Introduction
환경 생명 공학에 가장 중요한 공헌 중 하나는 (접종) 사용 된 슬러지는 황산염 환원 조건 하에서 수행 할 수 있었다있는 생물 반응기의 디자인이었다. 황산 환원 (SR)은 COD, 중금속 및 유기 오염 물질, SR을 오니 (1)의 바람직한 특성을 만드는 사실의 동시 제거에 부가하여 고농도의 황산을 함유 폐수의 처리를 허용한다. 황산에 오염 된 폐수의 예로는 무두질, 종이, 제약 및 화학 제조 산업 (1)에서 왔습니다. 그러나 문헌의 대부분은 메탄 입상 슬러지 sulfidogenesis 2에 적용되었을 때 슬러지를 sulfidogenic을 의미한다. 이러한 조정은 일반적으로 COD / 생물 반응기에서 SO 4 2- 비 조작 및 슬러지의 2,3- 노젠을 억제하는 화학 물질을 첨가함으로써 달성된다. m 긴 시간에 추가AY sulfidogenic 과립의 형성을 필요로 노젠과 황산 감속기 및 황화물의 고농도 슬러지 공차 간의 경쟁은 생물 반응기에 사용 sulfidogenic 슬러지의 적응로부터 획득되는 경우 발생할 수있는 그 주요 문제점 중 일부입니다 주로 메탄 슬러지 조건 황산 환원합니다. 이 작품에서 우리는 상향 류 혐기성 슬러지 블랭킷 반응기 (UASB)에서 열수 통풍구 퇴적물 (푼타 미타, 나야 리트, 멕시코)에서 주로 sulfidogenic 슬러지를 획득하는 절차를 설명, 우리는 시간이 지남에 따라 활동을 감소의 황산을 평가하고 실험을 수행 환원 탈염 소화에의 응용 프로그램을 평가한다. 가 해당 사이트에 의한 특정 장소 (4) 거주 미생물 군집에 의해 전시 된 황산 감소 활동에 황화물의 형성이보고되어 있기 때문에 퇴적물의 위치는 선택되었다.
끊다가 있습니다sulfidogenesis에 메탄 세분화 된 슬러지를 적응을 통해 퇴적물에서이 sulfidogenic 슬러지를 얻는 등의 장점. 이러한 이점 중 일부이다 : (1) (3)이되는 슬러지가 적응 메탄 슬러지 작동 다른 UASB에 비해 황화물의 비교적 높은 농도를 견뎌 (2), 바이오 리액터를 동작하는 과립을 형성 할 필요가없고, 아세테이트 슬러지의 형성을 촉진하는 배지에 포함 된 휘발성 지방산의 혼합물에 사용하는 경우에도 노젠와 기판에 대한 경쟁하지 않는다.
해양 침전물은 황산, 환원 세균 박테리아 발효 세균은 몇 5,6- 물론 탈 할로겐 같은 미생물의 다양한 천연 풀 때문 절차 sulfidogenesis을 촉진 하였다. 이 프로토콜을 이용하여 개발 된 해양 침전물로부터 컨소시엄 유형 황산 환원하므로, 높은 S 효율을 나타낼 수있다 ulfate는 메탄과 황산염 환원 박테리아에 독성으로보고보다 더 높은 농도에서 황화 시간에 활동과 높은 내성을 감소시킨다. 한편, 탈 할로겐 기능도 프로토콜이 여기에서 제안하지만 원래 미생물 군집에 의존 할 수있다 다음으로 퇴적물에 도시되는 가능성이 높다. 이러한 가정은 환원성 탈염은 호흡 또는 cometabolism로 인해서 발생할 수 있다는 사실에 기초하여 수행되는, 해양 미생물 군집 7에서 촉진 될 수있다 두 조건. 슬러지를 얻었다 퇴적물 재배 이들 휘발성 지방산 황산 환원 세균의 여러 균주에 의해 사용되기 때문에 기판으로서 아세트산, 프로피온산, 부티르산의 혼합물을 사용하여 수행 하였다. 이 산은 바다 퇴적물 5,6의 탄소 질 물질에 문학의 여러 보도에 따르면, 자주 해양 퇴적물에서 발견 된 탄소 화합물의 유형입니다.
내용 "> 마지막으로, 전 세계 지하수 등의 물을 몸에서 발견되는 가장 독성 화합물의 일부는 트리클로로 에틸렌 (TCE) 또는 퍼 클로로 에틸렌 (PCE)와 같은 염소계 용제이다. 이들 화합물은 독성뿐만 아니라 인간에 있지만, 또한 미생물로, 여전히 미국 환경 보호국 (EPA)에 의해 우선 순위 오염 물질로 간주 특히 TCE는 8.이 작품에서 우리는에있는 sulfidogenic 슬러지 농도에서 TCE를 감소의 능력을 테스트하는 실험을 제안 메탄 조건 9,10에서 염소 화합물의 생분해에 대해보고 범위. 그것은 염소 화합물의 생분해에 대한 연구의 대부분이 메탄 조건 9,10에서 실시 된 것을 언급 할 가치가있다. 우리는이 프로토콜에 제안 된 TCE와 실험을 것을 고려 슬러지의 잠재적 인 응용의 좋은 예.이 실험의 목적은 전자 것이었다TCE에 슬러지와 활성을 감소 페이트상에서 TCE 효과 내성을 평가할. (1) (2) COD를 제거하고, (3) 분리, 황산 제거 : 염소화 화합물의 생분해에 대한 연구의 대부분은 메탄 조건 하에서 수행되는 것을 고려하면,이 프로토콜은 슬러지의 형성을 동시에하기 위해 사용될 수있다 제안 염소 화합물. 상기 공정은, (외에 황산 COD까지) 조건 하에서 메탄 평가할 수없는 두 가지 조건을 TCE 중금속의 동시 제거에 슬러지를 평가할 수 있었다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
프로토콜의 단계 1. 계획을 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 슬러지의 형성을위한 해양 퇴적물을 수집
- (때문에 높은 황산 감소 활동을 나타낼 수 황화물의 존재에) 열수 통풍구에 가까운 또는 유기 물질의 파편이 검출있는 지역 중 하나 가까이 해저 지역을 확인합니다.
- 이 작업의 목적을 위해, 퇴적물의 약 3 4kg을 가지고 샘플 떨어져 물을 배수. 어두운 비닐 봉지에 샘플을 놓습니다. 냉장이 필요하지 않습니다.
- 그들은 즉시 사용하지 않을 경우는 실험실에서 일단 냉장고에 샘플 가방을 유지. 이 작품, SAMP의 목적레는 사용하기 전에 몇 주 또는 몇 달 동안 냉장고에있을 수 있습니다.
- 퇴적물 샘플 (즉, 1 또는 2 ㎏)의 큰 부분을 가지고 퇴적물 찾을 수있다 탄소 재료의 큰 파편 또는 존재할 수있는 일부 바위에서 제거하기 위해 적절한 메쉬 (0.2 cm)를 사용합니다.
주의 : 이러한 경우에 0.20 cm 직경 (에 0.0767)의 메쉬를 사용 하였다 있지만 시료의 입자 크기에 따라 다른 크기 일 수있다.- 메쉬를 통해 퇴적물을 통과 한 후, 부분이 균일 한 것을 촉진하기 위해 선택한 부분을 섞는다.
- 표준 방법 (11)에 따라 휘발성 부유 물질 (VSS) 내용을 결정하기 위해 분리 된 작은 샘플을 (즉, 2-3g) 가져 가라.
참고 : 단계 1.2-1.4 그림 2를 참조하십시오.
퇴적물 샘플 2. 사진을 그림.(A) 퇴적물 샘플 직후에 촬영된다. (B) 침전물 샘플을 메쉬를 통과 한 후. 휘발성 부유 물질 이전 (VSS) 결정을 계량 촬영 (C) 샘플. 페트리 접시는 멸균 할 필요가 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 생물 반응기 설정까지
- 이 연구의 목적을 위하여, 대안 3 L. 총 작업 볼륨 UASB 유리 반응기를 사용하여, 1 또는 2 L의 유리제 반응기를 사용한다.
- 퇴적물 VSS 내용에 따라 퇴적물의 양을 계산하는 L. 1 VSS 5 g을 얻었다 접종원으로 사용될
- 계산 후의 침전물의 양이 너무 큰 경우, 바이오 리액터의 후 약 25 % 내지 30 % 양 대신 퇴적물에 의해 점유되어야한다고 고려.
- 그 이후 VSS 내용을 기록미생물 군집은 생물 반응기에 충실 할 때 변경됩니다. VSS 콘텐츠는 생물 반응기에서 활성을 감소 황산 계산을 위해 필요하다.
- 생물 반응기의 기초 중간 버퍼 용액의 최종 농도가 게레로 - 바라하스 등의 알에 의해보고 된 유사 있는지 확인하십시오. (2014) 12.
- 퇴적물, 기초 배지, 완충액 및 휘발성 지방산의 최종 부피가 반응기의 최종 작업 볼륨 동일한 지 확인. 기본 배지 제조법 (12)는 미량 금속과 비타민 솔루션에 적합한 농도가 포함되어 있습니다.
- (즉, 2, 3 또는 4 단계 2.4에보고보다 배 더 집중)이 희석 될 때되도록, 그것은 인 사용 반응기의 작동 부피에 대해 적절한 농도 기초 배지 및 완충액 원액을 제조 게레로 - 바라하스 등에 의해보고 된 농도. (2014)12).
주 : 기본 배지 용 원액 그러나 완충액 만 개시까지 필요에 항상 필요하다. 이는이 시간 이후 완충액을 추가 할 필요가 없다. - 1 : 1 COD 비율 2.5 아세테이트, 프로 피오 네이트 및 부티레이트 : 휘발성 지방산의 주식 솔루션을 준비합니다. 아세트산 나트륨은 기본 배지에 포함 된 계산을 위해 고려. 원자로의 마지막 COD 농도는 2.7 G / L 있어야합니다.
주의 : 흄 후드에서이 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션의 준비를 위해 니트릴 장갑과 고글을 착용 할 것. 계정으로도 3에 도시되어있는 휘발성 지방산의 황산 반응의 화학량 걸릴. - 반응기에 황산 이온 (SO 4 2-) 4,000 ㎎ / ℓ의 최종 농도를 제공하도록 적당한 농도의 황산나트륨의 스톡 용액 (SO 4 나 2)을 준비한다. 또한, 일 포함대신 최종 황산만큼 원액에서 추가의 기초 매체에 필요한 황산의 전자 금액 (SO 4 2-)의 농도는 권리입니다.
- 그들 반응기의 바닥에 도달 확인 기본 배지의 일부와 혼합 반응기에 퇴적물을 놓는다.
- 휘발성 지방산 용액 및 황산 용액과 혼합 기초 배지 및 버퍼 용액의 나머지를 추가한다. 휘발성 지방산의 솔루션은 액체에 주입되어 있는지 확인합니다. 참고 : 흄 후드에서이 단계를 실시한다.
- 재순환 펌프에 연결 및 반응기의 파이프 라인을 설정합니다. / 분에서 60 mL의 재순환 유량을 설정한다. 34 ° C의 온도 챔버에서 생물 반응기를 설정합니다. 정기적으로 온도 변화가 있는지 확인 작은 (즉, 34 ± 1.7 ℃로)
- 가스 변위 컬럼에 대한 연결을 설정합니다.
참고 : 단계 2.1-2.5 그림 4를 참조하십시오. </ OL>
그림 VFA (아세테이트, 프로 피오 네이트 및 부티레이트)와 황산 감소 3. 화학 양론. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. UASB 반응기. (A) 초기 시간. (B) 연속 정권 운전 300 일 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
원자로 3. 작동은 미생물의 Sulfidogenesis과 성장을 촉진
참고 : 접종이 V를 소비하는 허용지방산 및 황산 olatile. 이를 위해, 설페이트, 설파이드 및 COD 소비 제 분석을 수행하기 일주일 동안 기다린다.
- 인큐베이션 일주일 COD에 대한 분석을 수행하도록 액체 5~7 ㎖가 샘플을 채취 한 후, 황산과 황화물 함량과 pH를, 13은 표준 방법에 따라 11.
- 메틸렌 블루 (13)는 다음의 방법으로 (670 nm의 파장 (λ)에서) 액체의 분광 분석 설파이드.
- , 25 mL의 메스 플라스크에 (w / w 2 %) 아세트산 아연 용액 5 ㎖를 배치 아세트산 아연 용액에 시료 신속 200 μL를 추가한다.
- N, N - 디메틸 피의 -phenylenediamine 옥살 레이트 2.5를 가하여 (DMP) 용액 (0.2 % w / w 20 % SO H 2 4) 및 철 / w (III), 황산 암모늄 용액 (10 %, 125 μL 2 %의 H 2 SO 4), 메스 플라스크에 25 ㎖의 증류수에 완전히 w. 반응에 30 분을 기다립니다푸른 색이 안정화되는 시간입니다. (13)이 발생합니다.
참고 : 적어도 15 분을 기다립니다,하지만 더 60 분 이상은 분광 광도계의 샘플을 테스트합니다. 분광 광도계의 푸른 최종 솔루션의 판독을 실시한다.
- 표준 방법 (11)에 따라 황산을 분석합니다. 여기서, 혼탁도 방법을 사용하여, 황산 바륨 등의 황산염을 정량화.
- 컨디셔닝 용액 5 ㎖를 배치 (염산은 염산 1 : 1) 25 ㎖의 메스 플라스크에, 이전에 원심 분리 한 시료 1 ㎖ (11,320 × g에서), 증류수로 메스 플라스크의 25 mL의 완성 및 염화 바륨의 1g을 추가합니다.
- 소용돌이 1 분을위한 솔루션을 섞는다. 형성과 420 나노 미터 (11)의 파장 (λ)의 분광 광도계에서 샘플을 읽을 수있는 황산 바륨 4 분 동안 기다립니다.
- 표준 방법 (11)에 따라 COD를 분석합니다. 대안 적으로, COD determina를 사용기 키트.
- COD 결정하기 전에, 결정에 방해가 될 수 나머지 황화물을 제거하기 위해 (11,320 XG에서) 철저하게 샘플을 원심 분리기. 필요한 경우 회 원심 : 처음 즉시 시료와 두번째 복용 후 6 또는 8 시간 기다렸다가 COD 분석을 수행.
- , COD 판정 키트의 반응 바이알에 2 ㎖의 샘플을 추가 바이알을 밀봉하고 교반과 혼합하여 균질화. 다른 반응 바이알에 증류수 2 ㎖를 첨가하여 빈을 제조하고, 혼합물을 균질화시킨다.
- 2 시간 동안 150 ° C에서 소화 반응기에서 튜브를 놓습니다. 튜브를 제거하고 어둠 속에서 냉각 할 수 있습니다. 620 nm의 파장에서 분광 광도계에서 유리 병의 측정 값을 가져 가라.
- 가스 변위 열에서 가스 부피를 얻습니다.
- 메틸렌 블루 (13)는 다음의 방법으로 (670 nm의 파장 (λ)에서) 액체의 분광 분석 설파이드.
- 황산 소비 다른 5-7일까지 때까지 기다립니다. 황산 COD는 소비해야pproximately 전의 85 % 내지 90 %의 새로운 회분식이 개시된다.
- 황산 (및 COD)이 소비되면, 완전히 단계를 반복 2.4. 각 배치에 대한 새로운 매체와 새로운 영양소를 공급한다.
- 반복 3.1 및 3.2 단계를 반복합니다. 이 시점에서 각 배치는 7 10 일 사이에 지속되어야한다.
- 3-4 배치가 완료되면, 단계 2.4를 반복하지만 4g / L로 COD 농도를 증가시킨다.
- 단계를 반복 3.1 단계 3.2.
- 단계를 반복 3.3하지만 6g / L로 COD 농도를 증가시킨다.
- 이 10g / L가 될 때까지 점진적으로 COD 농도를 증가 3.6과 3.6.1를 반복합니다.
참고 : 시간 (D) 대 황산 농도 (㎎ / ℓ)를 제시 그래프를 확인합니다.
- 황산 소비 미만 24 시간에서 80 % 이상이며, 이는 일주일 이상이 발생하면, 연속 식 반응기의 작동을 전환. 연속 모드에 대해 24 시간에서 유압 체류 시간 (HRT)을 설정 및 4g의 / L의 COD와 황산의 농도를 유지10g / L에서.
주 : 시간이 지남에 따라 황산 소비해야한다 빨리.
4. 황산염 활동 테스트 감소
- 이 테스트에 앞서 지속적인 정권에서 생물 반응기가 남아있는 황산 농도 10 % 미만의 변화를 제시해야합니다.
- 주어진 일에, 하나 HRT주기 및 실시 단계 2.4 이후 원자로를 중지합니다. 단계 2.4.3의 경우 10g / L의 COD 농도를 사용합니다.
- 생물 반응기가 공급되면, 액체의 5-7 ml의 샘플을 가지고 COD, 황산염, 황화물 (3.1 단계) 및 pH를 모든 시간 동안 분석을 수행합니다. 생산 된 가스의 부피를 기록한다.
- 문학 (14)에 따라 활동을 감소 황산을 계산합니다.
SRA = 황산 활동을 감소 (mg의 COD-H 2 S) / gVSS * D
M의 H 2 2 S로 표현
VSS = 휘발성 부유 물질 농도
T = 시간 (d 또는 시간)
- ㎎ / ℓ에서 시간이 지남에 황화물의 농도에 비해 황산 소비의 비율을 보여 해당 그래프를 확인합니다. 시간이 지남에 따라 COD 소비의 비율을 보여주는 그래프를 확인합니다. 시간이 지남에 따라 pH가 변화를 보여주는 그래프를 확인합니다.
5. 트리클로로 에틸렌 (TCE) 감소 테스트
- 이 테스트에 앞서 생물 반응기는 연속 정권에서 작업하고 나머지 황산 농도 10 % 미만의 변화를 제시되어 있는지 확인합니다. 생물 반응기에서 황산 감소가 90 % 미만인 경우이 테스트를 시작하지 마십시오.
- 생물 반응기의 액상이 화합물의 최종 농도가 300 μM이어야 고려 트리클로의 스톡 용액 (TCE)을 준비한다. partitioni을 고려34 ° C에 대한 TCE Henry's 법 차원 상수 (H')를 사용하여 헤드 스페이스에 화합물 NG. TCE에 대한 H'at 34 ° C는 0.4722이다.
주의 : fumehood에이 솔루션을 준비하고 장갑과 고글을 착용하십시오.- 예를 들어, 5,000 μm의 주식 솔루션에 대해 다음과 같이 계산한다 :
TCE 기상 농도 = (0.4722) * (5000) = 2,139 μM. TCE의 양이 헤드 스페이스로되기 때문에 원액의 제조에서 이러한 농도를 포함한다.
이어서 원액의 액체 (물)에서, 실제의 TCE 농도가 될 것이다 : 5000 + 2139 = 7139 μM. TCE 밀도 = 1.43 g / ㎖. mg의 7139 μM 변환하고 TCE의 밀도를 이용하여 콘텐츠에 대한 TCE 용액의 부피를 계산.
참고 : TCE 원액 (M)의 농도를바깥보다 낮은 5,000 μM, 즉, 3,000 또는 1,000 μm의 일이이 솔루션의 많은 볼륨의 액상 부피에 따라 생물 반응기에 전달 될 수있다 방법에 따라 달라집니다.
- 예를 들어, 5,000 μm의 주식 솔루션에 대해 다음과 같이 계산한다 :
- , TCE에 대한 가스 크로마토 그램의 표준 곡선을 제조 -1,2- 디클로로 에틸렌, 트랜스 -1,2- 디클로로 에틸렌, 비닐 클로라이드 및 에텐 CIS. TCE 원액 5.2에서 설명 된 것과 동일한 절차를 수행하여, 시스에게 이들 화합물의 스톡 용액으로부터 -1,2- 디클로로 에틸렌 및 트랜스 -1,2- 디클로로 에틸렌 표준 곡선을 준비한다. 표준 (가스통)에서 각 가스의 농도를 희석시켜, 염화 비닐과 에텐의 표준 곡선을 준비한다.
- 20~300 μM의 범위에서 이들 화합물의 표준 곡선을 준비한다. 게레로 - 바라하스 등에 의해보고 된 방법을 사용합니다. (2011) 가스 크로마토 그래프에서 이러한 화합물의 분석 (15).
주의 :이 서 준비ARD fumehood의 솔루션과 장갑과 고글을 착용하십시오.
- 20~300 μM의 범위에서 이들 화합물의 표준 곡선을 준비한다. 게레로 - 바라하스 등에 의해보고 된 방법을 사용합니다. (2011) 가스 크로마토 그래프에서 이러한 화합물의 분석 (15).
- 주어진 일에, 하나 HRT주기 및 실시 단계 2.4 이후 원자로를 중지합니다. 단계 2.4.3의 경우 10g / L의 COD 농도를 사용합니다.
- 생물 반응기가 공급되면 5.2으로 제조 원액에서 생물 반응기에 액체를 직접 TCE 추가 생물 반응기의 액상 TCE 최종 농도가 300 μM이어야한다. 12 시간에 HRT를 설정합니다.
- 한 HRT주기의 끝에서 대구, 황산 황화물의 액체 (500 ~ 1,000 μL) 및 행동 분석의 샘플을 채취 (3.1.1, 3.1.2과 3.1.3 단계). 헤드 스페이스 (100 μL 250)의 샘플을 채취하여 가스 크로마토 그래프에 -1,2- 디클로로 에틸렌, 트랜스 -1,2- 디클로로 에틸렌, 염화 비닐 및 에텐 시스, TCE에 대한 분석을 실시하고 있습니다.
- 단계를 반복 2.4. 단계 2.4.3의 경우 10g / L의 COD 농도를 사용합니다.
- 생물 반응기 9 위에 표시 될 때까지 TCE 감소 테스트를 반복하지 마십시오바이오 리액터에 잔류 0 % 황산 환원 및 10 % 이하의 변화 모두, 황산 및 황산 환원.
- 5.4, 5.5 및 5.6 두 개 또는 세 번 이상 반복합니다.
- 다만 TCE 환원 테스트가 완료되면, 미생물의 식별을 수행하는 퇴적물 샘플 (0.5 g)을 타고. 2 또는 3 TCE 감소 테스트 후이 작업을 수행합니다.
TCE 감소 실험 후 활동 테스트를 감소 6. 황산
- 4 단계를 반복 완전히.
7. 미생물 식별
- 약 0.5g을 각각의 슬러지의 샘플을 가지고 표준 방법 (12)에 따라 RNA 총 추출한다.
- (RT-PCR) 증폭 한 단계 12 중합 효소 연쇄 반응을 역전사 16S rRNA 유전자를 증폭 및 행동.
- 증폭 또는 초기 접근 방식으로 문학 (11)에서 제안하는 사람을 사용하는 프라이머를 디자인합니다. 충전 앰프를 따라확인해 주시죠 절차는 문학 (12)에 제안했다.
- 16S rRNA의 라이브러리를 구축합니다. PCR 증폭 산물을 클로닝 키트 (11)를 이용하여 복제 될 수있다. 일반적으로, 각 플레이트 (한 PCR 산물을 대표하는 각 식민지)에서 10 콜로니를 복제 할 수 있습니다. 문헌 12에 제안 된 방법에 따라 서열 분석을위한 플라스미드 DNA를 준비한다.
- 조각의 염기 서열을 실시한다. 문헌 12에 제안 된 방법에 따라 전술 한 PCR 증폭 용 프로토콜 (단계 7.4), 클론과 PCR 외부 제품의 약 1,400 bp의 재 증폭. E.에서 재조합 플라스미드를 분리 같은 대장균 식민지 문학 (12)에 제안했다. M13 보편적 인 프라이머 (12)와 염기 서열에 대한 부분적인 절차를 수행 마십시오.
- 서열 분석을 실시한다. 그 Clustal X를 사용하여 염기 서열을 맞추고 수동으로 텍스트 편집기에서 조정한다. NCBI에 databas의 BLAST 검색을 수행전자. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) 12.
- 염기 서열의 가입 번호를 얻습니다. 해당 기탁 번호 (즉, 증폭 JQ713915eJQ713925 시퀀스에서) 12 하에서 EMBL 뉴클레오티드 서열 데이터베이스 (젠 뱅크 / EMBL / DDBJ)에서 식별 된 클론의 염기 서열을 침착.
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Representative Results
생물 반응기에서 황산 환원 전형적인 동작은도 5에 도시되어있다. 이것은 동작 황산 환원 첫 주 동안 느린 것이라고 통지하는 것이 중요하다. 그러나 천천히, 시간이 지남에 황산 90 %의 소비는 접종이 황산염 환원 박테리아 풍부한 따라서 황산을 감소시킬 수있는 미생물 지역 사회를 개발하고 있음을 나타냅니다. 도면에서 다른 기간에는 황산 환원 시간이 지남에 그 속도를 증가되었음을 나타낸다. 처음에, 배치 황산 20 일 다음의 감소 속도가 증가하고, (기간 I)를 감소하는 데 걸린, 그리고 공급 황산 (기간 II)를 감소 10 일 정도 걸렸다. 기간 III 황산염 환원 적은 변동을 제시하고는도 5에서 알 수 있듯이이 10 일의 평균에 달성되었다.이 기간 후, 황산 환원 4 일 (기간 IV)의 평균을 가져다주기 V 4000에서 황산 mg을 / L미만 24 시간에서 소비되었다. 생물 반응기의 성능은 24 시간의 HRT 200 일 후 연속 모드로 설정되었다.
생물 반응기에서 sulfidogenic 슬러지 형성하는 동안 시간이 지남에 따라 그림 5. 황산 (SO 4 2-) 농도가. 연속 선은 황산 농도를 유입을 의미한다. 사각형 유출 물에 황산 농도를 참조하십시오. 이 그림은 게레로 - 바라하스 등의 알에서 촬영되었습니다. (2014) (12)를 해당 저작권 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시간이 지남에 황산 감소, 황화물의 농도, COD 소비와 산도의 변화에 대표 좋은 결과는 SH 있습니다그림 6a에 자신의. 이러한 결과는 거의 생물 반응기 년 연속 정권이었다 회씩 실험 얻었다. 이때 미생물 커뮤니티 생물 반응기에서 개발하고, 그것을도 4b에서 알 수있는 바와 같이 검은 슬러지 형성 하였다. 도 6a에 해당 황산 4 시간으로 감소되었고, 황화 최대 1,200 ± 30 ㎎ / ℓ의 농도로 188 ± 50 mg의 COD-H 2 S / g VSS의 * d를 황산 활성을 감소시켰다 도달 알 수있다. 이는 바이오 리액터에서 얻어진 황화 농도가 미생물에 높은 독성으로 간주되는 것을 언급 할 가치가 있고,이 경우에서 생물 반응기는 활성을 감소시키는 황산을 중단하지 않았다.
생물 반응기의 그림 6. 성능 (A) 이전과 TCE 추가 (B) 후. 황산 (SO 4 2-) (◇), 황화물(H 2 S) (•). 제시된 데이터는 N = 3의 평균치와 표준 편차이다. 이 그림은 게레로 - 바라하스 등의 알에서 촬영되었습니다. (2014) (12)를 해당 저작권 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
슬러지 TCE 감소 능력 테스트시킨 실험에서는 얻어진 결과를 표 1에 나타낸다. 얻어진 환원 작용 황산 TCE 첨가 전의 및 TCE의 약 80 %로 감소 하였다보다 약간 낮았다 에텐 (표 1 참조). 이들 결과는 반응기 황산 환원 조건 하에서 작동되었다되는 시간에 따른 예상한다. 이는 슬러지가 취해진 경우 TCE 환원 반응기 기간 I 또는 II에서 동작 할 때 (도 5 참조 발생 가능성은
| 매개 변수 | TCE 환원 테스트 중에 값 | ||
| SO 4 2- 제거 (%)의 백분율 | 98 (0.06 ±) | ||
| 황하 물 (H 2 S) 농도 (㎎ / ℓ) | 971 (± 72) | ||
| H에 SO 4 2- 전환 비율 2 S (%) | 68 (± 2) | ||
| COD 제거의 백분율 (%) | 93 (0.1 ±) | ||
| pH 범위 | 7.1-7.7 | ||
| 가스 생산 (㎖ / D) | 200 (± 55) | ||
| 황산 감소 활동 (mg의 COD-H 2 S / G의 VSS의 *의 D) | 161 (± 7) | ||
| * TCE 최종 농도 (μM) | 77 (± 8) | 비닐 클로라이드의 농도 (μM) | 16 (0.3 ±) |
| 에텐 농도 (μM) | 202 (± 81) | ||
| TCE 제거의 백분율 (%) | 74.3 (± 14) |
. 표 TCE 생분해 실험 중 sulfidogenic 슬러지의 성능 1. 결과는이 테이블은 게레로 - 바라하스 등의 알에서 수정 된 (2014) * TCE 초기 농도 :.. 300 μM. 제시된 데이터는 평균 및 N = (3)의 표준 편차이다.
TCE 환원 시험 후, 황산 환원, 황화물 농도, COD 소비와 시간 경과의 pH 변화에 대한 결과를도 6b에 나타낸다. 이러한 결과는 황산 5 시간으로 감소시키고 황화물 농도의 활성을 감소시키는 황산과 함께, 1400 ± 35 밀리그램 / L에 도달 보여248 ± 22 mg의 COD-H 2 S / G VSS의 * d를. 약간 더 높은 황산 감소 활동 - 188 ± 50 mg의 COD-H 2 S / G의 VSS의 * d를 비교는 - 미생물 군집이 TCE에 의해 저해되지 않았 음을 나타냅니다.
이 프로토콜에서 사용되는 슬러지에서 식별 된 미생물에 대한 결과는 환원 세균 박테리아 발효 세균 및 탈 할로겐이 프로토콜을 이용하여 개발 된 슬러지에서 확인 된 표 2. 황산염에 제시되어있다. 생물 반응기는 TCE와 조건 며칠을 감소 황산에서 일년 동안 운영 되었기 때문에 결과는 놀라운 일이 아니다. 이러한 Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfitobacterium, 클로스 트리 디움, Dehalobacte R과 Sulfurospirillum 박테리아의 장군은 황산 감소와 염소 화합물의 생분해에 관련되어있다. 또한, 슬러지의 이러한 미생물의 동정프로토콜은 가장 독성 염소화 화합물의 하나 인 황산과 트리클로로 에틸렌의 동시 제거에 사용될 수있다 sulfidogenic 슬러지 개발에 성공했는지 확인한다.
| 박테리아보고 | 높은 유사성 | 최대 답하라 |
| GI | 386,685,641 교양 Desulfovibrio SP에. | Desulfovibrio의 desulfuricans | 96 % |
| GI | 386,685,640 교양 Desulfomicrobium SP에. | Desulfomicrobium의 norvegicum | 99 % |
| GI | 386,685,639 교양 Desulfomicrobium SP에. | Desulfomicrobium의 baculatum | 99 % |
| GI | 386,685,638 교양 Desulfomicrobium SP에. | Desulfomicrobium 저자geium | 99 % |
| GI | 386,685,637 교양 Desulfotomaculum SP에. | Desulfotomaculum의 acetoxidans | 99 % |
| GI | 386,685,636 교양 Clostridium 속. | 클로스 트리 디움 celerecrescens | 99 % |
| GI | 386,685,635 교양 Desulfovibrio SP에. | Desulfovibrio의 halophilus | 98 % |
| GI | 386,685,634 교양 Dehalobacter SP에. | Dehalobacter restrictus | 99 % |
| GI | 386,685,633 교양 Desulfitobacterium SP에. | Desulfitobacterium의 hafniense | 99 % |
| GI | 386,685,632 교양 Sulfurospirillum SP에. | Sulfurospirillum의 multivorans | 97 % |
| GI | 386,685,631 교양 Sulfurospirillum SP에. | Sulfurospirillum의 halorespirans | 97 % |
. 최대의 정체성 : 표 2. 컨소시엄은 생물 반응기의 슬러지와 다른 세균에 최대 행선지의 유사성에서 확인.
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Discussion
환경 생명 공학 sulfidogenesis의 여러 응용 프로그램, 박테리아를 발효하는 폐수 처리에와 컨소시엄에서 황산염 환원 박테리아의 대사 중 가장 많이 사용되는 응용 프로그램 중 하나가 있습니다. UASB 반응기는 높은 황산 농도와 산업 폐수 처리의 주요 설계 방식 중입니다. 본 연구에서 우리는 UASB 반응기에서 해양 침전물로부터 sulfidogenic 슬러지를 얻는 프로토콜을 제시한다. 해양 침전물로부터 sulfidogenic 슬러지를 얻는 프로토콜 내의 중요한 단계가있다 : (1) 퇴적물 시료 homogeny을 촉진하는 것은 (2) 황산 휘발성 지방산의 오른쪽 농도 (COD 공급, 반응기에 배치 될 / SO 42-) 비율, (3) 분석 황산 설파이드, 주기적하여 pH COD, (4) 및 미량 금속, 비타민 배치를 시작할 때마다 포함 기초 배지를 깨끗이. 그것은 sludg의 개발 것을 고려하는 것이 중요하다전자는 원래 시료의 미생물 군집에 오른쪽 질량 균형 (황산 COD)에 크게 의존한다. 그것은 개발 활동을 감소 황산 시간이 걸립니다 만, 생물 반응기는 재순환 펌프를 중지하거나 온도 제어를 종료 할 수 있습니다 누출, 사고, 또는 에너지의 시간 부족을 방지하기 위해 지속적인 모니터링이 필요합니다. 특별한주의 황화물, 황산염 및 COD의 분석의 성능을 지불해야합니다.
일반적으로 해양 침전물은 미생물의 다양한 천연 공급원이고; 이는 슬러지가 다른 깊이에서 촬영 해양 침전물을 형성 할 수있는 가능성이있다. 이 프로토콜에서는 두 가지 주요 이유 열수 해양 퇴적물을 사용하여 선택되었다 : (1)이 얕은 구멍은 비용과 가까운 위치 (2) 사이트의 이러한 유형은 황산 감소의 표시 인, 황화물에 더 풍부하고 따라서, 황산 환원 세균의 존재. 오히려, sedimen을 복용우리가이 매우 어렵다 생각하지만 해저 바닥의 다른 장소에서 TS는, 슬러지 개발하기위한 더 많은 시간을 필요로 할 것이다.
또한, 추가로이 프로토콜 또는 임의의 다른 분자 생물학 기법에 제시된 절차에 따라 식별 될 슬러지 탈 할로겐 미생물의 존재를 촉진하는 여러 TCE 환원 시험을 실시 할 필요가있다. 문헌 7 세계 여러 주변 바다 퇴적물 미생물이 유형의 존재를 의미한다하더라도 그것은, 탈 할로겐 미생물의 개발도 슬러지의 소스에 의존한다는 것을 고려하는 것이 중요하다. 황산 환원 활성 분석은, 예를 들면, TCE의 존재 스트레스 조건 후 sulfidogenic 슬러지의 생존력을 평가하기 위하여 독성 화합물 슬러지에 노출 된 후 권장된다. 슬러지의 황산 환원 활성이 감소하면 그것이이야 유지할 필요가있을 것이다배치 모드에서 everal 주 다시 황산 감소 활동의 증가를 촉진하기 위해 황산과 COD가 공급. 이는 미생물의 sulfidogenesis과 성장을 촉진하는 프로토콜에 제안 된 단계에 따라 수행 할 수 있습니다. 그것은이 퇴적물 배양 초기부터 TCE 및 황산을 첨가하여 sulfidogenic-탈 할로겐 슬러지를 얻는 시도 된 것을 언급하는 것이 중요하지만, (하나 황산 환원 또는 탈 할로겐) 더 활성 적 관찰되지 않았다. 그것은 (심지어 20 μM 농도에서) TCE를 허용하지 않은 배양의 초기 단계에 존재하는 미생물의 낮은 함량 그러나 농축 시작 이후 TCE의 첨가가 항상 다른 퇴적물으로 시도 될 수 있음을 가정 하였다.
이 경우에 좋은 결과 TCE의 감소는 주로 dichloroethenes 및 VIN 생성됨 슬러지에서 개발 한 미생물 수에 따라, 그러나, 에텐에 TCE의 환원이었다일 클로라이드 (VC). 이 경우 TCE 환원에 대해 획득 된 데이터는 일정 기간 동안 시험 TCE 및 그 중간 제품 용 생물 반응기 대신 샘플링 각 HRT 사이클 후에 기록되었다. 이는 잦은 샘플링 염소화 화합물의 증발을 방지하기 위해 그 방법으로 수행 하였다. 따라서, 표시하는 시간을 통해 TCE 농도의 그래프에는 있지만, 각 실험의 끝에서 농도가 없다. 그것은 그들의 정확한 농도를보고하고 변경 생물학적 환원 대신 손실에 기인 할 수있는 경우를 구별하는 염소화 휘발성 화합물의 증발을 방지하는 것이 중요하다. 에텐의 존재 및 TCE 환원 후의 최종 제품에서의 시스 -1,2- 디클로로 에틸렌 등의 공통 TCE 중간체의 부재가 특히 흥미 롭다. 그것은 항상 에텐의 전체 TCE 환원 만 Dehalococcoides의 SP에 의해 수행 될 수있는 것으로보고되었다. 이 경우이 microorga예방기구는 슬러지에서 확인 된 장군들 사이에서 검출되지 않았다. 우리 dehalorespiring, 발효 및 황산 환원 세균을 사이에 슬러지 생겨 수도 cometabolism에 TCE 환원 때문이다. 이 컨소시엄은 단점이 VC, TCE보다도 독성 화합물의 일시적인 형성을 촉진한다는 것이다, 그러나 현재로서는 비교적 낮은 농도이다. 그것은 매우 이상한 cometabolic 활동이 컨소시엄 및 조건을 감소 황산 아래에 새 TCE 감소 경로가 더이 작품에서 식별 된 halorespiring 미생물의 존재를 조사 할 수 있다는 개발 된이 시점에서 말을 할 수있다. 한편, 이전에 탈 할로겐 유전자 자주 지하 해양 퇴적물에서 검출되는 것으로보고하지만 황산 환원 조건과 결합 해저 퇴적물 TCE 생분해에 대한보고가없는 한,이 대체 전자 수용체로서 황산을 사용한다.
이러한 방법의 한계 중 하나는 슬러지의 구조가 사용 퇴적물의 물리적 특성에 의존하며,이 방법으로 형성된 슬러지 반응기 유리 생물막의 형성의 좋은 유동을 허용하더라도, 우리가 예측할 수 없다는 실제로 다른 위치의 퇴적물을 사용하여 작동합니다. 그것은 예비 시험을 수행하는 더 작은 반응기를 사용하는 것이 가능할 수 있고그것이 가능한 경우 관찰한다. 의도는 생물 반응기에서 슬러지로 작동하는 경우, 우리는 소우주로 시작하지 않는 것이 좋습니다. 제안 비록 첫 번째 시도에 대한 더 작은 부피로, 처음부터 반응기를 설정하는 것이다.
여기에 제시된 방법은 형성된 슬러지 sulfidogenesis에 메탄 입상 슬러지의 적응을 통해 얻은 다른 sulfidogenic 슬러지보다 더 높은 황화수소 농도를 용인 점에서 중요하다. 방법은 황산 환원 세균 및 세균 발효를 포함하고 쉽게 독성 화합물을 생분해 적응되는 컨소시엄 슬러지의 형성을 촉진한다. 이 프로토콜에서 우리는 UASB 반응기에서 메탄 조건에서 생분해 된 독성 화합물의 예로서 TCE를 사용했다. 반응기의 목적은 염소화 용매 biotransform하는 경우 예를 들어, 점진적으로, 즉, 더 높은 TC를 용매 농도를 증가시키기 위해 유용 할 수있다시험에서 E 농도, 황산의 농도를 감소시키면서 것은 황산 환원 위에 탈 할로겐화를 자극. 하지만,이 연구에서 얻은 결과에 따라, 우리는 아직도 황산 환원 조건이 바람직한 경우에, 황산을 완전히 배양 물로부터 제거 할 수 있다고 생각한다. 일부 dehalorespirers 또한 황산 감속기 때문에 또한, 황산염 환원 조건이 유지되어야한다. 이 프로토콜에 설명 된 조건 하에서 생성 된 슬러지는 결국 동시에 COD, 황산, 염소화 독성 화합물 및 중금속을 제거하기 위해 사용될 수있다. 중금속 슬러지 제조 황화 침전있다.
마지막으로, 형성된 sulfidogenic 슬러지에 대해 시험 할 수있다 : 높은 황화물 농도 (예를 들어, 중금속을 석출) (1)의 허용 오차, (2) 다른 유기 오염 물질의 생분해 또는 전자 도너 등의 탄화수소 (3)의 소비 대신 푸 휘발성 지방산rther 환경 생명 공학의 응용 프로그램을 탐구한다. 이는 슬러지가 형성되고, 일단은 다른 반응기에 접종 시드 슬러지로서 사용될 수 있다는 것을 고려하는 것이 중요하다. 이 경우, 황산 환원 처리가 바로 발생하므로, 그것이 완전히 생물 반응기를 작동 해 대기 할 필요가 없을 것이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trichloroethylene | sigma Aldrich | 251402 | |
| cis-1,2-dichlorotehylene | sigma Aldrich | ||
| trans-1,2-dichloroethylene | sigma Aldrich | D-62209 | |
| vinyl chloride scotty standard | supelco | 1,000 ppm v/v in nitrogen | |
| ethene scotty standard | supelco | 99% purity | |
| pump | Masterflex | Model 7553-75 | |
| spectrophotometer | any | ||
| microcentrifuge | any | ||
| gas tight syringes | any | 100 and 200 microliters | |
| UASB glass reactor | any | under design | |
| gas chromatograph | any | FID detector | |
| capillary column SPB-624 | supelco | ||
| pH meter | any | ||
| viton tubing | Masterflex | ||
| basal medium reagents | any | ||
| trace metals reagents | any | ||
| vitamins solution reagents | any | ||
| sodium sulfate | any | ||
| volatile fatty acids | any | ||
| COD determination kit | HACH | range 0-15,000 mg/L | |
| TOPO-TA cloning kit pCR®4.0 | Invitrogen, US | ||
| S.N.A.P. TM Miniprep Kit | Invitrogen, UK | ||
| Pure link TM Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen |
References
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