Introduction
Uma das contribuições mais importantes para a biotecnologia ambiental foi o projeto de biorreatores em que o lodo utilizado (inóculo) foi capaz de realizar em condições redutoras de sulfato. Redução do sulfato (SR) permite que o tratamento de fluxos de águas residuais que contêm elevadas concentrações de sulfato de para além da remoção simultânea de COD, metais pesados e poluentes orgânicos, um facto que torna SR uma característica desejável das lamas 1. Alguns exemplos de efluentes contaminados com sulfato de vir de curtumes, papel, farmacêutica e manufatura química indústrias 1. No entanto, a maioria da literatura refere-se a sulfidogenico lamas quando lodo granular metanogênica foi adaptado para sulfidogenesis 2. Esta adaptação é normalmente alcançada através da manipulação do COD / SO 4 2- ratio no biorreactor e adição de produtos químicos para inibir metanógenos na 2,3 lamas. Em adição ao longo tempo que may requerem a formação dos grânulos sulfidogenico, a competição entre os metanogenos e redutores de sulfato e a tolerância da lama a altas concentrações de sulfureto são alguns dos principais problemas que podem surgir se a lama sulfidogenico utilizado no bioreactor é obtido a partir da adaptação de predominantemente lamas methanogenic a sulfato condições redutoras. Neste trabalho, descrevemos o procedimento para obter uma lama predominantemente sulfidogenico de fontes hidrotermais sedimentos (Punta Mita, Nayarit, México) em um reator anaeróbio de manta de lodo (UASB), em seguida, avaliar a sua sulfato de reduzir a atividade ao longo do tempo e realizar um experimento para avaliar a sua aplicação em descloração redutiva. A localização dos sedimentos foi escolhido porque ele tem sido relatado que, nesse local, há formação de sulfuretos, devido à actividade de redução de sulfato exibida pela comunidade microbiana que habitam em particular lugar 4.
Há Severvantagens al na obtenção deste lodo sulfidogenico de sedimentos sobre a adaptação do lodo granular methanogenic para sulfidogenesis. Algumas destas vantagens são: (1) não é necessária para formar os grânulos para o biorreactor de operar, (2) as lamas tolera concentrações relativamente elevadas de sulfureto quando comparado a outros UASB que operam com lamas metanogênica adaptado, e (3) não está nenhuma competição para substrato com metanógenos mesmo de etilo é usado na mistura de ácidos gordos voláteis que está incluído no meio de cultura para promover a formação do lodo.
Este procedimento foi seguido para promover sulfidogenesis porque sedimentos marinhos é uma associação natural de uma grande variedade de microorganismos, tais como bactérias redutoras de sulfato, da fermentação de bactérias e bactérias desalogenação apenas para mencionar alguns 5,6. O tipo de consórcio desenvolvido a partir de sedimentos marinhos utilizando este protocolo pode apresentar eficiência na redução de sulfato e, portanto, altas s ulfate redução da atividade ao longo do tempo e maior tolerância ao sulfeto em concentrações mais elevadas do que o reportado como tóxico para methanogens e bactérias redutoras de sulfato. Por outro lado, é provável que a capacidade de desalogenação também é mostrado nos sedimentos, seguindo o protocolo proposto aqui, mas pode depender da comunidade microbiana inicial. Esta suposição é feita com base no fato de que descloração redutiva pode ocorrer pela respiração ou co-metabolismo, ambas as condições que podem ser promovidos na comunidade microbiana marinha 7. O cultivo dos sedimentos para obter a lama foi realizada usando uma mistura de acetato, propionato e butirato como substrato, porque estes ácidos gordos voláteis são utilizados por várias estirpes de bactérias redutoras de sulfato. Estes ácidos também são o tipo de compostos de carbono frequentemente encontrados em sedimentos marinhos, de acordo com vários relatos na literatura sobre material carbonáceo em sedimentos marinhos 5,6.
conteúdo "> Finalmente, alguns dos compostos mais tóxicas que estão presentes nas massas de água subterrânea e outra de água em todo o mundo são os solventes clorados tais como tricloroetileno (TCE) ou tetracloroetileno (PCE). Estes compostos são tóxicos, não só para o ser humano, mas também para microorganismos, particularmente TCE, que ainda é considerado um poluente prioritária pela Agência de Proteção Ambiental em os EUA 8. Neste trabalho propôs um experimento no qual a lama sulfidogenico é testado em sua capacidade de reduzir TCE em concentrações que estão na faixa relatada por compostos clorados biodegradação sob condições metanogênicas 9,10. Vale ressaltar que a maioria das pesquisas sobre a biodegradação de compostos clorados tem sido conduzida sob condições metanogênicas 9,10. Consideramos que a experiência com TCE proposto neste protocolo é um bom exemplo das aplicações potenciais do lodo. O objetivo deste experimento foi para eavaliar a tolerância das lamas ao TCE e o efeito sobre o sulfato de TCE redução da actividade. Tendo em conta que a maior parte da investigação sobre a biodegradação de compostos clorados é levada a cabo sob condições metanogénicas, este protocolo sugere a formação de uma lama pode ser utilizada para, simultaneamente: (1) remover o sulfato, (2) remover o COD e (3) remover compostos clorados. Um passo adicional pode ser a de avaliar a lama sobre a remoção simultânea de TCE e metais pesados (em adição ao sulfato e COD), duas condições que não podem ser avaliadas sob condições metanogénicas.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figura 1. Esquema para os passos do protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Recolha sedimentos marinhos para a Formação do Sludge
- Identificar uma área submarina acessível quer perto de fontes hidrotermais (devido à presença de sulfuretos, o que pode indicar uma maior actividade redutora de sulfato) ou para uma área em que os restos de matéria orgânica são detectáveis.
- Para o propósito deste trabalho, levar cerca de 3 ou 4 kg de sedimentos e drenar a água fora das amostras. Colocar as amostras em sacos plásticos escuros. Não é necessária nenhuma refrigeração.
- Uma vez no laboratório, manter os sacos com as amostras na geladeira, se eles não estão indo para ser utilizado de imediato. Para os fins deste trabalho, SAMPles pode estar no frigorífico durante semanas ou meses antes de os utilizar.
- Tomar uma grande porção da amostra de sedimento (isto é, 1 ou 2 kg) e utilizar uma malha adequada (0,2 cm) para eliminar os sedimentos a partir de grandes fragmentos de material carbonado que pode ser encontrado ou algumas pedras que podem estar presentes.
Nota: Neste caso, uma malha de 0,20 cm de diâmetro (0,0767 in) foi utilizado, mas pode ser de um tamanho diferente de acordo com o tamanho das partículas na amostra.- Depois de passar o sedimento através da malha, misturar a porção seleccionada para promover que a porção é homogénea.
- Retirar amostras mais pequenas separadas (isto é, 2 a 3 g) para determinar os sólidos suspensos voláteis conteúdo (VSS), seguindo os métodos padrão 11.
Nota: Consulte a Figura 2 para obter os passos 1.2 a 1.4.
Figura 2. Fotografias das amostras de sedimentos.As amostras (A) de sedimentos apenas depois de ter sido feita. Amostra (B) de sedimentos depois de passar através da malha. (C) Amostra colhida para a pesagem antes de sólidos suspensos voláteis (VSS) determinação. A placa de Petri não precisam ser esterilizados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Bioreactor Set Up
- Para os fins deste trabalho, usar um reactor de vidro de UASB com um volume de trabalho total de 3 L. Em alternativa, usar um 1 ou 2 L de volume do reactor de vidro.
- Com base no conteúdo do VSS dos sedimentos calcular a quantidade de sedimento para ser usada como inoculo para se obter 5 g de VSS no 1 L.
- Levar em conta que, se a quantidade de sedimento após o cálculo é demasiado grande, o volume, em seguida, cerca de 25% a 30% do bioreactor deveria ser ocupada por os sedimentos em vez disso.
- Grave o conteúdo VSS, uma vez quevai mudar quando a comunidade microbiana é enriquecido no biorreator. O conteúdo VSS é necessária para os cálculos de sulfato de redução da atividade no biorreator.
- Assegure-se que a concentração final da solução de meio de tampão basal e no biorreactor é similar ao relatado por Guerrero-Barajas et ai. (2014) 12.
- Assegurar que os volumes finais dos sedimentos, meio basal, solução tampão e ácidos gordos voláteis são iguais ao volume de trabalho final do reactor. O meio basal 12 receita contém as concentrações apropriadas para a solução de traços de metais e vitaminas.
- Prepara-se uma solução stock de meio basal e solução tampão numa concentração apropriada para o volume de trabalho do reactor utilizado (ou seja, 2, 3 ou 4 vezes mais concentrado do que a relatada no passo 2.4) para garantir que, quando é diluída, é na concentração relatado por Guerrero-Barajas et ai. (2014)12).
Nota: A solução-mãe para o meio basal é sempre necessária, contudo, a solução tampão é necessário apenas no arranque. Não é necessário adicionar uma solução tampão depois de este tempo. - Prepara-se uma solução estoque de ácidos gordos voláteis: acetato, propionato e butirato de 2,5: COD proporção 1: 1. Leve em conta para os cálculos do acetato de sódio incluídos no meio basal. A concentração de COD final no reactor deve ser de 2,7 g / L.
Cuidado: Prepare esta solução em um exaustor. Use luvas de borracha nitrílica e óculos de proteção para a preparação desta solução. Ter em conta a estequiometria das reacções de sulfato com os ácidos gordos voláteis que é mostrado na Figura 3. - Prepara-se uma solução estoque de sulfato de sódio (Na 2 SO 4) em uma concentração apropriada para fornecer ao reactor uma concentração final de 4,000 mg / L do ião sulfato (SO 4 2-). Alternativamente, incluem the quantidade de sulfato necessário no meio basal em vez de adicionar-lo a partir de uma solução estoque, enquanto o sulfato de final (SO 4 2-) a concentração é direita.
- Colocar os sedimentos no reactor misturado com uma porção do meio de base para se certificar de que elas cheguem ao fundo do reactor.
- Adicionar o resto da solução de meio de tampão basal e misturado com a solução de ácidos gordos voláteis e da solução de sulfato. Certifique-se de que a solução de ácidos gordos voláteis é vertida para dentro do líquido. Nota: Realize esta etapa em um exaustor.
- Defina as conexões e tubulações do reator para a bomba de reciclagem. Definir a taxa de fluxo de reciclagem em 60 ml / min. Definir o biorreactor na câmara de temperatura de 34 ° C. Verifique regularmente se as variações de temperatura são pequenos (ou seja, 34 ± 1,7 ° C)
- Defina as conexões com a coluna de deslocamento de gás.
Nota: Consulte a Figura 4 para passos 2.1 a 2.5. </ ol>
Figura 3. A estequiometria de redução de sulfato com VFA (acetato, propionato e butirato). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. reator UASB. (A) de tempo inicial. (B) regime contínuo depois de 300 dias de operação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. O funcionamento do reactor para promover Sulfidogenesis e crescimento dos microrganismos
Nota: Permitir para o inóculo para consumir a volatile ácidos gordos e sulfato. Para este efeito, esperar durante uma semana para efectuar a primeira análise para o sulfato, sulfeto e consumo de COD.
- Após uma semana de incubação tomar uma amostra de 5 a 7 ml de líquido para realizar a análise de CQO, sulfato e teor em sulfureto e de pH seguindo métodos convencionais 11, 13.
- Analise sulfureto no espectrofotometricamente líquido (no comprimento de onda (λ) de 670 nm), seguindo o método de azul de metileno 13.
- Colocar 5 ml de uma solução de acetato de zinco (2% w / w) num balão volumétrico de 25 ml, adicionar rapidamente 200 ul da amostra com a solução de acetato de zinco.
- Adicionar 2,5 ml de solução de uma N, N-dimetil-p-fenilenodiamina oxalato (DMP) (0,2% w / w em 20% de H 2 SO 4) e 125 ul de sulfato de ferro (III), solução de sulfato de amónio (10% w / w em 2% de H 2 SO 4) e completa com água destilada a 25 ml em frasco volumétrico. Aguarde 30 minutos para a reaçãoa ocorrer, o tempo em que a cor azul é estabilizada 13..
Nota: Espere pelo menos 15 minutos, mas não mais do que 60 minutos para testar as amostras no espectrofotômetro. Realizar a leitura da solução final azul no espectrofotómetro.
- Analise sulfato de acordo com métodos padrão 11. Aqui, quantificar sulfato como sulfato de bário, usando um método turbidimétrico.
- Colocar 5 ml de uma solução de condicionamento (ácido clorídrico HCl 1: 1) num balão volumétrico de 25 ml, adicionar 1 ml de amostra, previamente centrifugado (a 11.320 x g), para terminar a 25 ml do frasco volumétrico com água destilada e adicionar 1 g de cloreto de bário.
- Misture a solução durante 1 min num vórtice. Espere por 4 min para o sulfato de bário para formar e ler a amostra no espectrofotômetro em um comprimento de onda (λ) de 420 nm 11.
- Analise COD de acordo com métodos padrão 11. Como alternativa, use um COD Determinakit ção.
- Antes da determinação de COD, centrifugar a amostra cuidadosamente (11.320 xg a) para remover o sulfureto remanescente que pode interferir na determinação. Se necessário, centrifugar duas vezes: a primeira vez imediatamente após a colheita da amostra ea segunda vez esperar 6 ou 8 horas e, em seguida, realizar a análise COD.
- Adicionar 2 ml de amostra para um frasco de reacção do kit de determinação de COD, selar o frasco e homogeneizar a mistura por agitação suave. Prepara-se uma placa através da adição de 2 ml de água destilada para um outro frasco de reacção e homogeneizar a mistura.
- Colocar os tubos no reactor de digestão a 150 ° C durante 2 horas. Remover os frascos e deixe-os arrefecer no escuro. Tome as leituras dos frascos no espectrofotômetro em um comprimento de onda de 620 nm.
- Obter o volume de gás a partir da coluna de deslocamento de gás.
- Analise sulfureto no espectrofotometricamente líquido (no comprimento de onda (λ) de 670 nm), seguindo o método de azul de metileno 13.
- Aguarde até mais 5 a 7 dias até que o sulfato é consumido. Sulfato de COD e deve ser consumido numaproximadamente 85% a 90% antes de uma nova fornada alimentada é iniciado.
- Uma vez sulfato (e COD) são consumidos, completamente repita o passo 2.4. Fornecer meio fresco e novos nutrientes para cada lote.
- Repita os passos 3.1 e 3.2. Neste ponto, cada lote deve durar entre 7 e 10 dias.
- Quando 3 a 4 lotes foram concluídos, repita a etapa 2.4, mas aumentar a concentração de CQO a 4 g / L.
- Repita o passo 3.1 e 3.2 passo.
- Repetir o passo 3.3, mas aumentar a concentração de CQO a 6 g / L.
- Repetir 3.6 e 3.6.1 aumentando gradualmente até concentração de CQO é 10 g / L.
Nota: Adicione o gráfico que apresenta a concentração de sulfato (mg / L) em função do tempo (d).
- Quando o consumo de sulfato é superior a 80% em menos de 24 h e isto ocorre durante mais de uma semana, mudar o funcionamento do reactor de modo contínuo. Para o modo contínuo definir o tempo de retenção hidráulica (TRH) em 24 horas e manter a concentração de sulfato a 4 g / L e o CODem 10 g / L.
Nota: Com o tempo o consumo deve ser sulfato mais rápido.
4. redutoras de sulfato atividade de teste
- Antes deste teste se certificar de que o biorreactor em regime contínuo apresenta variação inferior a 10% na concentração de sulfato restante.
- Em um determinado dia, parar o reactor após um ciclo HRT e conduta passo 2.4. Para o passo 2.4.3 utilizar uma concentração de CQO de 10 g / L.
- Uma vez que o bioreactor é alimentado, levar de 5 a 7 ml de amostras do líquido e para executar a análise COD, sulfato, sulfeto (passo 3.1) e o pH a cada hora. Anote o volume de gás produzido.
- Calcule o sulfato de reduzir a atividade de acordo com a literatura 14.
SRA = sulfato de redução da atividade (mg COD-H 2 S) / gVSS * d
m H 2 2 S
VSS = volátil concentração de sólidos em suspensão
t = tempo (d ou h)
- Adicione os gráficos correspondentes que mostram a percentagem de consumo de sulfato versus concentração de sulfureto ao longo do tempo, em mg / L. Faça os gráficos que mostram percentagem de consumo de COD ao longo do tempo. Adicione os gráficos que mostram a variação do pH ao longo do tempo.
5. O tricloroetileno (TCE) Teste de Redução
- Antes deste teste se certificar de que o bioreactor está a trabalhar em regime contínuo e mostra uma variação inferior a 10% na concentração de sulfato restante. Não inicie esse teste se a redução de sulfato em biorreator é inferior a 90%.
- Prepara-se uma solução estoque de tricloroetileno (TCE), tendo em conta que a concentração final desse composto na fase líquida do bioreactor deve ser de 300 uM. Considere o partitioning do composto para o espaço de topo, utilizando a constante adimensional Lei Henry's (H') de TCE a 34 ° C. H'at 34 ° C durante TCE é 0,4722.
Cuidado: Prepare esta solução num fumehood e usar luvas e óculos de proteção.- Por exemplo, para uma solução stock de 5.000 mM, calculada como segue:
TCE concentração da fase gasosa = (0,4722) * (5.000) = 2.139 M. Inclua essa concentração na preparação da solução de estoque uma vez que esta quantidade de TCE será no espaço de topo.
Em seguida, no líquido (água) da solução de reserva, a concentração de TCE real será: 5,000 + 2,139 = 7,139 uM. Densidade TCE = 1,43 g / ml. Converter a 7139 uM de Mg e, em seguida, utilizando a densidade de TCE calcular o volume de TCE para a solução estoque.
Nota: A concentração da solução-mãe de TCE may ser inferior a 5,000 uM, isto é, 3000 ou 1000 uM, este depende da quantidade de volume desta solução pode ser entregue para o bioreactor de acordo com o seu volume de fase líquida.
- Por exemplo, para uma solução stock de 5.000 mM, calculada como segue:
- Prepare curvas padrão no cromatógrafo a gás para TCE, cis 1,2-dicloroetileno, trans -1,2-dicloroetileno, cloreto de vinilo e etileno. Prepare os cis -1,2-dicloroetileno e trans curvas padrão -1,2-dicloroetileno a partir de uma solução estoque de estes compostos, seguindo o mesmo procedimento descrito no ponto 5.2 para a solução estoque TCE. Preparar as curvas padrão para o cloreto de vinilo e etileno, diluindo a concentração de cada um dos gases a partir dos padrões (cilindros de gás).
- Preparar as curvas padrão destes compostos em um intervalo de 20 a 300 | iM. Usar o método relatado por Guerrero-Barajas et ai. (2011) 15, para a análise destes compostos no cromatógrafo de gás.
Cuidado: Prepare estes sesoluções ard em um fumehood e usar luvas e óculos de proteção.
- Preparar as curvas padrão destes compostos em um intervalo de 20 a 300 | iM. Usar o método relatado por Guerrero-Barajas et ai. (2011) 15, para a análise destes compostos no cromatógrafo de gás.
- Em um determinado dia, parar o reactor após um ciclo HRT e conduta passo 2.4. Para o passo 2.4.3 utilizar uma concentração de CQO de 10 g / L.
- Uma vez que o bioreactor é alimentado, adicionar o TCE directamente para o líquido no bioreactor a partir da solução de reserva preparada no ponto 5.2, a concentração de TCE final na fase líquida do bioreactor deve ser de 300 uM. Defina a HRT a 12 hr.
- No final de um ciclo de HRT tomar amostras do líquido (500 a 1.000 ul) e análise de conduta para CQO, de sulfato e de sulfureto (passos 3.1.1, 3.1.2 e 3.1.3). Tome amostras do headspace (100 a 250 ul) e realizar análise de TCE, cis 1,2-dicloroetileno, trans -1,2-dicloroetileno, cloreto de vinilo e eteno no cromatógrafo a gás.
- Repita o passo 2.4. Para o passo 2.4.3 utilizar uma concentração de CQO de 10 g / L.
- Não repetir qualquer teste de redução TCE até o biorreator apresenta mais de 90% de redução de sulfato e menos variação de 10% em ambos, a redução do sulfato e sulfato restante no bioreactor.
- Repetir 5.4, 5.5 e 5.6 de duas ou três vezes mais.
- Retirar amostras de sedimentos (0,5 g) para realizar a identificação dos microrganismos apenas depois de um teste de redução de TCE tenha terminado. Faça isso depois de testes de redução do TCE 2 ou 3.
6. redutoras de sulfato atividade de teste após a redução TCE Experiment
- Repita o passo 4 completamente.
7. Identificação dos microorganismos
- Recolher amostras de lodo de cerca de 0,5 g cada e realizar a extração de RNA total acordo com o método padrão de 12.
- Amplificar o gene do rRNA 16S com a transcrição reversa e conduzir a reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) um passo 12.
- Desenhar os primers para amplificar ou usar como uma primeira abordagem os sugeridos na literatura 11. Siga o amplificação procedimento sugerido na literatura 12.
- Construir as bibliotecas 16S rRNA. Amplicons de PCR pode ser clonado usando um kit de clonagem-11. Tipicamente, 10 colónias de cada placa (cada colónia representa um produto de PCR) pode ser clonado. Prepara-se o ADN de plasmídeo para sequenciação de acordo com o procedimento sugerido na literatura 12.
- Realizar o sequenciamento de fragmentos. Re-amplificar aproximadamente 1400 pb com os produtos de PCR externos com o protocolo para a amplificação por PCR como descrito anteriormente (passo 7.4) e o clone de acordo com o procedimento sugerido na literatura 12. Isolar o plasmídeo recombinante a partir de E. colônias coli como sugerido na literatura 12. Não realizar o procedimento parcial para o seqüenciamento com primers universais M13 12.
- Conduzir a análise de sequências. Alinhe as sequências de nucleótidos utilizando o Clustal X e ajustar manualmente no editor de texto. Executar pesquisas BLAST das databas NCBIe. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) 12.
- Obter os números de adesão sequência de nucleótidos. Deposite as sequências de nucleótidos dos clones identificados na base de dados EMBL sequência de nucleótidos (Gen-Bank / EMBL / DDBJ) sob os números de acesso correspondentes (ou seja, JQ713915eJQ713925 para sequências de amplicons) 12.
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Representative Results
Um comportamento típico da redução do sulfato no bioreactor é mostrado na Figura 5. É importante notar que, durante as primeiras semanas de redução de sulfato de operação será lenta. No entanto lento, o consumo de mais de 90% de sulfato de ao longo do tempo indica que o inoculo é o desenvolvimento de uma comunidade microbiana capaz de reduzir e, portanto, sulfato, enriquecida em bactérias redutoras de sulfato. Os diferentes períodos na figura indicam que a redução de sulfato foi aumentando a sua taxa ao longo do tempo. No início, o lote foram necessários 20 dias para o sulfato de ser reduzida (Período I), então a sua taxa de redução foi aumentando, e foram necessários aproximadamente 10 dias para reduzir o sulfato Fed (Período II). Período III apresentou menor variação na redução do sulfato e isso foi conseguido em uma média de 10 dias, como é visto na Figura 5. Após este período, a redução de sulfato teve uma média de 4 dias (período IV) e no período V a 4000 mg / L de sulfatoforam consumidas em menos de 24 horas. O desempenho no biorreator foi ajustado no modo contínuo depois de 200 dias no TRH de 24 hr.
Figura 5. Sulfato (SO 4 2-) concentração ao longo do tempo durante a formação de lamas sulfidogenico no biorreactor. A linha contínua refere-se a concentração de sulfato no afluente. Quadrados referem-se a concentração de sulfato no efluente. Este número foi tirado de Guerrero-Barajas et al. (2014) 12, com a permissão de autor correspondente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Bons resultados representativos sobre sulfato de redução, a concentração de sulfureto, o consumo de COD e variações de pH ao longo do tempo são shpróprio na Figura 6A. Estes resultados foram obtidos em experimentos realizados uma vez que o biorreator estava sob regime contínuo quase por um ano. Neste ponto, a comunidade microbiana foi desenvolvido no biorreactor e uma lama preta foi formado como pode ser visto na Figura 4B. Na Figura 6A, pode ser observado que o sulfato foi reduzido em 4 h e sulfureto atingiu uma concentração máxima de 1.200 ± 30 mg / L e 188 ± 50 mg CQO-H 2 S / g VSS * d foi o sulfato de redução da actividade. Vale a pena mencionar que a concentração de sulfureto obtido no bioreactor é considerado elevado e tóxico para os microorganismos, e, neste caso, o biorreactor não cessou o sulfato de redução da actividade.
Figura 6. Desempenho do bioreactor antes (A) e após (B) a adição de TCE. Sulfato (SO 4 2-) (◇), sulfureto(H 2 S) (•). Os dados apresentados são a média e desvio padrão de n = 3. Este número foi tirado de Guerrero-Barajas et al. (2014) 12, com a permissão de autor correspondente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para o experimento em que a lama foi testado na sua capacidade para reduzir o TCE, os resultados obtidos são mostrados na Tabela 1. O sulfato de redução de actividade obtido era ligeiramente mais baixa do que o obtido antes da adição do TCE e cerca de 80% do TCE foi reduzida para eteno (ver Tabela 1). Estes resultados devem ser o esperado de acordo com o tempo em que o reator estava operando sob condições redutoras de sulfato. É pouco provável que a redução do TCE ocorre se a lama é feita quando o reactor está a funcionar no Período I ou II (ver Figura 5
| Parâmetro | Valor durante o teste de redução TCE | ||
| Percentagem de SO 4 2- remoção (%) | 98 (± 0,06) | ||
| Sulfureto de (H 2 S) Concentração (mg / L) | 971 (± 72) | ||
| Percentagem de conversão de SO 4 2- de H 2 S (%) | 68 (± 2) | ||
| Percentagem de remoção de DQO (%) | 93 (± 0,1) | ||
| faixa de pH | 7.1 - 7.7 | ||
| A produção de gás (ml / d) | 200 (± 55) | ||
| Sulfato de actividade redutora (mg CQO-H 2 S / g VSS * d) | 161 (± 7) | ||
| * TCE concentração final (uM) | 77 (± 8) | Concentração de cloreto de vinilo (M) | 16 (± 0,3) |
| Eteno concentração (uM) | 202 (± 81) | ||
| Percentagem de remoção TCE (%) | 74,3 (± 14) |
. Tabela 1. Os resultados sobre o desempenho das lamas sulfidogenico durante a experiência TCE biodegradação Esta tabela foi modificado a partir de Guerrero-Barajas et ai (2014) * TCE concentração inicial:.. 300 uM. Os dados apresentados são a média e desvio padrão de n = 3.
Após o ensaio de redução de TCE, os resultados para a redução do sulfato, sulfeto de concentração, o consumo de COD e variações de pH ao longo do tempo são apresentados na Figura 6B. Estes resultados mostram que o sulfato foi reduzida em 5 h e a concentração de sulfureto atingiu 1.400 ± 35 mg / L, juntamente com uma redução da actividade de sulfato248 ± 22 mg COD-H 2 S / g VSS * d. O ligeiramente superior sulfato de redução da atividade - em comparação com 188 ± 50 mg COD-H 2 S / g VSS * d - indica que a comunidade microbiana não foi inibida pelo TCE.
Os resultados sobre os microorganismos identificados na lama utilizada neste protocolo são apresentados na Tabela 2. Bactérias redutoras de sulfato, da fermentação de bactérias e as bactérias foram identificadas desalogenação no lodo desenvolvido usando este protocolo. Os resultados não são surpreendentes porque o biorreator estava operando durante um ano sob condições redutoras de sulfato e vários dias com TCE. Gêneros de bactérias, como Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfitobacterium, Clostridium, Dehalobacte r e Sulfurospirillum têm sido relacionados com a redução do sulfato e biodegradação de compostos clorados. Além disso, a identificação destes microorganismos no lodoconfirma que o protocolo teve sucesso no desenvolvimento de uma lama sulfidogenico que pode ser usado para a remoção simultânea de sulfato e tricloroetileno, que é um dos compostos mais clorados tóxicos.
| Bactérias relataram | Alta similaridade | max ident |
| gi | 386685641 Uncultured Desulfovibrio sp. | Desulfovibrio Desulfovibrio | 96% |
| gi | 386685640 Uncultured Desulfomicrobium sp. | Desulfomicrobium norvegicum | 99% |
| gi | 386685639 Uncultured Desulfomicrobium sp. | Desulfomicrobium baculatum | 99% |
| gi | 386685638 Uncultured Desulfomicrobium sp. | Desulfomicrobium hipogeium | 99% |
| gi | 386685637 Uncultured Desulfotomaculum sp. | Acetoxidans Desulfotomaculum | 99% |
| gi | 386685636 Uncultured Clostridium sp. | Celerecrescens Clostridium | 99% |
| gi | 386685635 Uncultured Desulfovibrio sp. | Desulfovibrio halófila | 98% |
| gi | 386685634 Uncultured Dehalobacter sp. | Restrictus Dehalobacter | 99% |
| gi | 386685633 Uncultured Desulfitobacterium sp. | Desulfitobacterium hafniense | 99% |
| gi | 386685632 Uncultured Sulfurospirillum sp. | Multivorans Sulfurospirillum | 97% |
| gi | 386685631 Uncultured Sulfurospirillum sp. | Halorespirans Sulfurospirillum | 97% |
Tabela 2. Consórcio identificado no lodo do biorreactor e a sua semelhança com outras bactérias Max ident:. Identidade máxima.
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Discussion
Existem várias aplicações de sulfidogenesis em biotecnologia ambiental, uma das aplicações mais utilizadas do metabolismo de bactérias redutoras de sulfato em consórcios com bactérias fermentadoras está em tratamento de águas residuais. Reatores UASB estão entre as principais abordagens de engenharia para tratamento de efluentes industriais com elevadas concentrações de sulfato. Neste trabalho, apresentamos um protocolo para obter lodo sulfidogenico de sedimentos marinhos em um reator UASB. Os passos críticos no âmbito do protocolo para a obtenção de uma lama sulfidogenico de sedimentos marinhos são: (1) promover a homogeneidade da amostra de sedimento para ser colocado no reator, (2) que alimenta a concentração certa de ácidos sulfato e graxos voláteis (COD / SO 4 2-) relação, (3) análise do sulfato, sulfeto, COD e pH periodicamente, (4) refrescar o meio basal, o qual contém traços de metais e vitaminas cada vez que um lote é iniciado. É importante ter em conta que o desenvolvimento da sludge depende muito da comunidade microbiana da amostra original e sobre os balanços de massa direita (sulfato e DQO). Embora leva tempo para o sulfato de reduzir a atividade a desenvolver, o biorreator requer monitoramento contínuo para evitar vazamentos, acidentes ou temporais falta de energia que podem parar a bomba de recirculação ou desligar o controle de temperatura. Especial atenção deve ser pago no exercício da análise de sulfeto, sulfato e DQO.
Sedimentos marinhos, em geral, são uma fonte natural de uma grande variedade de microorganismos; é provável que as lamas podem ser formados com sedimentos marinhos provenientes dos diferentes profundidades. Neste protocolo optou-se por utilizar sedimentos marinhos hidrotermais por duas razões principais: (1) estas aberturas rasas estão localizados perto do custo e (2) este tipo de sites são mais abundantes em sulfetos, que é uma indicação de redução de sulfato e por conseguinte, de a presença de bactérias redutoras de sulfato. Se qualquer coisa, tomar as sedimento de estuáriots de qualquer outro lugar do chão submarino só vai precisar de mais tempo para o lodo de desenvolver, apesar de acharmos que isso é muito improvável.
Além disso, é necessário levar a cabo vários testes de redução do TCE para promover a presença de microorganismos de desalogenação no lodo a ser ainda identificados seguindo o procedimento sugerido neste protocolo ou qualquer outra técnica de biologia molecular. É importante considerar que o desenvolvimento de microorganismos de desalogenação também depende da fonte do lodo, embora a literatura refere-se a presença deste tipo de microrganismos em diversos sedimentos do mar ao redor do mundo 7. Um ensaio de actividade redutoras de sulfato é recomendado após a exposição das lamas para o composto tóxico, a fim de avaliar a viabilidade das lamas sulfidogenico após uma condição stressante, por exemplo, a presença de TCE. Se o sulfato de actividade redutora da lama diminui será necessária para mantê-lo several semanas de um modo descontínuo alimentado com sulfato de COD e de novo para promover o aumento da actividade redutora de sulfato. Isto pode ser feito seguindo os passos sugeridos no protocolo para promover sulfidogenesis e crescimento dos microrganismos. É importante mencionar que foi tentado obter uma lama sulfidogenico-desalogenação por adição de sulfato de TCE e desde o início da cultura dos sedimentos, mas nenhuma actividade (quer redutoras de sulfato ou desalogenação) nunca foi observada. Supunha-se que o baixo teor de microorganismos presentes nas fases iniciais da cultura não toleram o TCE (mesmo na concentração de 20 uM), no entanto, a adição de TCE desde o início do enriquecimento pode sempre ser tentada com outros sedimentos.
Um bom resultado neste caso a redução foi de TCE de eteno, no entanto, dependendo dos microorganismos que poderia ter desenvolvido no lodo a redução de TCE pode produzir principalmente dichloroethenes e vincloreto de ilo (VC). Neste caso, os dados obtidos para a redução TCE foram registados após cada ciclo de HRT no biorreactor em vez da deposição de TCE e os seus produtos intermédios constantemente durante o ensaio. Foi feito desta maneira, a fim de evitar a evaporação dos compostos clorados de amostragem devido a frequente. Portanto, não há gráficos de concentração de TCE ao longo do tempo para mostrar, mas as concentrações no final de cada experiência. É importante para evitar a evaporação dos compostos clorados voláteis para relatar concentrações precisas de eles e para distinguir se as alterações podem ser atribuídas a redução biológica em vez de perdas. A presença de etileno e a ausência de intermediários comuns de TCE, tais como cis -1,2-dicloroetileno nos produtos finais após a redução TCE é particularmente interessante. Sempre foi relatado que a redução completa do TCE para etileno pode ser levada a cabo apenas por Dehalococcoides sp. E, neste caso estes microorganismos não foram detectados entre os gêneros identificados no lodo. Atribuímos a redução TCE para o co-metabolismo que pode ter surgido no lodo entre os dehalorespiring, a fermentação eo bactérias redutoras de sulfato. Uma deficiência do consórcio é que promove a formação transitória de VC, um composto mais tóxico do que o TCE, no entanto, está presente em concentrações relativamente baixas. Pode ser possível dizer neste ponto que uma actividade muito invulgar cometabolic foi desenvolvido pelo consórcio e que uma nova via redução TCE sob condições redutoras de sulfato pode ser adicionalmente investigada, na presença dos microrganismos halorespiring identificadas neste trabalho. Por outro lado, tem sido relatado previamente que os genes de desalogenação são frequentemente detectadas em sedimentos marinhos do subsolo, mas não existem relatórios sobre TCE biodegradação com sedimentos submarinos combinadas com condições redutoras de sulfato, isto é, utilizando-se sulfato de sódio como um aceitador de electrões alternativo.
Uma das limitações deste método é que a estrutura da lama depende das características físicas do sedimento utilizado e, embora neste método a lama formada permitiu uma boa fluidização do reactor e a formação de biofilme sobre o vidro, que não se pode prever como que seria realmente trabalhar usando sedimentos de diferentes locais. Pode ser possível a utilização de reactores mais pequenos para conduzir testes preliminares ese observar que é viável. Se a intenção é operar com a lama em um biorreator, nós não recomendo começar com microcosmos. A sugestão é definido no reactor desde o início, embora com um menor volume para a primeira tentativa.
O método aqui apresentado é significativo pelo facto de a lama formada tolera concentrações de sulfureto mais elevadas do que outros tipos de lamas sulfidogenico que são obtidos através da adaptação de lamas granulares metanogênica para sulfidogenesis. O método promove a formação de uma lama com um consórcio que inclui bactérias redutoras de sulfato e bactérias que fermentam e é facilmente adaptado para biodegradar compostos tóxicos. Neste protocolo, o TCE utilizado como um exemplo de um composto tóxico que só foi biodegradado sob condições metanogénicas em reactores UASB. Por exemplo, se a finalidade do reactor é para biotransformar solventes clorados, poderia ser útil para aumentar gradualmente a concentração do solvente, isto é, TC maiorE concentração nos testes, enquanto diminui a concentração de sulfato de estimular desalogena�o sobre a redução do sulfato. Embora, de acordo com os resultados obtidos no presente trabalho, nós ainda pensam que o sulfato não pode ser completamente removido da cultura, se as condições redutoras de sulfato são desejáveis. Além disso, condições redutoras de sulfato deve ser mantida desde alguns dehalorespirers também são redutores de sulfato. As lamas geradas nas condições descritas no presente protocolo, eventualmente, pode ser usado para remover simultaneamente COD, sulfato, compostos clorados tóxicos e metais pesados. Os metais pesados podem precipitar com o sulfureto produzido pelo lodo.
Por fim, a lama sulfidogenico formado pode ser testada para: (1) a tolerância das concentrações de sulfureto mais elevadas (por exemplo, para precipitar metais pesados), (2) a biodegradação de outros poluentes orgânicos, ou (3) o consumo de hidrocarbonetos como doadores de electrões em vez de ácidos graxos voláteis para further explorar suas aplicações em biotecnologia ambiental. É importante ter em conta que uma vez que o lodo é formada ela pode ser usada como semente para inocular lamas outros reactores. Nesse caso, o processo de redução de sulfato ocorrerá imediatamente e, portanto, não vai ser necessário esperar um ano para operar totalmente o bioreactor.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trichloroethylene | sigma Aldrich | 251402 | |
| cis-1,2-dichlorotehylene | sigma Aldrich | ||
| trans-1,2-dichloroethylene | sigma Aldrich | D-62209 | |
| vinyl chloride scotty standard | supelco | 1,000 ppm v/v in nitrogen | |
| ethene scotty standard | supelco | 99% purity | |
| pump | Masterflex | Model 7553-75 | |
| spectrophotometer | any | ||
| microcentrifuge | any | ||
| gas tight syringes | any | 100 and 200 microliters | |
| UASB glass reactor | any | under design | |
| gas chromatograph | any | FID detector | |
| capillary column SPB-624 | supelco | ||
| pH meter | any | ||
| viton tubing | Masterflex | ||
| basal medium reagents | any | ||
| trace metals reagents | any | ||
| vitamins solution reagents | any | ||
| sodium sulfate | any | ||
| volatile fatty acids | any | ||
| COD determination kit | HACH | range 0-15,000 mg/L | |
| TOPO-TA cloning kit pCR®4.0 | Invitrogen, US | ||
| S.N.A.P. TM Miniprep Kit | Invitrogen, UK | ||
| Pure link TM Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen |
References
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