Introduction
Çevre biyoteknolojisi en önemli katkılardan biri (aşı) kullanılan çamur sülfat indirgeyici koşullar altında gerçekleştirmek mümkün olduğu içinde Biyoreaktörlerin tasarım oldu. Sülfat azalma (SR) COD, ağır metaller ve organik kirletici maddeler, SR çamur 1 bir arzu edilen özellik yapan bir olgu eşzamanlı çıkarılması ek olarak, sülfat yüksek konsantrasyonda içerir atık su akışlarının tedavi edilmesine imkan verir. Sülfat ile kontamine atık bazı örnekler tabakhane, kağıt, ilaç ve kimyasal imalat sanayi 1 geliyor. Bununla birlikte, literatürde en metan zerre çamur sulfidogenesis 2 uyarlanmıştır zaman çamuru sulfidogenic değinmektedir. Bu adaptasyon yaygın COD / biyoreaktörde SO 4 2- oranı manipüle ve çamur 2,3 olarak metanojenler inhibe kimyasallar eklenerek elde edilir. M uzun bir süre ilave olarakay sulfidogenic granüllerin oluşmasını gerektirir metanojenler ve sülfat redüktör ve sülfürün yüksek konsantrasyonlarda çamurun tolerans arasındaki rekabet biyoreaktör kullanılan sulfidogenic çamur uyarlanması elde edilir, eğer ortaya çıkabilecek temel sorunlardan bazıları ağırlıklı olarak metan çamur indirgeme koşulları sülfata. Bu çalışmada, akışlı anaerobik çamur yataklı reaktörde (UASB) hidrotermal delikleri çökelleri (Punta Mita, Nayarit, Meksika) ağırlıklı sulfidogenic çamur elde etmek için prosedürü açıklar, o zaman biz zaman içinde etkinliğini azaltarak onun sülfat değerlendirmek ve bir deney indirgeyici deklorinasyonu üzerinde uygulama değerlendirmek için. O sitede nedeniyle söz konusu yerde 4 yaşayan mikrobiyal topluluğun sergilediği sülfat azaltıcı aktivite sülfidlerin oluşumunu olduğu rapor edilmiştir çünkü sedimanlar yeri seçildi.
Sever varsulfidogenesis için metanojenik taneli çamur adapte üzerinde çökelleri bu sulfidogenic çamur elde al avantajları. Bu avantajlardan bazıları şunlardır: (1) (3) vardır olan çamur adapte metan çamur ile çalışan diğerleri UASB göre sülfid göreceli olarak yüksek konsantrasyonlarda tolere (2), biyoreaktör çalışması için granüller oluşturmak için gerekli değildir, ve asetat tortu oluşumunu teşvik etmek için kültür ortamına dahil uçucu yağ asitlerinin karışımı kullanıldığında bile, metanojenler ile alt-tabaka için bir rekabet.
Deniz Tortular, sülfat, bakteri indirgen bakterileri, fermantasyon ve bakteriler sadece birkaç 5,6 söz burada halojen giderilmesi için gibi mikroorganizmaların çeşitli doğal bir havuz için bu prosedür sulfidogenesis teşvik etmek için takip edildi. Bu protokolü kullanarak deniz çökelleri geliştirilen konsorsiyum tipi sülfat indirgenmesi ve bu nedenle, yüksek s verimliliği gösterebilir ulfate metanojenler ve sülfat indirgen bakteriler için toksik olarak rapor daha yüksek konsantrasyonlarda sülfüre zamanla aktivitesi ve daha yüksek tolerans azaltır. Öte yandan, bu halojen giderilmesi kapasitesi de protokol burada önerilen ancak orijinal mikrobiyal topluluğun bağlı olabilir izleyerek çökelleri gösterilen olasıdır. Bu varsayım indirgeyici deklorinasyonu solunum veya cometabolism yoluyla oluşabilir gerçeğine dayanmaktadır yapılır, deniz mikrobiyal topluluğun 7 terfi edilebilir koşulların her ikisi de. Çamur elde etmek üzere tortulların ekimi, bu uçucu yağ asitleri sülfat indirgen bakteriler çeşitli suşları tarafından kullanıldığı için alt-tabaka olarak asetat, propiyonat ve bütirat karışımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu asitler, deniz çökelleri 5,6 karbonlu malzeme üzerinde literatürde çok sayıda haberlere göre, aynı zamanda sık sık deniz çökelleri bulunan karbon bileşiklerinin türüdür.
içeriği "> Son olarak, dünya çevresinde yer alan ve diğer su organlarında bulunan en zehirli bileşiklerin bazıları trikloroetilen (TCE) ve perkloroetilen (PCE) gibi klorlanmış çözücülerdir. Bu bileşikler, toksik değildir, sadece insan ancak Ayrıca mikroorganizmalar, halen ABD'de Çevre Koruma Ajansı tarafından öncelikli kirletici olarak kabul edilir, özellikle TCE, 8. Bu çalışmada biz vardır sulfidogenic çamur konsantrasyonlarında TCE azaltma kapasitesini test edildiği bir deneme önerdi metanojenik koşullar 9,10 altında klorlu bileşikler biyolojik ayrışma için bildirilen aralık. Bu klorlu bileşiklerin biyodegradasyonu üzerine araştırmanın en metanojenik koşullar 9,10 altında yapılmıştır olduğunu belirtmekte yarar var. Biz bu protokolü önerilen TCE ile deney bir olduğunu düşünün Çamurun potansiyel uygulamalar iyi bir örnektir. Bu deneyin amacı e olduTCE çamur ve aktivitesini azaltarak sülfat TCE etkisi toleransı olarak değerlendirir. (1) (2) COD kaldırmak ve (3) kaldırmak, sülfat kaldırın: klorlu bileşiklerin biyodegradasyonu üzerine araştırmanın en metanojenik şartlarda yapılmasını dikkate alarak, bu protokol bir çamur oluşumu eşzamanlı için kullanılabilir önerir klorlanmış bileşikler. Bir adım daha, (ek sülfat ve KOİ için) metanojenik koşullar altında değerlendirilemez iki koşulu TCE ve ağır metallerin uzaklaştırılması eşzamanlı üzerine çamur değerlendirmek olabilir.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol adımları için 1. Programı rakam. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
1. Çamur Oluşumunda Marine Sedimanlarını toplayın
- (Nedeniyle daha yüksek bir sülfat azaltıcı aktivite gösterebilir sülfidlerin varlığı için) hidrotermal delikleri yakın veya organik madde enkaz saptanabilir bir alana ya bir cana denizaltı alanlarını belirlemek.
- Bu çalışmanın amacı doğrultusunda, tortu yaklaşık 3 veya 4 kg almak ve örnekler kapalı suyu boşaltın. Karanlık plastik torbalara örnekleri yerleştirin. Hiçbir soğutma gereklidir.
- Hemen kullanılacak değilse laboratuarda kez buzdolabında örnekleri ile çanta tutmak. Bu çalışma, samp amacı doğrultusundales kullanmadan önce haftalarca veya aylarca buzdolabında olabilir.
- Tortu numunesi (yani, 1 ya da 2 kg) büyük bir kısmını almak ve tortular bulunabilir karbonlu malzemenin büyük çöp ya da mevcut olabilecek bazı kayaların ortadan kaldırmak için uygun bir elek (0.2 cm) kullanın.
Not: Bu durumda, 0,20 cm çaplı (in 0,0767) içindeki bir kafes kullanılmıştır ama bu numune içinde parçacıkların büyüklüklerine göre farklı boyutta olabilir.- Ağ üzerinden tortu geçtikten sonra, porsiyon homojen olduğunu tanıtmak için seçilen kısmını karıştırın.
- Standart yöntemler 11 takip ederek dalgalı askıda katı madde (VSS) içeriği belirlemek için ayrılmış küçük örnekleri (yani 2 3 g) atın.
Not: adımlara 1.4 1.2 Şekil 2'ye bakınız.
Sediment örneklerinin 2. Fotoğraf rakam.(A) sediment örnekleri hemen sonra çekilen. (B) Tortu örneği örgü geçtikten sonra. Uçucu askıda katı madde öncesinde (VSS) belirlenmesi tartmak için alınan (C) Numune. Petri kabı sterilize edilmesi gerekmez. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
2. Biyoreaktör Kurma
- Bu çalışmanın amacı için, alternatif olarak 3 L'lik bir toplam çalışma hacmi olan bir UASB reaktörü kullanmak, cam, 1 ya da 2 L hacimli cam reaktörü kullanır.
- Tortulların VSS içeriğine göre tortu miktarını hesaplamak L 1 in VSS 5 g aşı olarak kullanılmak üzere
- Hesaplamasından sonra sediment miktarı çok büyükse, biyoreaktör daha sonra yaklaşık% 25 ila% 30 hacmi yerine sedimanlar tarafından işgal edilmesi gerektiğini dikkate alın.
- Bunun beri VSS içeriği kaydedinmikrobiyal topluluk biyoreaktörde zenginleştirilmiş zaman değişecektir. VSS içerik biyoreaktörde aktivitesini azaltarak sülfat hesaplamalar için gereklidir.
- Biyoreaktörde bazal ortam ve tampon çözeltisinin nihai konsantrasyonu, Guerrero Barajas ve arkadaşları tarafından rapor benzer olduğundan emin olun. (2014) 12.
- Sedimanlar, bazal ortamda, tampon çözelti ve uçucu yağ asitlerinin son hacimleri reaktörün nihai çalışma hacmine eşit olduğundan emin olun. Bazal ortam tarifi 12 iz metaller ve vitaminler çözümü için uygun konsantrasyonlarını içermektedir.
- (Örneğin, 2, 3 ya da 4 adım 2.4 bildirilen kat daha fazla konsantre edilir) bu sulandırıldığında sağlamak için, bunun kullanılan reaktörün çalışma hacmi için uygun bir konsantrasyonda bazal ortam ve tampon çözeltisinin bir stok solüsyonu hazırlayın Guerrero-Barajas'ın ve arkadaşları tarafından rapor edilen konsantrasyonda. (2014)12).
Not: bazal ortam için stok solüsyonu, ancak tampon çözelti sadece açılışta gereklidir, her zaman gereklidir. Bu saatten sonra tampon çözeltisi eklemek gerekli değildir. - 1: 1 oranında bir 2,5 COD asetat, propionat ve butirat: uçucu bir yağ asitlerinin bir stok çözelti hazırlayın. Sodyum asetat bazal ortamda dahil hesaplamalar için dikkate alın. Reaktör içinde nihai COD yoğunluğu 2,7 g / L olmalıdır.
Dikkat: Davlumbaz bu çözüm hazırlayın. Bu çözümün hazırlanması için nitril eldiven ve gözlük takın. Dikkate Şekil 3 'de gösterilmiştir, uçucu yağ asitleriyle sülfat reaksiyonların stokiyometrisi al. - Reaktöre sülfat iyonu (SO 4 2-) 4.000 mg / L'lik bir son konsantrasyon sağlamak için uygun bir konsantrasyonda sodyum sülfat bir stok çözeltisi (SO 4 Na 2) hazırlayın. Alternatif olarak, inci içerirnihai yerine sülfat sürece stok çözeltisinden eklemeden bazal ortam içinde gerekli sülfat e miktarı (SO 4 2-) konsantrasyonu doğru.
- Bu reaktörün alt ulaşmak emin olmak için taban ortamının bir kısmı ile karıştırılır reaktörde tortu yerleştirin.
- Uçucu yağ asitleri çözeltisi ve sülfat çözeltisi ile karıştırılır bazal ortam ve tampon çözeltisinin geri kalanı ekleyin. Uçucu yağ asitlerinin çözeltisi sıvı içine dökülmüş olduğundan emin olun. Not: Davlumbaz bu adımı gerçekleştirin.
- Geri dönüşüm pompasına bağlantıları ve reaktörün hatları ayarlayın. / Dak 60 ml geri dönüşüm akış hızını ayarlayın. 34 ° C 'de bir temperatürdeki gözde biyoreaktör ayarlayın. Düzenli sıcaklık değişimleri olup olmadığını kontrol edin, küçük (yani, 34 ± 1.7 ° C)
- Gaz değiştirme kolonuna bağlantılarını ayarlayın.
Not: adımlara 2.5 2.1 Şekil 4'e bakınız. </ ol>
Şekil VFA (asetat, propiyonat ve bütirat) ile sülfat indirgenmesi 3. Stokiometri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. UASB reaktörü. (A) İlk kez. (B) Sürekli rejim operasyonu 300 gün sonra. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Reaktör 3. Operasyon Mikroorganizmaların Sulfidogenesis ve Büyüme Destekleme
Not: inokulum v tüketmek için izinyağ asitleri ve sülfat olatile. Bu amaçla, sülfat, sülfit ve COD tüketim için, ilk analiz gerçekleştirmek için bir hafta boyunca bekleyin.
- Inkübasyon bir hafta KOİ analizi yapmak için sıvı 5 ila 7 ml örnek almak sonra, sülfat ve sülfür içeriği ve pH, 13 standart yöntemler 11 aşağıdaki.
- Metilen mavisi yöntemi 13 izleyerek (670 nm dalga (λ) at) sıvı spektrofotometrik olarak sülfür analiz edin.
- 25 ml'lik bir volumetrik şişe içine (ağ / ağ% 2), bir çinko asetat çözeltisi 5 ml yerleştirin çinko asetat çözeltisine numunenin hızlı bir şekilde 200 ul ekle.
- Bir N, N'-dimetil-p -fenilendiamin oksalat 2,5 ml ilave edilir (DMP) çözeltisi (% 0.2 ağ / ağ 20% H 2 4) ve demir / w (III), amonyum sülfat çözeltisi (10%, 125 ul % 2 H 2 SO 4) ve volümetrik bir şişede 25 mi damıtılmış su ile birlikte w. Reaksiyon için 30 dakika bekleyinmavi renk stabilize edildiği zaman. 13 oluşmasına.
Not: En az 15 dakika bekleyin, ama en fazla 60 dk spektrofotometre örneklerini test etmek için. Spektrofotometre mavi nihai çözümün okuma yürütün.
- Standart yöntemlere göre 11 sülfat analiz edin. Burada, bir türbidimetrik yöntemi kullanarak baryum sülfat gibi sülfat ölçmek.
- Bir iyileştirme çözeltisi 5 ml yerleştirin (hidroklorik asit HCI 1: 1) 25 ml volümetrik bir şişede, daha önceden santrifüj numune 1 ml (11.320 x g), distile su ile volümetrik şişeye 25 ml tam ekleme ve baryum klorür 1 g ekleyin.
- Bir girdabın içinde 1 dakika için çözüm karıştırın. Formu ve 420 nm dalga boyunda 11 (λ) olarak spektrofotometre numune okumak için baryum sülfat için 4 dakika bekleyin.
- Standart yöntemlere göre 11 COD analiz edin. Seçenek olarak ise, bir COD Determina kullanımıtion kiti.
- COD belirlenmesinden önce, belirlenmesi uğratabilecek kalan sülfür kaldırmak için (11.320 xg) iyice numuneyi santrifüj. Gerekirse, iki kez santrifüj: İlk kez hemen örnek ve ikinci kez aldıktan sonra 6 veya 8 saat bekleyin ve sonra COD analiz yapmak.
- COD saptama kiti bir reaksiyon şişesine örnek 2 ml ilave edilir şişenin kapatılması ve hafif çalkalama ile karışım homojenleştirin. Başka bir reaksiyon şişesine damıtılmış su 2 ml ekleyerek boş hazırlamak ve karışım homojen hale getirilir.
- 2 saat boyunca 150 ° C 'de sindirim reaktörde şişeleri yerleştirin. Şişeleri çıkarın ve onları karanlıkta soğumasını bekleyin. 620 nm'lik bir dalga boyunda spektrofotometre flakon okumaları al.
- Gaz değiştirme sütunundan gaz hacmini edinin.
- Metilen mavisi yöntemi 13 izleyerek (670 nm dalga (λ) at) sıvı spektrofotometrik olarak sülfür analiz edin.
- Sülfat tüketilen başka bir 5 ila 7 gün öncesine kadar kadar bekleyin. Sülfat ve COD bir tüketilmesi gerekirpproximately% 85 ila% 90 öncesinde yeni bir beslemeli kesikli başlatılır.
- Sülfat (ve COD) tüketilen sonra tamamen adımı tekrarlayın 2.4. Her seri için taze orta ve yeni besinleri sağlar.
- Tekrarlayın 3.1 ve 3.2 adımları tekrarlayın. Bu noktada her parti 7 ila 10 gün arasında sürmelidir.
- 3 ila 4 toplu tamamlandığında, adım 2.4 tekrarlayın fakat 4 g / L KOİ konsantrasyonu artırır.
- Adımı yineleyin 3.1 ve 3.2 adım.
- Adımı tekrarlayın 3.3 ama 6 g / L KOİ konsantrasyonu artırır.
- Bu 10 g / L kadar kademeli COD konsantrasyonunun arttırılması 3.6 ve 3.6.1 tekrarlayın.
Not: Zaman (d) karşı sülfat konsantrasyonu (mg / L) sunar grafik olun.
- Sülfat tüketimi az 24 saat içinde% 80 üzerinde ve bu daha bir hafta oluştuğunda, sürekli moda reaktörün çalışmasını geçin. Sürekli modu için 24 saat sonra, hidrolik bir tutma süresine (HRT) ayarlamak 4 g / L ve COD'deki sülfat konsantrasyonunu korumak10 g / L'de.
Not: Zamanla sülfat tüketimi olmalıdır Daha hızlı.
4. Sülfat Etkinlik Testi Azaltılması
- Bu test öncesinde, sürekli rejim altında biyoreaktör kalan sülfat konsantrasyonunda% 10'dan daha az varyasyon sunmaktadır emin olun.
- Herhangi bir günde, tek HRT döngüsü ve davranış adımı 2.4 sonra reaktör durdurmak. Aşama 2.4.3 için 10 g / L'lik bir konsantrasyon COD kullanın.
- Biyoreaktör beslenir sonra, sıvının 5 7 ml numune almak ve COD, sülfat, sülfit (adım 3.1) ve pH, her saat için analiz gerçekleştirmek. Üretilen gaz hacmini kaydedin.
- Literatürde 14 göre aktivitesini azaltarak sülfat hesaplayın.
SRA = sülfat aktivitesini azaltarak (mg COD-H 2 S) / gVSS * d
m, H 2 2 S olarak ifade edilen
VSS = uçucu askıda katı madde konsantrasyonu
t = zaman (d veya saat)
- Mg / L zamanla sülfit konsantrasyonuna karşı sülfat tüketimi yüzdesini gösterir gelen grafikleri olun. Zamanla KOİ tüketiminin yüzdesini gösterir grafikleri olun. Zamanla pH değişimi gösteren grafikler olun.
5. Trikloroetilen (TCE) Azaltma Testi
- Bu test öncesinde biyoreaktör sürekli rejim altında çalışan ve kalan sülfat konsantrasyonunda% 10'dan daha az varyasyon sunmaktadır olduğundan emin olun. Biyoreaktörde sülfat azalma% 90 daha az ise bu testi başlatmak etmeyin.
- Biyoreaktör sıvı faz içinde bu bileşiğin nihai konsantrasyon 300 uM olmalıdır dikkate alarak trikloroetilen bir stok çözeltisi (TCE) hazırlayın. Partitioni dikkate34 ° C 'de TCE için Henry's Kanunu boyutsuz katsayısına (H') kullanarak, tepe boşluğuna bileşiğin ng. TCE için H'at 34 ° C 0,4722 olan.
Dikkat: fumehood bu çözüm hazırlayın ve eldiven ve gözlük kullanılmalıdır.- Örneğin, bir 5000 mcM stok çözümü için, takip şekilde hesaplamak:
TCE gaz fazı konsantrasyonu = (0,4722) * (5.000) = 2.139 uM. TCE bu miktar üst kısmında olacağı stok çözeltisinin hazırlanması için, bu konsantrasyon içerir.
Ardından stok solüsyonu sıvı (su), gerçek TCE konsantrasyonu olacaktır: 5000 + 2139 = 7139 uM. TCE yoğunluğu = 1.43 g / ml olmuştur. Mg için 7139 mcM dönüştürmek ve daha sonra TCE yoğunluğunu kullanarak stok çözümü için TCE hacmini hesaplamak.
Not: TCE stok çözeltisi m konsantrasyonununay daha düşük 5.000 uM, örneğin, 3000 veya 1000 uM, bu çözeltinin kadar hacmi, sıvı faz hacmine göre biyoreaktöre verilebilir bağlıdır.
- Örneğin, bir 5000 mcM stok çözümü için, takip şekilde hesaplamak:
- , TCE için gaz kromatografisinde standart eğrileri hazırlayın -1,2-dikloroetilen, trans -1,2-dikloroetilen, vinil klorür ve eten sis. TCE stok çözeltisi için 5.2 tarif edilen aynı prosedürü takip ederek, cis bu bileşiklerin bir stok çözeltiden -1,2-dikloroetilen ve trans -1,2-dikloroetilen standart eğrileri hazırlayın. Standartlara (gaz silindirleri) her gaz konsantrasyonu sulandırarak vinil klorür ve eten standart eğrileri hazırlayın.
- 20 ila 300 uM aralığında bu bileşiklerin standart eğrileri hazırlayın. Guerrero-Barajas'ın ve arkadaşları tarafından bildirilen yöntem kullanınız. (2011), gaz kromatografisiyle bu bileşiklerin analizi için 15.
Dikkat: Bu standı hazırlayınard Bir fumehood çözümler ve eldiven ve gözlük kullanılmalıdır.
- 20 ila 300 uM aralığında bu bileşiklerin standart eğrileri hazırlayın. Guerrero-Barajas'ın ve arkadaşları tarafından bildirilen yöntem kullanınız. (2011), gaz kromatografisiyle bu bileşiklerin analizi için 15.
- Herhangi bir günde, tek HRT döngüsü ve davranış adımı 2.4 sonra reaktör durdurmak. Aşama 2.4.3 için 10 g / L'lik bir konsantrasyon COD kullanın.
- Biyoreaktör beslenir sonra, 5.2 hazırlanan bir stok çözeltiden biyoreaktör içinde sıvının doğrudan TCE ekleyin biyoreaktör sıvı faz içinde nihai konsantrasyonu 300 uM TCE olmalıdır. 12 saat için HRT olarak ayarlayın.
- Tek HRT döngüsünün sonunda KOİ, sülfat ve sülfür için sıvı (500 ila 1000 ul) ve davranış analizi örnek almak (3.1.1, 3.1.2 ve 3.1.3 numaralı adımları). Headspace (100 ul 250) örnekleri alın ve gaz kromatografisinde -1,2-dikloroetilen, trans -1,2-dikloroetilen, vinil klorür ve eten sis, TCE için analiz yapmak.
- Adımı yineleyin 2.4. Aşama 2.4.3 için 10 g / L'lik bir konsantrasyon COD kullanın.
- Biyoreaktör 9 üzerinde sunulur kadar herhangi bir TCE azaltma testi tekrarlamak etmeyinBiyoreaktörde kalan% 0 sülfat azalması ve daha az% 10 varyasyonu, hem de, sülfat redüksiyon ve sülfattır.
- 5.4, 5.5 ve 5.6, iki ya da üç kat daha fazla tekrarlayın.
- Sadece bir TCE azaltma testi bittikten sonra mikroorganizmaların tanımlanmasını yapmak için sediment örnekleri (0.5 gr) atın. 2 ya da 3 TCE azaltma testlerinden sonra yapın.
TCE Azaltma Deney sonrasında Etkinlik Testi azaltılması 6. Sülfat
- 4. adımı yineleyin tamamen.
Mikroorganizmaların 7. Kimlik
- Yaklaşık 0.5 g her çamur numuneleri almak ve standart metot 12'ye göre RNA toplam çıkarma yapıyoruz.
- (RT-PCR) amplifikasyonu bir adım 12, polimeraz zincir reaksiyonu, ters transkripsiyon ile birlikte 16S rRNA geni yükseltin ve yürütmek.
- Yükseltmek veya ilk yaklaşım olarak literatürde 11 önerildiği olanları kullanmak için primerler tasarlayın. Amplif izleyinication Prosedür literatürde 12 önerdi.
- 16S rRNA kitaplıkları oluşturmak. PCR amplikonları, bir klonlama-kit 11 kullanılarak klonlanabilir. Tipik haliyle, her plaka (bir PCR ürünü temsil eden her bir koloni) 10 koloni klonlanabilir. Literatürde 12 önerilen prosedüre göre sıralama için plazmid DNA hazırlanması.
- Fragmanlarının sıralama yürütün. Literatürde 12 önerilen prosedüre göre daha önce tarif edilen PCR amplifikasyonu için bir protokol (aşama 7,4) ve bir klon PCR dış ürün yaklaşık 1400 bp yeniden yükseltmek. E. Rekombinant plazmid izole edin olarak E. coli kolonileri literatürde 12 önerdi. M13 evrensel primerler 12 ile sıralama için kısmi işlemi yapmak etmeyin.
- Dizileri analiz yapmak. Clustal X kullanarak nükleotid dizileri hizalayın ve elle metin editörü ayarlayın. NCBI databas BLAST aramaları gerçekleştirmeke. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) 12.
- Nükleotid dizisi üyelik numaralarını edinin. Karşılık gelen erişim numaraları (yani, JQ713915eJQ713925 amplikonlar gelen sekanslar için), 12 altında, EMBL nükleotid dizisi veritabanı (Gen Bankası / EMBL / DDBJ) 'de tanımlanan klonlann nükleotid dizilerini bırakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biyoreaktör içinde sülfat indirgenmesi tipik bir davranış, Şekil 5 'de gösterilmiştir. Bu işlem sülfat indirgenmesi ilk haftalarında yavaş olacak fark etmek önemlidir. Bununla birlikte yavaş zaman sülfat üzerinden% 90 tüketim aşı sülfat indirgen bakteriler zenginleştirilmiş nedenle sülfat azaltılması ve yeteneğine sahip mikrobik topluluk, gelişmekte olduğunu gösterir. Şekilde, farklı dönemlerde sülfat indirgeme zamanla hızını artırarak olduğunu göstermektedir. Başlangıçta, toplu sülfat 20 gün sonra kendi azaltma oranı artıyordu, (Dönem I) azaltılabilir aldı ve beslenen sülfat (Dönem II) azaltmak için 10 gün, yaklaşık sürdü. Dönem III sülfat azalma daha az varyasyon sunulmuştur ve Şekil 5'de görüldüğü gibi, bu 10 gün ortalama elde edildi. Bu süre sonunda, sülfat indirgenmesi 4 gün (Dönem IV) ortalama aldı ve dönem V 4000 yılında sülfat mg / Laz 24 saat içinde tüketildi. Biyoreaktör performans 24 saat içinde HRT 200 gün sonra sürekli modda kuruldu.
Biyoreaktörde sulfidogenic çamur oluşumu sırasında zamanla Şekil 5. Sülfat (SO 4 2-) konsantrasyonu. Sürekli çizgi sülfat konsantrasyonunu içeri giren anlamına gelir. Kareler atık sülfat konsantrasyonuna bakın. Bu rakam Guerrero-Barajas ark alınmıştır. (2014) 12 karşılık gelen telif hakkı izni ile. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Zamanla sülfat indirgenmesi, sülfür konsantrasyonu, KOİ tüketimi ve pH değişimleri üzerinde Temsilcisi iyi sonuçlar sh vardırŞekil 6A'da, kendi. Bu sonuçlar biyoreaktör neredeyse bir yıl için sürekli rejim altında bir kez gerçekleştirilen deneylerde elde edilmiştir. Bu noktada, mikrobik topluluk biyoreaktör içinde geliştirildi ve Şekil 4B'de görüldüğü gibi, siyah tortu oluşmuştur. Şekil 6A'da olarak bu sülfat 4 saat indirgendi ve sülfid maksimum 1200 ± 30 mg / L konsantrasyonuna ve 188 ± 50 mg COD-H 2 S / g VSS * d sülfat aktivitesini azaltarak ulaştığı görülebilir. Bu biyoreaktör elde edilen sülfür konsantrasyonu mikroorganizmaların yüksek ve toksik olarak kabul edilir söz değer olduğunu ve bu durumda biyoreaktör aktivitesini azaltarak sülfat bitmemişti.
Biyoreaktör Şekil 6. Performansı (A) önce ve TCE ek (B) uygulanmasından sonra. Sülfat (SO 4 2-) (◇), Sülfür(H 2 S) (•). Sunulan veriler n = 3, ortalama ve standart sapma değerleridir. Bu rakam Guerrero-Barajas ark alınmıştır. (2014) 12 karşılık gelen telif hakkı izni ile. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Çamur TCE azaltma yeteneğinin test edildiği deney için, elde edilen sonuçlar Tablo 1 'de gösterilmiştir. Elde edilen aktiviteyi azaltır sülfat TCE ilave edilmesinden önce elde edilmiş ve TCE yaklaşık% 80 düşürülmüştür biraz daha düşüktü eten (bakınız Tablo 1). Bu sonuçlar, reaktör sülfat indirgeyici koşullar altında çalışan edilmiş olan zamana göre beklenmelidir. Bu çamur alınırsa TCE azaltma reaktörü Dönem I veya II çalışıyorken (Şekil 5 meydana olası değildir
| Parametre | TCE azaltma testi sırasında Değeri | ||
| SO 4 2- kaldırma (%) yüzdesi | 98 (0.06 ±) | ||
| Sülfür (H 2S) konsantrasyonunun (mg / L) | 971 (± 72) | ||
| H SO 4 2- dönüştürülmesi yüzdesi 2 S (%) | 68 (± 2) | ||
| COD kaldırma Oranı (%) | 93 (0.1 ±) | ||
| pH aralığı | 7,1-7,7 | ||
| Gaz üretimi (ml / d) | 200 (± 55) | ||
| Sülfat indirgeyici aktivitesi (mg COD-H 2 S / g VSS * d) | 161 (± 7) | ||
| * TCE nihai konsantrasyon (uM) | 77 (± 8) | Vinil Klorür konsantrasyonu (uM) | 16 (0.3 ±) |
| Eten konsantrasyonu (uM) | 202 (± 81) | ||
| TCE kaldırma Oranı (%) | 74.3 (± 14) |
. Tablo TCE biyodegradasyon deney sırasında sulfidogenic çamur performansı 1. Sonuçlar Bu tablo Guerrero Barajas et al modifıye edilmiş (2014) * TCE başlangıç konsantrasyonu.:. 300 uM. Sunulan veriler, ortalama ve n = 3 standart sapma değerleridir.
TCE redüksiyon testinden sonra, sülfat indirgenmesi, sülfür konsantrasyonu, COD tüketimi ve zaman içinde pH varyasyonlarının Sonuçlar Şekil 6B 'de gösterilmiştir. Bu sonuçlar, sülfat, 5 saat indirgendi ve sülfür konsantrasyonu aktivitesini azaltan bir sülfat ile birlikte, 1400 ± 35 mg / L ulaştığını göstermektedir248 ± 22 mg KOİ-H 2 S / g VSS * d. Biraz daha yüksek sülfat azaltıcı aktivite - 188 ± 50 mg KOİ-H 2 S / g VSS * d ile karşılaştırıldığında - mikrobiyal topluluk TCE tarafından inhibe olmadığını gösterir.
Bu protokolde kullanılan çamur tespit mikroorganizmalar üzerinde Sonuçları, bakteri azaltıcı bakteri mayalama ve halojen giderilmesi bakteriler bu protokolü kullanılarak geliştirilen çamur tespit edilmiştir Tablo 2. Sülfat sunulmaktadır. Biyoreaktör TCE ile koşulları ve birkaç gün azaltarak sülfat altında bir yıl boyunca faaliyet çünkü sonuçlar şaşırtıcı değildir. Böyle Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfitobacterium, Clostridium, Dehalobacte r ve Sulfurospirillum olarak bakterilerin cins sülfat indirgenmesi ve klorlu bileşiklerin biyodegradasyon ilgili oylandı. Ayrıca, çamur, bu mikroorganizmaların tanımlanmasıProtokol en toksik klorlu bileşiklerden biri olan ve sülfat ve trikloretilen eşzamanlı olarak çıkarılması için, kullanılabilen bir çamur sulfidogenic geliştirme başarılı olduğunu doğrulamaktadır.
| Bakteriler bildirildi | Yüksek benzerlik | max ident |
| gi | 386685641 terbiye Desulfovibrio sp. | Desulfovibrio desulfuricans | % 96 |
| gi | 386685640 terbiye Desulfomicrobium sp. | Desulfomicrobium norvegicum | % 99 |
| gi | 386685639 terbiye Desulfomicrobium sp. | Desulfomicrobium baculatum | % 99 |
| gi | 386685638 terbiye Desulfomicrobium sp. | Desulfomicrobium hipogeium | % 99 |
| gi | 386685637 terbiye Desulfotomaculum sp. | Desulfotomaculum acetoxidans | % 99 |
| gi | 386685636 terbiye Clostridium sp. | Clostridium celerecrescens | % 99 |
| gi | 386685635 terbiye Desulfovibrio sp. | Desulfovibrio halophilus | % 98 |
| gi | 386685634 terbiye Dehalobacter sp. | Dehalobacter restrictus | % 99 |
| gi | 386685633 terbiye Desulfitobacterium sp. | Desulfitobacterium hafniense | % 99 |
| gi | 386685632 terbiye Sulfurospirillum sp. | Sulfurospirillum multivorans | % 97 |
| gi | 386685631 terbiye Sulfurospirillum sp. | Sulfurospirillum halorespirans | % 97 |
. Maksimum kimliği: Tablo 2. Konsorsiyum bioreaktörün çamur ve diğer bakterilere Max ident olan benzerliği tespit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çevre biyoteknoloji sulfidogenesis birkaç uygulamaları, bakteri fermente atıksu arıtımında olduğu ile konsorsiyum sülfat indirgeyici bakterilerin metabolizmasının en çok kullanılan uygulamalardan biri vardır. UASB reaktörleri yüksek sülfat konsantrasyonları ile endüstriyel atıksu arıtma ana mühendislik yaklaşımları arasında yer almaktadır. Bu çalışmada, bir UASB reaktörünün deniz çökelleri gelen sulfidogenic çamurun elde etmek için bir protokol mevcut. Deniz çökelleri bir sulfidogenic çamur elde etmek için protokol çerçevesinde kritik adımlar şunlardır: (1) tortu örneği homojen teşvik (2) sülfat ve uçucu yağ asitlerinin sağ konsantrasyonu (COD besleme, reaktöre yerleştirilmek üzere / SO 4 2-) oranı, (3) analiz sülfat, sülfit, periyodik KOİ ve pH, (4) iz metaller ve vitamin toplu başlatıldığında her zaman içeren bazal ortamı, ferahlatıcı. Bu sludg gelişimine olduğunu dikkate almak önemlidire orijinal numunenin mikrobiyal topluluk ve sağ kütle dengeleri (sülfat ve COD) büyük ölçüde bağlıdır. Onu geliştirmek için aktivitesini azaltarak sülfat zaman alır rağmen, biyoreaktör sirkülasyon pompasını durdurabilir veya sıcaklık kontrolü kapanabilir sızıntıları, kaza veya enerjinin zamansal eksikliği önlemek için sürekli olarak izlenmesi gerekir. Özel dikkat sülfit, sülfat ve KOİ analizi performans ödenmelidir.
Genel olarak deniz çökeltiler mikroorganizmaların geniş bir yelpazede doğal bir kaynaktır; bu çamur farklı derinliklerde alınan deniz çökelleri ile oluşturulabilir olasıdır. Bu protokolde iki ana nedenden dolayı hidrotermal deniz tortuları kullanmak için seçildi: (1) Bu sığ delikleri maliyet ve yakın bulunan (2) sitelerin bu tür sülfat indirgenmesi bir göstergesidir ki, sülfürler daha bol ve Bu nedenle, sülfat indirgeyici bakterilerin varlığı. Bir şey olursa, teressübü alarakBu çok olası olduğunu düşünüyorum, ancak denizaltı katında başka bir yerden ts sadece çamur geliştirmek için daha fazla zaman gerektirecektir.
Aynı zamanda, daha bu protokol veya başka bir moleküler biyoloji tekniğinde önerilen prosedür takip edilerek tespit edilmesi çamur burada halojen giderilmesi için mikroorganizmaların varlığını arttırmak için farklı TCE redüksiyon testleri yapmak için gereklidir. Edebiyat dünyasının 7 çapında çeşitli deniz çökelleri mikroorganizmaların bu tür varlığı ifade eder rağmen, halojen giderilmesi mikroorganizmaların gelişmesi de çamur kaynağına bağlı olduğunu dikkate almak önemlidir. A sülfat indirgeyici etkinlik tahlili, örneğin, TCE varlığı stresli koşulu sonra sulfidogenic çamurun uygulanabilirliğini değerlendirmek amacıyla toksik bir bileşik için çamurun maruz kaldıktan sonra tavsiye edilir. Çamurun sülfat azaltıcı aktivite düşerse o s korumak için gerekli olacaktırBir toplu iş modunda everal hafta yine sülfat indirgeyici aktivitesi artışı teşvik etmek sülfat ve KOİ ile beslenen. Bu mikroorganizmaların sulfidogenesis ve büyümeyi teşvik etmek için bir protokol önerilen adımları uygulayarak yapılabilir. O çökellerin culturing başından beri TCE ve sülfat ekleyerek sulfidogenic-halojen giderilmesi çamur elde etmek için denendi söz önemlidir, ancak (ya sülfat azaltılması veya halojen giderilmesi) herhangi bir aktivite hiç gözlenmemiştir. (Hatta 20 uM konsantrasyonda) TCE tahammül etmedi kültürün erken aşamalarında bulunan mikroorganizmaların düşük içeriği, ancak, zenginleştirme başından beri TCE eklenmesi her zaman diğer çökelleri ile teşebbüs edilebileceği kabul edilmiştir.
Bu durumda iyi bir sonuç TCE redüklenmesi, esas itibarı dichloroethenes ve vin verebilir çamur geliştirilmiş olabilir mikroorganizmalar bağlı olarak, ancak, eten ile TCE azalma olduil klorür (VC). Bu durumda TCE azaltılması için elde edilen veriler sürekli test sırasında TCE ve ara ürünler için biyoreaktör yerine örnekleme her HRT döngüsünden sonra kaydedildi. Bu nedeniyle sık sık örnekleme klorlu bileşiklerin buharlaşmasını önlemek için bu şekilde yapıldı. Bu nedenle, göstermek için zaman içinde TCE konsantrasyon herhangi bir grafik, ancak her deney sonunda konsantrasyonları vardır. Onlara doğru konsantrasyonlarını rapor ve değişiklikler biyolojik azaltma yerine kayıplara isnat edilebilir, eğer ayırt uçucu klorlu bileşiklerin buharlaşmasını önlemek için önemlidir. Eten varlığı ve TCE indirgemeden sonra nihai ürünlerinde -1,2-dikloroetilen cis olarak TCE ortak ara-olmayışı, özellikle ilgi çekicidir. Her zaman eten tam TCE azaltılması sadece Dehalococcoides sp gerçekleştirilebilir bildirilmiştir. ve bu durumda, bu microorgalog mekanizmaları çamur belirlenen cins arasında tespit edilememiştir. Biz dehalorespiring, mayalanma ve sülfat indirgeyen bakterilerin arasında çamur ortaya çıkmış olabilir cometabolism için TCE azaltma bağlıyor. Bu konsorsiyum bir dezavantajı, VC, TCE daha toksik bir bileşiğin geçici oluşumunu teşvik ettiği, ancak, bu, şu anda nispeten düşük konsantrasyonlarda ise. Bu çok olağandışı cometabolic aktivitesi konsorsiyum tarafından ve indirgeyici koşullar altında yeni sülfat TCE indirgeme yolu daha Bu çalışmada belirlenen halorespiring mikroorganizmaların mevcudiyetinde araştırılabilir geliştirildi ki bu noktada da mümkün olabilir. Öte yandan, daha önce halojen giderilmesi genler sıklıkla yeraltı deniz çökelleri tespit olduğunu bildirdi, ancak sülfat indirgeyici koşullar ile birlikte denizaltı çökelleri ile TCE parçalanma ile ilgili rapor vardır edilmiştir, bu alternatif bir elektron alıcısı olarak sülfat kullanılarak vardır.
Bu yöntemin sınırlamalardan biri çamurun yapısı kullanılır tortu fiziksel özelliklerine bağlıdır ve bu yöntemde, oluşan çamur reaktörü ve cama biyofilm oluşumunu iyi sıvılaştırılmasını var olmakla beraber, nasıl tahmin edilemez olduğunu aslında farklı yerlerde tortuları kullanarak çalışmaya devam eder. Bu ön testlerin yapılabilmesi için küçük reaktörler kullanmak mümkün olabilir vebu mümkün olup olmadığını gözlemleyin. Niyeti bir biyoreaktörde çamur ile çalışmak üzere ise, biz mikrokosmlarından ile başlayan önermiyoruz. Öneri olsa ilk denemede daha küçük hacimli, baştan reaktör ayarlamaktır.
Burada sunulan yöntem oluşturduğu çamur sulfidogenesis için metanojenik granül çamur adaptasyonu yoluyla elde edilir, diğer sulfidogenic çamurlar daha yüksek sülfür konsantrasyonu tahammül önemlidir. Yöntem sülfat indirgeyici bakteriler ve fermente bakterileri içeren ve kolayca toksik bileşikler ayrışamadığından için uyarlanmış bir konsorsiyum ile bir çamur oluşumunu destekler. Bu protokolde, sadece UASB reaktörlerde metan koşullar altında biyolojik olarak parçalanır edilmiş bir toksik bir bileşik örneği olarak kullanılmaktadır TCE. Reaktörün amacı klorlu çözücüler biotransform için ise, örneğin, yavaş yavaş, yani, daha yüksek TC solvent konsantrasyonunu arttırmak için yararlı olabilirTestlerde E konsantrasyonu, sülfat konsantrasyonunu düşürürken sülfat indirgenmesi üzerinde halojenlerinin giderilmesini teşvik etmek. Her ne kadar, bu çalışmada elde edilen sonuçlara göre, biz hala sülfat indirgeyici koşullar arzu varsa sülfat tamamen kültürden kaldırılamaz düşünüyorum. Bazı dehalorespirers aynı zamanda sülfat düşürücüler olduğundan Ayrıca, sülfat indirgeme koşulları muhafaza edilmelidir. Bu protokol açıklanan koşullar altında üretilen çamur sonunda aynı anda KOİ, sülfat, klorlu bileşikler ve toksik ağır metallerin uzaklaştırılması için kullanılan olabilir. Ağır metaller çamur tarafından üretilen sülfür ile hızlandırabilir.
Son olarak, oluşan sulfidogenic çamur için test edilebilir: daha yüksek sülfit konsantrasyonları (örneğin, ağır metaller çökeltilmesi için) (1) tolerans, (2), diğer organik kirletici maddelerin biyolojik ayrışması, ya da elektron vericileri olarak hidrokarbonların (3) tüketim Bunun yerine fu uçucu yağ asitlerininrther çevre biyoteknolojisi kendi uygulamalarını araştırmak. Bu çamur oluştuktan sonra diğer reaktörler aşılamak için tohum çamur olarak kullanılabileceğini dikkate alınması önemlidir. Bu durumda, sülfat redüksiyon işlemi hemen ve böylece ortaya çıkar, bu tamamen biyoreaktörü çalıştırmak için bir yıl beklemek gerekli olmayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trichloroethylene | sigma Aldrich | 251402 | |
| cis-1,2-dichlorotehylene | sigma Aldrich | ||
| trans-1,2-dichloroethylene | sigma Aldrich | D-62209 | |
| vinyl chloride scotty standard | supelco | 1,000 ppm v/v in nitrogen | |
| ethene scotty standard | supelco | 99% purity | |
| pump | Masterflex | Model 7553-75 | |
| spectrophotometer | any | ||
| microcentrifuge | any | ||
| gas tight syringes | any | 100 and 200 microliters | |
| UASB glass reactor | any | under design | |
| gas chromatograph | any | FID detector | |
| capillary column SPB-624 | supelco | ||
| pH meter | any | ||
| viton tubing | Masterflex | ||
| basal medium reagents | any | ||
| trace metals reagents | any | ||
| vitamins solution reagents | any | ||
| sodium sulfate | any | ||
| volatile fatty acids | any | ||
| COD determination kit | HACH | range 0-15,000 mg/L | |
| TOPO-TA cloning kit pCR®4.0 | Invitrogen, US | ||
| S.N.A.P. TM Miniprep Kit | Invitrogen, UK | ||
| Pure link TM Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen |
References
- Lens, P., Esposito, M. V. G., Zandvoort, M. Perspectives of sulfate reducing bioreactors in environmental biotechnology. ReViews Environmental Science and Biotechnology. 1 (4), 311-325 (2002).
- Omil, F., Lens, P., Hulshoff, P., Lettinga, G. Characterization of biomass from a sulfidogenic, volatile fatty acid-degrading granular sludge reactor. Enzyme and MicrobialTechnology. 20, 229-236 (1997).
- Lopes, S. I. C., Wang, X., Capela, M. I., Lens, P. N. L. Sulfate reduction during the acidification of sucrose at pH 5 under thermophilic (55 °C) conditions.II: Effect of sulfide and COD/SO4-2 ratio. Bioresource Technology. 101, 4278-4284 (2010).
- Alfonso, P., Prol-Ledesma, R. M., Canet, C., Melgarejo, J. C., Fallick, A. E. Sulfur isotope geochemistry of the submarine hydrothermal coastal vents of Punta Mita, Mexico. Journal of Geochemical Exploration. 78-79, 301-304 (2003).
- Valdemarsen, T., Kristensen, E. Degradation of dissolved organic monomers and short chain fatty acids in sandy marine sediment by fermentation and sulfate reduction. Geochimica et Cosmochimica Acta. 74, 1593-1605 (2010).
- Quistad, S. D., Valentine, D. L. Anaerobic propane oxidation in marine hydrocarbon seep sediments. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75, 2159-2169 (2011).
- Futagami, T., Morono, Y., Terada, T., Kaksonen, A. H., Inagaki, F. Dehalogenation activities and distribution of reductive dehalogenase homologous genes in marine subsurface sediments. Applied and Environmental Microbiology. 75 (21), 6905-6909 (2009).
- U.S. Environmental Protection Agency. List of priority pollutants. Clean Water Methods. , (2014).
- Ozdemir, C., Dursun, S., Karatas, M., Sen, N., Sahinkaya, S. Removal of trichloroethylene (TCE) in upFlow anaerobic sludge blanket reactors (UASB). Biotechnology and Biotechnological Equipment. 21 (1), 107-112 (2007).
- Zhang, Y., Wang, X., Hu, M., Li, P. Effect of hydraulic retention time (HRT) on the biodegradation of trichloroethylene wastewater and anaerobic bacterial community in the UASB reactor. Applied Microbiology and Biotechnology. 99, 1977-1987 (2015).
- Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. , 20th Edn., American Public Health Association. Washington, DC. (1998).
- Guerrero-Barajas, C., et al. Enhanced sulfate reduction and trichloroethylene (TCE) biodegradation in a UASB reactor operated with sludge developed from hydrothermal vents sediments: process and microbial ecology. International Biodeterioration and Biodegradation. 94, 182-191 (2014).
- Trüper, H. G., Schlegel, H. G. Sulphur metabolism in Thiorhodaceae I. Quantitative measurements on growing cells of Chromatium okenii. Antoine van Leeuwenhoek. 30, 225-238 (1964).
- Gallegos-García, M. G. Biological processes of sulfate reduction in biofilms for metals precipitation [Ph D thesis]. , Intituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica. San Luis potosí, Mexico. (2009).
- Guerrero-Barajas, C., Garibay-Orijel, C., Rosas-Rocha, L. E. Sulfate reduction and trichloroethylene biodegradation by a marine microbial community from hydrothermal vents sediments. International Biodeterioration and Biodegradation. 65, 116-123 (2011).
