Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Разработка сульфидогенных шлам из морских отложений и уменьшению трихлорэтилена в одеяло реактора с восходящим потоком анаэробного ила

Published: October 15, 2015 doi: 10.3791/52956

Introduction

Одним из наиболее важных вкладов в окружающей биотехнологии была конструкции биореакторов, в котором шлам использовали (инокулята) смог выполнить в соответствии с серопонижающих условиях. Сульфатредукция (SR) позволяет обрабатывать потоков сточных вод, содержащих высокие концентрации сульфата в дополнение к одновременным удалением ХПК, тяжелых металлов и органических загрязнителей, в том, что делает SR желательной характеристикой шлама 1. Некоторые примеры стоков, загрязненных сульфата приходят из кожевенных, бумажных, фармацевтической и химической отраслях обрабатывающей промышленности 1. Тем не менее, в большинстве литературы относится к сульфидогенных шлама при метаногенных гранулированного осадка была адаптирована к sulfidogenesis 2. Эта адаптация обычно достигается путем манипулирования ХПК / SO 4 2- соотношение в биореакторе и добавления химических веществ ингибировать метаногены в иле 2,3. В дополнение к длительного времени, что Mау требует формирования сульфидогенных гранул, конкуренция между метаногенами и сульфатных восстановителей и толерантности ила высоких концентраций сульфида некоторые из основных проблем, которые могут возникнуть, если сульфидогенных шлама используется в биореакторе получают из адаптации преимущественно метаногенных осадка сульфат восстановительных условиях. В этой работе мы описываем процедуру получения преимущественно сульфидогенных шлама из гидротермальных жерл осадков (Punta Mita, Наярит, Мексика) в восходящим анаэробного ила реактора (UASB), то мы оцениваем ее серопонижающих деятельность в течение долгого времени, и провести эксперимент чтобы оценить его заявление о восстановительного дехлорирования. Расположение отложений был выбран потому, что было сообщено, что в этом месте происходит образование сульфидов за счет снижения активности сульфата проявляемой микробного сообщества, обитающих этом конкретном месте 4.

Есть разорватьаль преимущества в получении этой сульфидогенных шлама из осадков в течение адаптации метаногенные гранулированный осадок, чтобы sulfidogenesis. Некоторые из этих преимуществ: (1) нет необходимости, чтобы сформировать гранулы для биореактор в эксплуатации, (2) шлам терпит относительно высокие концентрации сульфида по сравнению с другими UASB, которые работают с адаптированной метаногенного ила, и (3) есть нет конкуренции за субстрат с метаногенами даже если ацетат, используемых в смеси летучих жирных кислот, которые включены в культуральную среду, чтобы способствовать образованию осадка.

Эта процедура последовало способствовать sulfidogenesis потому морские отложения являются естественным пул широкого спектра микроорганизмов, таких как бактерии серопонижающих, ферментации бактерии и бактерии дегалогенирование это лишь несколько 5,6. Тип консорциума разработана из морских отложений с помощью этого протокола может проявлять эффективность в сульфатредукции и поэтому, высокий с ulfate снижения активности в течение долгого времени и более высокую устойчивость к сульфида в концентрациях выше, чем сообщалось в токсичен для метаногенами и сульфатных бактерий. С другой стороны, вполне вероятно, что способность дегалогенирующего также показано в осадках, следуя протокол, предложенный здесь, но это может зависеть от исходного микробного сообщества. Это предположение делается на основании того факта, что восстановительное дехлорирование может происходить либо при дыхании или cometabolism, оба условия, которые могут быть способствовали в морской микробного сообщества 7. Культивирование отложений, чтобы получить шлам был проведен с использованием смеси ацетат, пропионат, бутират и в качестве субстрата, потому что эти летучие жирные кислоты используются несколько штаммов бактерий серопонижающих. Эти кислоты также тип соединений углерода часто встречается в морских отложениях, по мнению ряда отчетов в литературе на углеродистого материала в морских отложениях 5,6.

Содержание "> Наконец, некоторые из наиболее токсичных соединений, которые находятся в подземных и другие водоемы по всему миру являются хлорированные растворители, такие как трихлорэтилен (TCE) или перхлорэтилена (PCE). Эти соединения являются токсичными не только для человека, но также микроорганизмов, особенно ТВК, которая до сих пор считается приоритетным загрязнителем Агентством по охране окружающей среды в США 8. В этой работе мы предложили эксперимент, в котором сульфидогенных осадка проверяется на его способности снижать ТВК в концентрациях, которые находятся в Диапазон сообщалось хлорированные соединения биодеградации метаногенных условиях 9,10. Стоит отметить, что большинство исследований по биодеградации хлорированных соединений было проведено метаногенных условиях 9,10. Мы считаем, что эксперимент с ТВК предложил в этом протоколе является Хорошим примером потенциальных применений ила. Целью этого эксперимента было электроннойvaluate допуск шлама к TCE и TCE влияния на сульфате восстанавливающей активностью. Принимая во внимание, что большинство исследований по биодеградации хлорированных соединений осуществляется метаногенных условиях, этот протокол предполагает формирование осадка могут быть использованы одновременно: (1) удалени сульфата, (2) удалить трески и (3) удалить хлорированные соединения. Следующим шагом может быть, чтобы оценить шлама на одновременным удалением ТВК и тяжелых металлов (в дополнение к сульфату и ХПК), два условия, которые не могут быть оценены метаногенных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

фигура 1
Рисунок 1. Схема для шагов протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

1. Сбор морских отложений для формирования осадка

  1. Выявить доступным подводного область либо близко к гидротермальных жерл (из-за присутствия сульфидов, которые могут указывать на более высокий серопонижающих деятельность) или на территории, где мусор органического вещества являются обнаружить.
  2. Для этой работы, занимает примерно 3 или 4 кг осадка и слейте воду образцов. Поместите образцы в темных пластиковых пакетах. Нет холодильное не требуется.
  3. После того, как в лаборатории, держать сумки с образцами в холодильнике, если они не будут использоваться немедленно. Для этой работы, SAMPле может быть в холодильнике несколько недель или месяцев, прежде чем их использовать.
  4. Возьмите большую часть образца осадка (т.е., 1 или 2 кг) и использовать соответствующую сетку (0,2 см), чтобы исключить из отложений большой мусора из углеродистого материала, который может быть найден или некоторых пород, которые могут присутствовать.
    Примечание: В этом случае сетка 0,20 см в диаметре (0.0767 дюйма) был использован, но он может быть другого размера в зависимости от размера частиц в образце.
    1. После прохождения осадка через сетку, смешать часть выбранного способствовать тому, чтобы часть является однородным.
    2. Возьмите разделенных меньшие образцы (т.е., от 2 до 3 г), чтобы определить, летучих взвешенных твердых частиц (VSS), содержание, следуя стандартные методы 11.
      Примечание: На рисунке 2 шагах 1,2 до 1,4.

Рисунок 2
Рисунок 2. Фотографии образцов отложений.Образцы (А) засыпные только после того, как принято. Образца (В) осадка после прохождения через сетку. (C) образец, взятый для взвешивания до летучих взвешенных твердых частиц (VSS) определение. Чашку Петри не должны быть стерилизованы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. Биореактор Настроить

  1. Для этой работы, использовать стеклянную реактор UASB общей рабочим объемом 3 L. Альтернативно, используйте объем стеклянный реактор 1 или 2 л.
  2. В расчете на содержание VSS осадков рассчитать количество осадка для использования в качестве инокулята для получения 5 г VSS в 1 л
  3. Следует учитывать, что если количество осадка после вычислений слишком велико, то примерно 25% до 30% объема биореактора следует занятой отложений вместо.
    1. Запишите содержание VSS, так как онизменится, когда микробного сообщества обогащается в биореакторе. Содержание VSS необходим для расчетов серопонижающих деятельность в биореакторе.
  4. Убедитесь, что конечная концентрация базальной среды и буферного раствора в биореакторе похож на сообщает Guerrero Барахас и др. (2014) 12.
    1. Гарантировать, что окончательный объем осадков, базальной среде, буферный раствор и летучих жирных кислот равны окончательного рабочего объема реактора. Базальная среда рецепт 12 содержит соответствующие концентрации для трассировки металлов и витаминов решения.
    2. Подготовка исходного раствора базальной среде и буферного раствора в соответствующей концентрации для рабочего объема реактора, используемого (т.е. 2, 3 или 4 раза более концентрированный, чем сообщалось в шаге 2.4), чтобы гарантировать, что при разбавлении, что при концентрации сообщили в Герреро-Барахас и др. (2014)12).
      Примечание: Исходный раствор для базальной среде всегда необходимо, однако, буферный раствор необходим только при запуске. Нет необходимости добавлять буферный раствор после этого времени.
    3. Подготовка исходного раствора летучих жирных кислот: ацетат, пропионат и бутират в 2,5: 1: 1 ХПК пропорции. Примите во внимание для расчетов ацетат натрия, включенных в основной среде. Конечная концентрация ХПК в реакторе должна быть 2,7 г / л.
      Внимание: Подготовьте решение в вытяжном шкафу. Носите нитриловые перчатки и защитные очки для подготовки этого решения. Примите во внимание стехиометрии реакций сульфата с летучих жирных кислот, которые показаны на рисунке 3.
    4. Подготовка исходного раствора сульфата натрия (Na 2 SO 4) в соответствующей концентрации, чтобы доставить в реактор конечной концентрации 4,000 мг / л сульфат-иона (SO 4 2-). Кроме того, включают в себя гое количество сульфата, необходимого в базальной среде вместо добавления его из исходного раствора до тех пор, заключительного сульфата (SO 4 2-) концентрация прав.
  5. Поместите отложений в реакторе смешанного с частью базальной среды, чтобы убедиться, что они достигают нижней части реактора.
    1. Добавить остальные базальной среды и буферного раствора, смешанного с летучим раствором жирных кислот и раствор сульфата. Убедитесь, что решение летучих жирных кислот выливают в жидкости. Примечание: Провести этот шаг в вытяжном шкафу.
    2. Установите соединений и трубопроводов реактора к насосу рециркуляции. Установите скорость переработки потока в 60 мл / мин. Установка биореактора в холодильной камере при температуре 34 ° С. Регулярно проверяйте, что колебания температуры малы (то есть, 34 ± 1,7 ° С)
    3. Установите подключение к колонке перемещения газа.
      Примечание: Рисунок 4 для шагов 2.1 до 2.5.
    4. </ OL>

    Рисунок 3
    Рисунок 3. стехиометрии восстановления сульфатов с ЛЖК (ацетат, пропионат и бутират). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Рисунок 4
    Рисунок 4. UASB реактора. (А) начальный момент времени. (В) Непрерывный режим после 300 дней работы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    3. Эксплуатация реактора поощрять Sulfidogenesis и рост микроорганизмов

    Примечание: Разрешить для посевной потреблять Volatile жирные кислоты и сульфата. Для этого, ждать неделю, чтобы провести первый анализ для сульфата, сульфид и потребления ХПК.

    1. После одной недели инкубации взять пробу 5 до 7 мл жидкости для проведения анализа ХПК, сульфат и контент сульфида и pH следующие стандартные методы 11, 13.
      1. Анализ сульфида в жидкой спектрофотометрически (при длине волны (X) 670 нм), следуя метилен синий метод 13.
        1. Поместите по 5 мл раствора ацетата цинка (2% вес / вес) в 25 мл мерную колбу, добавить быстро 200 мкл образца к раствору ацетата цинка.
        2. Добавить 2,5 мл смеси N, N-диметил п -phenylenediamine раствора оксалата (DMP) (0,2% вес / вес в 20% H 2 SO 4) и 125 мкл железа (III), раствор сульфата аммония (10% вес / ж в 2% H 2 SO 4) и в комплекте с дистиллированной водой в 25 мл в мерную колбу. Подождите 30 мин для реакциипроизойти, время, в которое синий цвет стабилизировалась. 13.
          Примечание: Подождите по меньшей мере 15 мин, но не более чем за 60 мин до тестирования образцов в спектрофотометр. Провести чтение синей окончательного решения в спектрофотометр.
      2. Анализ сульфат соответствии со стандартными методами 11. Здесь количественно сульфат бария в виде сульфата с использованием метода Турбидиметрический.
        1. Поместите по 5 мл раствора для кондиционирования (соляная кислота HCl 1: 1) в мерную колбу на 25 мл, добавляют 1 мл предварительно центрифугируют образца (на 11,320 × г), завершить 25 мл мерную колбу с дистиллированной водой и добавить 1 г хлорида бария.
        2. Смешайте раствор в течение 1 мин в вихревой. Подождите 4 мин для сульфата бария с образованием и читать образца в спектрофотометре при длине волны (X) 420 нм 11.
      3. Анализ ХПК в соответствии со стандартными методами 11. В качестве альтернативы, используйте ХПК determinaние комплект.
        1. До определения ХПК, центрифуги образца тщательно (в 11,320 мкг), чтобы удалить оставшиеся сульфид, который может вмешиваться в определение. При необходимости, центрифуги дважды: первый раз сразу после взятия пробы, а второй раз ждать 6 или 8 ч, а затем провести анализ ХПК.
        2. Добавить 2 мл образца в реакционную пробирку комплекта определения ХПК, печать флакон и гомогенизации смеси путем легкого встряхивания. Приготовьте чистый добавлением 2 мл дистиллированной воды к другой реакционный сосуд и гомогенизации смеси.
        3. Поместите флаконов в реакторе пищеварения при 150 ° С в течение 2 ч. Удалить флаконы и дайте им остыть в темноте. Возьмите показания флаконов в спектрофотометре при длине волны 620 нм.
      4. Получение объем газа из колонки перемещения газа.
    2. Подождите до другого 5 до 7 дней, пока сульфат не потребляется. Сульфат и ХПК следует употреблять вpproximately 85% до 90%, прежде чем запускается новая партия кормили.
    3. После того, как сульфат (и ХПК) потребляются полностью повторите шаг 2.4. Поставка свежую среду и новые питательные вещества для каждой партии.
    4. Повторите шаги 3.1 и 3.2. На данный момент каждая партия должна длиться от 7 до 10 дней.
    5. При 3 до 4 порции были завершены, повторите шаг 2,4, но увеличивают концентрацию ХПК до 4 г / л.
    6. Повторите шаг 3.1 и 3.2 шаг.
      1. Повторите шаг 3,3, но увеличивают концентрацию ХПК до 6 г / л.
      2. Повторите 3.6 и 3.6.1 постепенно увеличивая концентрацию ХПК до тех пор, пока 10 г / л.
        Примечание: сделать график, который представляет концентрации сульфата (мг / л) в зависимости от времени (г).
    7. При Расход сульфата составляет более 80% менее чем за 24 ч и это имеет место при более чем одной недели, переключение на работу реактора непрерывном режиме. Для непрерывного режима установки времени гидравлического удерживания (HRT) при 24 ч и поддерживать концентрацию сульфата в 4 г / л и COD10 г / л.
      Примечание: Со временем потребление сульфата должно быть быстрее.

    4. серопонижающих активность тест

    1. До этого теста убедитесь, что биореактор при непрерывном режиме представляет менее 10% вариации в концентрации сульфата оставшихся.
    2. В любой день, остановить реактор после цикла и поведения шаге HRT 2.4. На шаге 2.4.3 использовать концентрацию ХПК 10 г / л.
    3. После того, как биореактор подается, занимает от 5 до 7 мл образцы жидкости и выполнения анализа по ХПК, сульфат, сульфид (этап 3.1) и рН каждый час. Запишите объем газа.
    4. Рассчитайте серопонижающих деятельность в соответствии с литературой 14.

      Уравнение 1

    SRA = серопонижающих деятельность (мг ХПК H 2 S) / gVSS * d

    м Н 2 2 S

    VSS = летучих Концентрация взвешенных твердых частиц

    т = время (d или час)

    1. Сделайте соответствующие графики, которые показывают процент сульфата потребления в зависимости от концентрации сульфида в течение долгого времени в мг / л. Сделайте графики, которые показывают процент потребления ХПК с течением времени. Сделайте графики, которые показывают изменение рН в течение долгого времени.

    5. трихлорэтилен (ТХЭ) Тест Снижение

    1. До этого теста убедитесь, что биореактор работает под непрерывном режиме и представляет менее 10% вариации в концентрации сульфата оставшихся. Не начать этот тест, если Сульфатредукция в биореакторе составляет менее 90%.
    2. Подготовка исходного раствора трихлорэтилен (ТХЭ) с учетом, что конечная концентрация указанного соединения в жидкой фазе биореактора должна быть 300 мкм. Рассмотрим partitioniнг соединения в свободном пространстве с помощью безразмерная константа закона Генри (Н ~) для ТВК в 34 ° C. H'at 34 ° С в течение ТВК является 0,4722.
      Уравнение 2
      Внимание: Подготовьте решение в fumehood и носить перчатки и защитные очки.
      1. Например, для 5000 мкМ раствора, а затем рассчитать, как:
        Уравнение 3
        ТВК газовой фазы концентрация = (0,4722) * (5000) = 2,139 мкм. Включить эту концентрацию в подготовке исходного раствора, так как это количество ТХЭ будет в свободном пространстве.
        Затем в жидкости (воды) из маточного раствора, фактическую концентрацию ТВК будет: 5000 + 2139 = 7,139 мкМ. Плотность ТВК = 1,43 г / мл. Преобразование 7139 мкм до Mg, а затем с помощью плотности TCE рассчитать объем TCE для исходного раствора.
        Примечание: концентрация исходного раствора ТВК мау быть ниже, чем 5000 мкм, т.е., 3000 или 1000 мкМ, это зависит от того, насколько объем этого раствора могут быть доставлены в биореактор по его объему жидкой фазы.
    3. Подготовка стандартных кривых в газовый хроматограф для TCE, цис -1,2-дихлорэтилен транс -1,2-дихлорэтилена, винилхлорид и этилен. Подготовьте СНГ -1,2-дихлорэтилена и транс -1,2-дихлорэтана стандартные кривые из маточного раствора этих соединений, следуя той же процедуре, описанной в пункте 5.2 для ТХЭ маточного раствора. Подготовка стандартных кривых для винилхлорида и этилена путем разбавления концентрацию каждого газа из стандартов (газовые баллоны).
      1. Подготовка стандартных кривых этих соединений в диапазоне от 20 до 300 мкм. Используйте методом, описанным Герреро-Барахас и др. (2011) 15 для анализа этих соединений в газовый хроматограф.
        Внимание: Подготовка них стоятARD решения в fumehood и носить перчатки и защитные очки.
    4. В любой день, остановить реактор после цикла и поведения шаге HRT 2.4. На шаге 2.4.3 использовать концентрацию ХПК 10 г / л.
    5. После того, как биореактор подается, добавить непосредственно к TCE жидкости в биореакторе с маточного раствора, полученного в 5.2, конечная концентрация ТХЭ в жидкой фазе биореактора должна быть 300 мкм. Установите HRT до 12 часов.
      1. В конце одного цикла ЗГТ взять образцы жидкости (500 до 1000 мкл) и проводить анализ для определения ХПК, сульфат и сульфид (шаги 3.1.1, 3.1.2 и 3.1.3). Брать пробы свободного пространства (от 100 до 250 мкл) и проводят анализ для TCE, цис -1,2-дихлорэтилен транс -1,2-дихлорэтилена, винилхлорид и этилен в газовой хроматографии.
    6. Повторите шаг 2.4. На шаге 2.4.3 использовать концентрацию ХПК 10 г / л.
    7. Не повторять тест сокращения ТВК, пока биореактор не представляет более 90% снижение сульфат и менее 10% вариации в обоих, сульфат и сульфат снижение оставшихся в биореактор.
    8. Повторите 5.4, 5.5 и 5.6 два или три раза больше.
    9. Возьмем отложений образцы (0,5 г) вести идентификацию микроорганизмов только после испытания уменьшение TCE завершена. Сделайте это после того, как 2 или 3 испытаний по сокращению ТВК.

    6. серопонижающих активность тест после сокращения ТВК эксперимента

    1. Повторите шаг 4 полностью.

    7. Идентификация микроорганизмов

    1. Отбирают образцы шлама приблизительно 0,5 г каждого и проводить экстракцию РНК общую согласно стандартному методу 12.
    2. Амплификации гена 16S рРНК с обратной транскрипцией и проводить полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на один шаг 12.
    3. Дизайн праймеров для амплификации или использовать в качестве первоначального подхода те предложенные в литературе 11. Следуйте amplifПроцедура ication предложил в литературе 12.
    4. Построить библиотеки 16S рРНК. ПЦР ампликонов могут быть клонированы с помощью клонирования-комплект 11. Как правило, 10 колоний из каждой пластины (каждая представляет одну колонию ПЦР-продукт) может быть клонирован. Подготовка плазмидной ДНК для секвенирования в соответствии с процедурой, предложенной в литературе 12.
    5. Провести секвенирование фрагментов. Повторное амплификации примерно 1400 п.о. внешних продуктов ПЦР с протоколом для ПЦР-амплификации описано ранее (шаг 7,4) и клона в соответствии с процедурой, предложенной в литературе 12. Изолировать рекомбинантную плазмиду из E. палочки колонии как предложено в литературе 12. Есть провести частичную процедуру для секвенирования с универсальными праймерами М13 12.
    6. Провести анализ последовательности. Совместите нуклеотидные последовательности, используя Clustal X и вручную настроить в текстовом редакторе. Выполните BLAST поисках databas NCBIе. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) 12.
    7. Получение нуклеотидной последовательности номерами доступа. Депозит нуклеотидные последовательности клонов, идентифицированных в базе данных EMBL нуклеотидной последовательности (Gen-банк / EMBL / DDBJ) под соответствующими номерами доступа (т.е. JQ713915eJQ713925 для последовательностей из ампликонов) 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Типичный поведение снижению сульфата в биореакторе показано на рисунке 5. Важно отметить, что в течение первых недель снижения сульфата операции будет медленным. Однако медленно, потребление более 90% сульфата с течением времени означает, что посевной разработке микробное сообщество, способного снижать сульфат и, следовательно, обогащенного сульфат бактерий. В разные периоды на рисунке показывают, что сульфат снижение увеличивается скорость его в течение долгого времени. В начале, партия приняла 20 дней для сульфата быть уменьшена (Период I), то его скорость восстановления увеличивается, и он взял приблизительно 10 дней для уменьшения кормили сульфат (период II). Период III представлены меньше вариаций в сульфатредукции и это было достигнуто в среднем 10 дней, как это показано на рисунке 5. После этого периода, сокращение сульфата занимает в среднем 4 дня (период IV) и в период V 4000 мг / л сульфатабыли израсходованы менее чем 24 ч. Спектакль в биореакторе был установлен при непрерывном режиме после 200 дней в HRT 24 ч.

Рисунок 5
Рисунок 5. Сульфат (SO 4 2-) концентрация в течение долгого времени в течение сульфидогенных образования осадка в биореакторе. Сплошная линия относится к влиятельных сульфат концентрации. Площади см сульфата концентрации в сточных водах. Эта цифра была взята из Герреро Барахас и др. (2014) 12 с соответствующего разрешения авторского права. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Представительства хорошие результаты на сульфатредукции, концентрации сульфида, потребление ХПК и вариаций рН с течением времени являются шсамостоятельно в 6А. Эти результаты были получены в экспериментах, проведенных после того, как биореактор при непрерывном режиме почти на год. В этот момент микробного сообщества была разработана в биореакторе и нагара была образована как видно на фиг.4В. На фиг.6А видно, что сульфат сократилось в 4 ч и сульфид достигла максимальной концентрации 1 200 ± 30 мг / л и 188 ± 50 мг ХПК-H 2 S / г VSS * д была сульфат снижения активности. Стоит отметить, что концентрация сульфида получены в биореакторе считается высоким и токсичными для микроорганизмов, и в этом случае биореактор не переставал сульфат восстановительной активностью.

Рисунок 6
6. Выполнение биореакторе до (а) и после (б) TCE того. Сульфат (SO 4 2-) (◇), сульфид(H 2 S) (•). Данные, представленные являются среднее и стандартное отклонение п = 3. Эта цифра была взята из Герреро Барахас и др. (2014) 12 с соответствующего разрешения авторского права. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Для эксперимента, в котором шлам был испытан на способность снизить TCE, полученные результаты приведены в таблице 1. Сульфат снижения активности, полученной была несколько ниже, чем полученный перед TCE того и примерно 80% от TCE был уменьшен до этилен (см таблицу 1). Эти результаты должны быть ожидаемый в зависимости от времени, в котором реактор был, работающего под серопонижающих условиях. Маловероятно, что снижение ТВК происходит, если осадка принимается, когда реактор работает в период I или II (рисунок 5

Параметр Значение во время испытания восстановительной ТВК
Процент SO 4 2- удаления (%) 98 (± 0,06)
Сульфид (H 2 S) концентрация (мг / л) 971 (± 72)
Процент конверсии SO 4 2- с H 2 S (%) 68 (± 2)
Процент удаления ХПК (%) 93 (± 0,1)
Диапазон рН 7.1 - 7.7
Добыча газа (мл / г) 200 (± 55)
Серопонижающих деятельность (мг ХПК-Н 2 S / г VSS * г) 161 (± 7)
* ТХЭ конечная концентрация (мкМ) 77 (± 8) Концентрация винилхлорида (мкМ) 16 (± 0,3)
Концентрация этен (мкМ) 202 (± 81)
Процент удаления ТВК (%) 74,3 (± 14)

. Таблица 1. Результаты по производительности в сульфидогенных шлама в процессе эксперимента ТВК биодеградации Эта таблица была изменена с Герреро Барахас и др (2014) * ТВК начальная концентрация:.. 300 мкм. Представленные данные среднее значение и стандартное отклонение п = 3.

После проверки сокращения ТВК, результаты восстановления сульфата, концентрации сульфида, потребление ХПК и вариаций рН с течением времени, показаны на рис 6В. Эти результаты показывают, что сульфат была снижена в 5 ч и концентрацию сульфида достиг 1,400 ± 35 мг / л, а также сульфатвосстанавливающими активность248 ± 22 мг ХПК-Н 2 S / г VSS * d. Немного выше серопонижающих деятельность - по сравнению с 188 ± 50 мг ХПК-Н 2 S / г VSS * D - означает, что микробного сообщества не подавляется ТВК.

Результаты на микроорганизмы, определенных в шламе, используемого в этом протоколе представлены в таблице 2. Серопонижающих бактерии, бактерии и ферментации бактерии дегалогенирующего были определены в шламе, разработанной с использованием этого протокола. Результаты не удивительно, потому что биореактор работает в течение одного года в соответствии с серопонижающих условия и несколько дней с ТВК. Роды бактерий, таких как Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfitobacterium, Clostridium, Dehalobacte г и Sulfurospirillum были связаны с сульфатредукции и биодеградации хлорированных соединений. Кроме того, идентификация этих микроорганизмов в шламеподтверждает, что протокол был успешным в разработке сульфидогенных ила, которые могут быть использованы для одновременного удаления сульфата и трихлорэтилен, который является одним из наиболее токсичных соединений хлора.

Бактерии сообщили Высокая сходство макс идент
ги | 386685641 некультурных Desulfovibrio зр. Desulfovibrio desulfuricans 96%
ги | 386685640 некультурных Desulfomicrobium зр. Desulfomicrobium norvegicum 99%
ги | 386685639 некультурных Desulfomicrobium зр. Desulfomicrobium baculatum 99%
ги | 386685638 некультурных Desulfomicrobium зр. Desulfomicrobium гипо-geium 99%
ги | 386685637 некультурных Desulfotomaculum зр. Desulfotomaculum acetoxidans 99%
ги | 386685636 некультурных Clostridium Sp. Clostridium celerecrescens 99%
ги | 386685635 некультурных Desulfovibrio зр. Desulfovibrio halophilus 98%
ги | 386685634 некультурных Dehalobacter зр. Dehalobacter restrictus 99%
ги | 386685633 некультурных Desulfitobacterium зр. Desulfitobacterium hafniense 99%
ги | 386685632 некультурных Sulfurospirillum зр. Sulfurospirillum multivorans 97%
ги | 386685631 некультурных Sulfurospirillum зр. Sulfurospirillum halorespirans 97%

Таблица 2. Консорциум определены в иле биореактора и его сходство с другими бактериями Макс идент:. Максимальная идентичности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Есть несколько применения sulfidogenesis в окружающей биотехнологии, один из наиболее часто используемых приложений метаболизма серопонижающих бактерий в консорциумы с брожения бактерий в очистке сточных вод. UASB реакторы являются одними из основных инженерных подходов к промышленной очистки сточных вод с высокой концентрацией сульфата. В этой работе мы представляем протокол для получения сульфидогенных шлама из морских отложений в реакторе UASB. Критические шаги в протоколе, чтобы получить сульфидогенных шлама из морских отложений являются: (1) содействие homogeny образца осадка быть размещены в реакторе, (2) подачи правильный концентрацию сульфата и летучих жирных кислот (COD / SO 4 2-) коэффициент, (3) анализ сульфат, сульфид, ХПК и рН периодически, (4) освежающие базальной среды, которая содержит следовых количеств металлов и витамины каждый раз, когда запускается пакетный. Это важно учитывать, что развитие sludgе сильно зависит от микробного сообщества исходного образца и справа массовых балансов (сульфат и ХПК). Хотя это занимает время для сульфатвосстанавливающими деятельность по разработке, биореактор требует постоянного контроля, чтобы избежать утечки, аварии или временную нехватку энергии, что может остановить циркуляционного насоса или выключить контроль температуры. Особое внимание должно быть уделено в исполнении анализа сульфида, сульфата и ХПК.

Морские отложения в целом являются естественным источником широкого спектра микроорганизмов; вполне вероятно, что шлам может быть образован с морских отложений, взятых из различных глубинах. В этом протоколе было выбрано для использования гидротермальных морские отложения по двум основным причинам: (1) эти мелкие отверстия расположены близко к стоимости и (2) это тип сайтов, более богатые сульфидами, что является свидетельством восстановления сульфатов и Поэтому, в присутствии сульфата бактерий. Если что-нибудь, принимая sedimenTS из любого другого места в подводной этаже потребует лишь больше времени для ила развиваться, хотя мы считаем, что это очень маловероятно.

Кроме того, необходимо провести несколько тестов по снижению ТХЭ способствовать присутствие микроорганизмов дегалогенирующего в шламе в дальнейшем определены в соответствии с процедурой, предложенный в этом протоколе или любой другой техники молекулярной биологии. Это важно учитывать, что развитие микроорганизмов дегалогенирующего также зависит от источника ила, хотя литература относится к присутствию такого типа микроорганизмов в нескольких морских отложений по всему миру 7. Сульфат снижения анализ активности рекомендуется после воздействия шлама к токсичным соединением, чтобы оценить жизнеспособность сульфидогенных осадка после напряженного состояния, например, наличие TCE. Если серопонижающих активность ила уменьшается необходимо будет поддерживать это Several недели в пакетном режиме подается сульфатом и ХПК содействовать снова увеличение серопонижающих деятельности. Это может быть сделано, выполнив следующие действия, предложенные в протоколе способствовать sulfidogenesis и рост микроорганизмов. Важно отметить, что была предпринята попытка получить сульфидогенных-дегалогенирование шлама добавлением TCE и сульфат с начала культивирования отложений, но никакой активности (либо сульфата или уменьшения дегалогенирование) и не было отмечено. Предполагалось, что низкое содержание микроорганизмов, присутствующих в ранних стадиях культуры не потерпит TCE (даже при концентрации 20 мкМ), однако, добавление ТХЭ с начала обогащения может всегда быть предпринято с другими осадками.

Хороший результат в этом случае было снижение ТВК в этилен, однако, в зависимости от микроорганизмов, которые могли бы развиваться в иле снижение ТВК может дать в основном dichloroethenes и ВинХлорид ил (ВК). В этом случае полученные для снижения TCE данные были записаны после каждого цикла ГЗТ в биореакторе вместо выборки для ТХЭ и его промежуточных продуктов постоянно в ходе испытания. Это было сделано таким образом, чтобы избежать испарения из хлорированных соединений из-за частого отбора проб. Таким образом, нет графики концентрации ТХЭ с течением времени, чтобы показать, но концентрации в конце каждого эксперимента. Важно, чтобы избежать испарения летучих хлорированных соединений сообщать точные концентрации них и отличить, если изменения могут быть отнесены к снижению биологической вместо потерь. Наличие этилена и отсутствие общих промежуточных TCE, таких как цис -1,2-дихлорэтилена в конечных продуктах после снижения TCE особенно интересно. Это всегда было сообщено, что полное восстановление ТХЭ с этиленом можно проводить только Dehalococcoides SP. и в этом случае эти microorgaмов не были обнаружены среди родов, выявленных в иле. Мы связываем снижение ТВК в cometabolism, которые могут возникнуть в иле среди dehalorespiring, бродильного и сульфата бактерий. Недостатком этого является то, что консорциум он способствует образованию переходных VC, соединения более токсичны, чем ТХЭ, однако, присутствует при относительно низких концентрациях. Это может быть, можно сказать в этой точке, что очень необычно cometabolic деятельность была разработана консорциумом, и что новый путь сокращения ТВК под сульфатвосстанавливающими условия могут быть дополнительно исследованы в присутствии микроорганизмов, выявленных halorespiring в этой работе. С другой стороны, было ранее сообщалось, что дегалогенирующего гены часто обнаруживается в подповерхностных морских отложений, но нет никаких сообщений о TCE биодеградации с подводных отложений в сочетании с серопонижающих условиях, это, с использованием сульфата в качестве альтернативного акцептора электронов.

5,6. Мы рекомендуем комбинации, такие как: ацетат-бутират, пропионат, бутират или-только бутират. Тем не менее, мы не рекомендуем использование лактата, потому что, когда он был использован, мы испытали развитие сульфат бактерий, но накопление ацетата в биореакторе и цель этого метода является получение осадка, который может использовать ацетат. Ацетат накопления является недостатком во многих сульфидогенных реакторов, описанными в литературе. Кроме того, мы не пытались использование спиртов. С другой стороны, мы рекомендуем - при желании - начиная с более низкой концентрациейс сульфата (то есть, 1 г / л) и постепенно увеличивая концентрацию при сохранении соответствующего баланса массы, т.е. правильной концентрации ХПК в биореакторе (ХПК / SO 4 2- отношение). Это не подходит, однако, чтобы начать с более высокими концентрациями сульфата (выше, чем 4 г / л), хотя это может быть увеличена с течением времени вместе с соответствующей ХПК. ХПК / SO 4 2- соотношение может быть в диапазоне от 0,67 до 2,5, чтобы начать, и он может быть изменен после того, как шлам разработаны.

Одним из недостатков этого метода является то, что структура осадка зависит от физических характеристик отложений, используемой и хотя в этом методе шлам образуется разрешено хорошее псевдоожижение в реакторе и формирования биопленки на стекле, мы не можем предсказать, как это реально работает, используя отложения разных местах. Это может быть возможным использовать меньшие реакторы для проведения предварительных испытаний инаблюдать, если это возможно. Если есть намерение работать с осадка в биореакторе, мы не рекомендуем начинать с микрокосмах. Предположение это установить реактор с самого начала, хотя и с меньшим объемом для первой попытки.

Метод, представленный здесь, является существенным в том, что шлам образуется терпит высокие концентрации сульфида, чем другие сульфидогенных шламов, получаемых путем адаптации метаногенных гранулированного ила на sulfidogenesis. Метод способствует образованию шлама с консорциумом, который включает серопонижающих бактерии и бактерии брожения и легко адаптирован к биологическому разложению токсичных соединений. В этом протоколе мы использовали TCE в качестве примера токсичного соединения, которое имеет только биодеградации метаногенных условиях в UASB реакторов. Например, если цель реактора биотрансформировать хлорированные растворители, было бы полезно, чтобы постепенно увеличивать концентрации растворителя, т.е., более высокой TCКонцентрация Е в тестах, в то время как уменьшение концентрации сульфата, чтобы стимулировать дегалогенирования над сульфатом сокращения. Хотя, в соответствии с результатами, полученными в этой работе, мы по-прежнему считаем, что сульфат не могут быть полностью удалены из культуры, если серопонижающих условия желательно. Кроме того, сульфат восстановительных условиях должна быть сохранена, так как некоторые dehalorespirers также сульфат редукторы. Шлам генерируется при условиях, описанных в этом протоколе может быть в конечном итоге используется для удаления одновременно ХПК, сульфат, хлорированные токсичных соединений и тяжелых металлов. Тяжелые металлы могут осаждаться с сульфидом производимого осадка.

Наконец, сульфидогенных осадка образована могут быть проверены на: (1) переносимости высоких концентрациях сульфида (например, для осаждения тяжелых металлов), (2) биоразложение других органических загрязнителей, или (3) расход углеводородов, как доноров электронов вместо летучих жирных кислот в фуrther исследовать свои приложения в окружающей биотехнологии. Важно учесть, что после того, как шлам образуется он может быть использован в качестве стартового шлама для инокуляции других реакторах. В этом случае, сульфат восстановительный процесс будет происходить немедленно и таким образом, не будет необходимости ждать год, чтобы полностью управлять биореактор.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
trichloroethylene  sigma Aldrich 251402
cis-1,2-dichlorotehylene sigma Aldrich
trans-1,2-dichloroethylene sigma Aldrich D-62209
vinyl chloride scotty standard supelco 1,000 ppm v/v in nitrogen
ethene scotty standard supelco 99% purity
pump Masterflex Model 7553-75
spectrophotometer any
microcentrifuge any
gas tight syringes  any 100 and 200 microliters
UASB glass reactor any under design
gas chromatograph  any FID detector
capillary column SPB-624 supelco
pH meter any
viton tubing Masterflex
basal medium reagents any
trace metals reagents any
vitamins solution reagents any
sodium sulfate any
volatile fatty acids any
COD determination kit HACH range 0-15,000 mg/L
TOPO-TA cloning kit pCR®4.0  Invitrogen, US
S.N.A.P. TM Miniprep Kit  Invitrogen, UK
Pure link TM Quick Plasmid Miniprep kit Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lens, P., Esposito, M. V. G., Zandvoort, M. Perspectives of sulfate reducing bioreactors in environmental biotechnology. ReViews Environmental Science and Biotechnology. 1 (4), 311-325 (2002).
  2. Omil, F., Lens, P., Hulshoff, P., Lettinga, G. Characterization of biomass from a sulfidogenic, volatile fatty acid-degrading granular sludge reactor. Enzyme and MicrobialTechnology. 20, 229-236 (1997).
  3. Lopes, S. I. C., Wang, X., Capela, M. I., Lens, P. N. L. Sulfate reduction during the acidification of sucrose at pH 5 under thermophilic (55 °C) conditions.II: Effect of sulfide and COD/SO4-2 ratio. Bioresource Technology. 101, 4278-4284 (2010).
  4. Alfonso, P., Prol-Ledesma, R. M., Canet, C., Melgarejo, J. C., Fallick, A. E. Sulfur isotope geochemistry of the submarine hydrothermal coastal vents of Punta Mita, Mexico. Journal of Geochemical Exploration. 78-79, 301-304 (2003).
  5. Valdemarsen, T., Kristensen, E. Degradation of dissolved organic monomers and short chain fatty acids in sandy marine sediment by fermentation and sulfate reduction. Geochimica et Cosmochimica Acta. 74, 1593-1605 (2010).
  6. Quistad, S. D., Valentine, D. L. Anaerobic propane oxidation in marine hydrocarbon seep sediments. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75, 2159-2169 (2011).
  7. Futagami, T., Morono, Y., Terada, T., Kaksonen, A. H., Inagaki, F. Dehalogenation activities and distribution of reductive dehalogenase homologous genes in marine subsurface sediments. Applied and Environmental Microbiology. 75 (21), 6905-6909 (2009).
  8. U.S. Environmental Protection Agency. List of priority pollutants. Clean Water Methods. , (2014).
  9. Ozdemir, C., Dursun, S., Karatas, M., Sen, N., Sahinkaya, S. Removal of trichloroethylene (TCE) in upFlow anaerobic sludge blanket reactors (UASB). Biotechnology and Biotechnological Equipment. 21 (1), 107-112 (2007).
  10. Zhang, Y., Wang, X., Hu, M., Li, P. Effect of hydraulic retention time (HRT) on the biodegradation of trichloroethylene wastewater and anaerobic bacterial community in the UASB reactor. Applied Microbiology and Biotechnology. 99, 1977-1987 (2015).
  11. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. , 20th Edn., American Public Health Association. Washington, DC. (1998).
  12. Guerrero-Barajas, C., et al. Enhanced sulfate reduction and trichloroethylene (TCE) biodegradation in a UASB reactor operated with sludge developed from hydrothermal vents sediments: process and microbial ecology. International Biodeterioration and Biodegradation. 94, 182-191 (2014).
  13. Trüper, H. G., Schlegel, H. G. Sulphur metabolism in Thiorhodaceae I. Quantitative measurements on growing cells of Chromatium okenii. Antoine van Leeuwenhoek. 30, 225-238 (1964).
  14. Gallegos-García, M. G. Biological processes of sulfate reduction in biofilms for metals precipitation [Ph D thesis]. , Intituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica. San Luis potosí, Mexico. (2009).
  15. Guerrero-Barajas, C., Garibay-Orijel, C., Rosas-Rocha, L. E. Sulfate reduction and trichloroethylene biodegradation by a marine microbial community from hydrothermal vents sediments. International Biodeterioration and Biodegradation. 65, 116-123 (2011).

Tags

Науки об окружающей среде выпуск 104 сульфидогенных ила гидротермальные жерла осадки морские осадки восходящим потоком анаэробных реакторов ила сульфат бактерий трихлорэтилен восстановительное дехлорирование.
Разработка сульфидогенных шлам из морских отложений и уменьшению трихлорэтилена в одеяло реактора с восходящим потоком анаэробного ила
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guerrero-Barajas, C., Ordaz, A.,More

Guerrero-Barajas, C., Ordaz, A., García-Solares, S. M., Garibay-Orijel, C., Bastida-González, F., Zárate-Segura, P. B. Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor. J. Vis. Exp. (104), e52956, doi:10.3791/52956 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter