning i BNC porositet när de ändrade volymfraktionen av den ferromagnetiska kobolt ferrit nanopartiklar från 0,7% till 5,7% 16. Denna höga porositet i MBNC kan vara fördelaktigt för avsättning av läkemedel som ökar tiden för återhämtning och undvika restenos vid skadade artärväggar.
Bristen på korrelation mellan de topografiska egenskaper och magnetiska fas bilder har också beskrivits av et al. B. Torre 17, som påpekade oberoende mellan topografin och de magnetiska signalerna från glesa nanopartiklar filmer. Ytterligare karakterisering studier behöver utföras för att bestämma magnetiseringen hysteres (MH) slingor av MBNC via SQUID-VSM systjälkar.
Den MBNC visade låg risk för toxiska effekter, enligt resultaten som observerats i Comet analys, vilket indikerar att detta material är biokompatibelt för att använda i kontakt med celler.
De mest kritiska stegen i proceduren är relaterade till mängden av ammoniumhydroxid och den hastighet med vilken den tillsätts, såväl som att säkerställa fullständig nedsänkning och omrörning av BNC i lösningen under reaktionen. Den första aspekten bestämmer storleken av de resulterande järnoxidnanopartiklar, medan den andra en påverka hur nanopartiklarna är fördelade över i BNC-matrisen. För att bättre styra storleken på MNP, kan en byrett med en kran användas för att reglera tillägg genom att släppa ammoniumhydroxid i reaktionen. Små bitar av BNC som kan vara helt nedsänkta i lösningen rekommenderas, till exempel, storlekar på cirka 1,9 cm 2 för en total volym av 10 ml lösning. ena begränsade tiförandet av denna teknik är den inhomogena fördelningen av IONP inuti BNC mesh.
Detta protokoll beskriver en metod för att införliva nanopartiklar av järnoxid i BNC för att bilda en komposit. På grund av biokompatibiliteten och de fysikaliska och mekaniska egenskaperna hos både den BNC och järnoxidnanopartiklar, kan MBNC användas i en mängd olika biomedicinska tillämpningar såsom läkemedelstillförselsystem och ställningar för celltillväxt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucoacetobacter xylinus | ATCC | 700178 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296-500G | |
| D-Mannitol Bioxtra | Sigma Aldrich | M9546-250G | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacteriological Peptone | Sigma Aldrich | P0556 | |
| Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water | Sigma Aldrich | 158127-100G | |
| Iron(III) Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489-100G | |
| Ammonium Hydroxide | Macron Fine Chemicals | 6665-46 | |
| Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400 | Sigma Aldrich | 202398-250G | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma Aldrich | 44939-250G | |
| Disposable Petri dish | Sigma Aldrich | BR452000 | |
| Disposable Inoculating Loop | Fisher Scientific | 22-363-604 | |
| Anhydrous Calcium Sulfate | W.A. Hammond Drierite | 13001 | |
| High vacuum grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends | Sigma Aldrich | CAD7937-12EA | |
| pH test strips | Sigma Aldrich | P4786-100EA | |
| Round-bottom three neck angle type distilling flask | Sigma-Aldrich | CLS4965250 | |
| Silicone oil for oil baths | Sigma-Aldrich | 85409-250ML | |
| Drying Tube | Chemglass | CG-1295-01 | |
| Septum Stopper, Sleeve Type | Chemglass | CG-3022-98 | |
| Magnetic stir bar | Chemglass | CG-2001-05 | |
| Condenser | Chemglass | CG-1218-01 | |
| Temperature Controller | BriskHeat | SDC120JC-A | |
| Stirring Hotplate | Fisher Scientific | 11-100-49SH | |
| Comet Assay Kit | Trevigen | 4250-050-K | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies | S-11494 | |
| bio-AFM | JPK Instruments | NanoWizard 4a BioScience AFM | |
| Nanoindenter | Micro Materials Ltd | Multi-module mechanical tester | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | Hitachi High Technologies America | Hitachi S-4800 |
References
- Saxena, I. M., Brown, R. M. Biosynthesis of bacterial cellulose. Bacterial Nanocellulose: A Sophisticated Multifunctional Material. , 1-18 (2012).
- Chan-Park, M. B., Shen, J. Y. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. J.Biomed.Mater.Res.A. 88, 1104-1121 (2009).
- Barud, H. S., et al. Biocellulose-based flexible magnetic paper. J. Appl. Phys. 117, (2015).
- Märtson, M., Viljanto, J., Hurme, T., Laippala, P., Saukko, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20, 1989 (1999).
- Illésa, E., Tombácza, E., Szekeresa, M., Tótha, I., Szabób, Á, Iván, B. Novel carboxylated PEG-coating on magnetite nanoparticles designed for biomedical applications. J. Magn. Magn. Mater. 380, 132 (2015).
- Torrisi, V., et al. Preventing corona effects: multiphosphonic acid poly(ethylene glycol) copolymers for stable stealth iron oxide nanoparticles. Biomacromolecules. 15, 3171 (2014).
- Cai, Z., Kim, J. Bacterial cellulose/poly(ethylene glycol) composite: characterization and first evaluation of biocompatibility. Cellulose. 17, 83 (2010).
- Wu, W., He, Q., Jiang, C. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis and surface functionalization strategies. Nanoscale Res. Lett. 3, 397-415 (2009).
- Ulbricht, J., Jordan, R., Luxenhofer, R. On the biodegradability of polyethylene glycol, polypeptoids and poly (2-oxazoline)s. Biomaterials. 35, 4848 (2014).
- Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch. Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
- Scherner, M., et al. In vivo application of tissue-engineered blood vessels of bacterial cellulose as small arterial substitutes: proof of concept. J. Surg. Res. 189, 340 (2014).
- Bodin, A., et al. Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotechnol Bioeng. 97, 425 (2007).
- Zaborowska, M., et al. Microporous bacterial cellulose as a potential scaffold for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 6, 2540 (2010).
- Karimi, A., et al. A comparative study on the mechanical properties of the umbilical vein and umbilical artery under uniaxial loading. Artery Res. 8, 51 (2014).
- Lina, F., Ping, Z., Shengmin, Z., Guang, Y. Evaluation of bacterial nanocellulose-based uniform wound dressing for large area skin transplantation. Mater. Sci. Eng. C. 33, 2995 (2013).
- Olsson, R. T., et al. Making flexible magnetic aerogels and stiff magnetic nanopaper using cellulose nanofibrils as templates. Nature Nanotech. 5 (8), 584-588 (2010).
- Torre, B., et al. Magnetic force microscopy and energy loss imaging of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Sci. Rep. 1 (202), 1-8 (2011).
