Introduction
一对环境生物技术的最重要的贡献是生物反应器，其中使用（接种物）的污泥能够硫酸盐还原条件下进行的设计。硫酸盐还原（SR）允许含有除同时除去COD，重金属和有机污染物，这一事实使SR中的污泥1的期望特性的高浓度硫酸的废水流的治疗。废水污染硫酸的一些例子来自制革，造纸，医药，化工等制造行业1。然而，大多数的文献是指sulfidogenic污泥时产甲烷颗粒污泥已适应sulfidogenesis 2。这种适应是通过操纵COD / SO 4 2-比在生物反应器和添加的化学品，以抑制在污泥2,3甲烷通常达到。除了长的时间是m唉要求sulfidogenic颗粒的形成中，甲烷和硫酸盐还原和污泥的高浓度硫化物的公差之间的竞争，是一些主要问题，如果是从适应获得在生物反应器中使用的sulfidogenic污泥可能出现主要产甲烷污泥硫酸盐还原条件。在这项工作中，我们描述的方法在上流式厌氧污泥床反应器（UASB），以获得从热液喷口沉积物（蓬美达，纳亚里特，墨西哥）主要为sulfidogenic污泥，然后我们评估它的硫酸盐还原活性随着时间的推移，进行了一个实验以评估其对还原脱氯的应用。被选择的沉积物的位置，因为它已被报道，在该网站有形成硫化物由于通过微生物群落栖息该特定地方4呈现的硫酸盐还原活性。
有SEVER人的优势获得沉积物这sulfidogenic污泥在适应产甲烷颗粒污泥sulfidogenesis。其中的一些优点是：（1）这是没有必要以形成颗粒的生物反应器进行操作，（2）将污泥容忍较高浓度硫化物的相比更为UASB与适于甲烷污泥操作，和（3）有用即使乙酸的用量为包含在培养基中以促进污泥的形成挥发性脂肪酸的混合物甲烷为基片没有竞争。
此步骤，以促进sulfidogenesis因为海洋沉积物有各种各样，如硫酸盐还原菌，发酵菌和细菌脱卤，只是仅举几例5,6微生物的天然泳池。财团从海洋沉积物开发利用这一协议的类型可能会出现在硫酸盐还原，因此，高的工作效率 ulfate还原活性随着时间的推移和更高的耐受性硫化物的浓度比报告为有毒的产甲烷菌和硫酸盐还原菌更高。另一方面，它很可能是该脱卤能力由以下此处协议提议的，但它可以取决于原始微生物群落也示于沉积物。这种假设是基于这样还原脱氯可以通过呼吸或共代谢发生的事实完成的，这两个条件，可能会在海洋微生物群落7得到提升。沉积物以获得污泥的培养物通过使用乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐的混合物作为底物，因为这些挥发性脂肪酸所使用的几株硫酸盐还原细菌的进行。这些酸也经常发现在海洋沉积物碳化合物的种类，根据在文献中关于碳质材料在海沉积物5,6-若干报告。
内容“>最后，一些被发现在地下水和其他水体，世界各地的最有毒化合物是氯化溶剂，如三氯乙烯（TCE）或全氯乙烯（PCE）。这些化合物是有毒的，不仅对人，而是还对微生物，特别是三氯乙烯，这仍然是在美国被认为是优先的污染物由环境保护局8。在这项工作中，我们提出，是在一个实验，其中sulfidogenic污泥减少TCE浓度的其能力进行测试系列报道的甲烷条件下，9,10含氯化合物生物降解性。值得一提的是，大多数的含氯化合物的生物降解研究已经甲烷条件9,10下进行的。我们认为，实验TCE在该协议提出的是一个的污泥的潜在应用很好的例子。该实验的目的是到e计价污泥的三氯乙烯和对硫酸盐还原活性的三氯乙烯效果的耐受性。考虑到最上氯化化合物的生物降解研究的是甲烷条件下进行的，该协议建议一个油泥的产生可以被用来同时：（1）除去硫酸，（2）除去COD和（3）除去氯化合物。进一步的步骤可以是评价对同时除去三氯乙烯和重金属的污泥（除了硫酸盐和COD），这是不能被甲烷条件下评价两个条件。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
图1.方案协议的步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。
1.收集海洋沉积物对污泥的形成
- 确定一个平易近人海底区域或者靠近热液喷口（由于硫化物的存在下，这可能表明较高的硫酸盐还原活性），或者一个区域，其中的有机物质碎片是可检测的。
- 对于这项工作的目的，需要约3或4千克沉积物和漏水关样品。是在暗塑料袋样品。无需进行制冷。
- 一旦在实验室中，保持与样品袋在冰箱，如果他们不打算立即使用。对于这项工作，桑普的目的LES可在冰箱几个星期或几个月使用它们之前。
- 取沉积物样品（即1或2公斤）的很大一部分，并使用适当的筛目（0.2厘米）从沉积物中的大碎片含碳材料可被发现或一些岩石可能存在消除。
注意：在这种情况下0.20厘米直径（在0.0767）的网眼被用于，但它可以根据样品中的颗粒的尺寸是不同的尺寸。- 传递沉积物通过网后，混合选择，以促进该部分是均匀的部分。
- 取分离更小的样品（即，2至3克）通过以下的标准方法11，以确定挥发性悬浮固体（VSS）的内容。
注： 参见图2步骤1.2至1.4。
图2.照片中的沉积物样品。（一）沉积物样品刚过上当受骗。（B）沉积物样品通过网格后。（C）样品采取称重之前，挥发性悬浮固体（VSS）的决心。在培养皿中不需要进行消毒。 请点击此处查看该图的放大版本。
2.生物反应器设置
- 对于这项工作的目的，使用的UASB反应器中的玻璃带3 L的总工作容积或者，使用1或2升容积玻璃反应器中。
- 基于所述沉积物的VSS含量计算沉降物的数量被用作接种物，得到5克的VSS在1升
- 考虑到，如果沉积物计算后的量太大时，生物反应器的再约25％至30％的体积应当由沉积物代替占据。
- 记录，因为它的VSS内容将改变时，微生物群落富集的生物反应器。需要在VSS含量为硫酸盐的计算降低生物反应器中的活性。
- 确保生物反应器中的基础培养基和缓冲溶液的最终浓度是类似于所报告的格雷罗哈斯等 。 （2014）12。
- 确保沉积物，基本培养基，缓冲溶液和挥发性脂肪酸的最终体积是等于反应器中的最终工作体积。基础培养基配方12含有适当浓度的痕量金属和维生素溶液。
- 制备基础培养基和缓冲液的储备溶液在适当的浓度为反应器所用的工作体积（即，2，3或4倍比报道的步骤2.4更浓缩的），以确保当它被稀释，它是在报告的格雷罗-巴拉哈斯等的浓度。 （2014年）12）。
注意：储备溶液的基础培养基是总是必要的，然而，缓冲溶液时，才需要在启动时。它没有必要在此时间后添加缓冲溶液。 - 制备的挥发性脂肪酸的原液：在2.5乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐：1：1比例的COD。考虑到为计算的乙酸钠包括在基础培养基。在反应器中的最终的COD浓度必须2.7克/升。
注意：准备这个解决方案在通风橱中。穿腈手套和护目镜此溶液的制备。考虑到硫酸与挥发性脂肪酸的反应， 示于图3的化学计量。 - 制备的硫酸钠在适当浓度的储备溶液（ 用 Na 2 SO 4），可提供到反应器中的4000毫克/升的硫酸根离子（SO 4 2-）的终浓度。可替代地，包括第硫酸盐在基础培养基所需的，而不是只要由一个储液加入其作为最终硫酸盐电子量（SO 4 2-）的浓度是合适的。
- 放置在反应器中与基础培养基的一部分混合，沉积物，以确保它们到达反应器的底部。
- 添加与挥发性脂肪酸溶液和硫酸溶液混合的基础培养基和缓冲溶液的其余部分。确保的挥发性脂肪酸的溶液倒入液体。注意：进行这个步骤在通风橱中。
- 设置的连接和该反应器的管道，以再循环泵。设定再循环流速为60毫升/分钟。在34°C在设定温度室的生物反应器。定期检查温度变化小（ 即 34±1.7°C）
- 设置连接到气体位移列。
注： 参见图4的步骤2.1至2.5。 </ OL>
图3.化学计量硫酸盐还原VFA（乙酸，丙酸和丁酸）的。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. UASB反应器。（A）初始时间。（B）连续政权在300天的运行中。 请点击此处查看该图的放大版本。
3.操作反应器的促进Sulfidogenesis微生物和生长
注意：允许用于接种物消耗购买Volatile脂肪酸和硫酸。为了这个目的，等待一个星期进行为硫酸盐，硫化物和COD消耗首次分析。
- 后孵育1周采取的5至7毫升液体的样品进行分析，化学需氧量，硫酸盐和硫化物含量和pH下述标准方法11,13。
- 通过以下亚甲蓝方法13分析硫化物在液体分光光度计（在670纳米的波长（λ））。
- 放置5毫升乙酸锌溶液（2％w / w的）在25毫升容量瓶中，加迅速加入200μl样品到醋酸锌溶液。
- 加入2.5毫升N，N-二甲基对苯二胺草酸（DMP）溶液（0.2％w / w的20％ 的 H 2 SO 4）和125微升铁（III）硫酸铵溶液（10％重量/的瓦特在2％的H 2 SO 4）并完成与蒸馏水25毫升的容量瓶中。等待30分钟的反应发生，时间在其中蓝色颜色是稳定的。13。
注：等待至少15分钟，但不超过60分钟，以测试样品中的分光光度计。进行在分光光度计蓝色最终溶液的读数。
- 根据标准方法11分析干燥。这里，通过使用比浊法量化硫酸硫酸钡。
- 放置5毫升的调理溶液（盐酸盐酸1：1）在25毫升容量瓶中，加入1毫升先前离心样品（在11320×g）中，完成将25ml量瓶中，用蒸馏水和加1克氯化钡。
- 混合在一涡旋1分钟的溶液中。等待4分钟的硫酸钡，以形成与读取在分光光度计的样品在420纳米11一个波长（λ）。
- 根据标准方法分析11的COD。或者，使用COD Determina的化套件。
- 在此之前的COD测定，彻底离心样品（在11320 XG）除去剩余的硫化物，可能会干扰测定。如果需要的话，离心两次：第一次立即服用样品和第二时间之后等待6或8小时，然后进行分析的COD。
- 加2ml样品与COD测定试剂盒的反应小瓶中，密封该小瓶并均化通过温和搅拌该混合物。制备一个空白加入2毫升蒸馏水至另一个反应瓶中并均化混合物。
- 放置在消化反应器中的小瓶，在150℃进行2小时。取出小瓶，让他们在黑暗中冷却下来。采取在分光光度计小瓶的读数在620纳米的波长。
- 获得从气体置换柱的气体体积。
- 通过以下亚甲蓝方法13分析硫化物在液体分光光度计（在670纳米的波长（λ））。
- 最多等待另一个5到7天，直到硫酸的消耗。硫酸和COD必须在被消耗前pproximately 85％至90％，开始一个新的补料分批。
- 一旦硫酸（和COD）的消耗，完全重复步骤2.4。供应新鲜培养基和营养物的新为每批次。
- 重复步骤3.1和3.2。在这一点上每批次之间应该7天和10天持续。
- 当3〜4批已全部完成，重复步骤2.4，但会增加COD浓度为4克/升。
- 重复步骤3.1和3.2的步骤。
- 重复步骤3.3，但增加的COD浓度，以6克/升。
- 重复3.6和3.6.1逐渐增加COD浓度，直到它为10克/升。
注意：请呈现硫酸浓度（mg / L）与时间（d）该曲线图。
- 当硫酸盐消耗量是80％以上，不到24小时，出现这种情况的一个多星期，开关在反应器的操作，以连续模式。对于连续模式中设置的水力停留时间（HRT），在24小时，并保持硫酸盐浓度在4克/升和COD的以10克/升。
注：随着时间的推移硫酸盐消费量应 速度更快。
4.硫酸盐还原活性测试
- 在此之前，测试确保连续制度下，生物反应器呈现在硫酸盐浓度剩余小于10％的变化。
- 在任何给定的一天后，其中HRT周期和行为的步骤2.4停止反应器。对于步2.4.3用10克/升的COD浓度。
- 一旦在生物反应器被供给，需要5到7 ml的样品的液体和化学需氧量，硫酸盐，硫化物（步骤3.1）和pH每小时执行分析。记录产生的气体量。
- 计算硫酸根据文献14还原活性。
SRA =硫酸盐还原活性（毫克COD-H 2 S）/ gVSS量* D
米H 2 2 S
VSS =挥发性悬浮固体浓度
T =时间（D或小时）
- 作出这样的显示硫酸盐消耗量与硫化物浓度的百分比随时间以mg / L对应的图形。使该显示的COD消耗随时间的百分比的曲线图。制作，显示随着时间的推移pH值变化的曲线图。
5，三氯乙烯（TCE）还原试验
- 在此之前，测试确保生物反应器正在连续制度下，并提出在硫酸盐浓度剩余小于10％的变化。不启动此测试如果硫酸盐还原生物反应器中低于90％。
- 制备的三氯乙烯考虑到在生物反应器的液相中该化合物的最终浓度必须为300微米的储备液（TCE）。考虑partitioniNG使用Henry's法因次常数（H'）的TCE在34°C的化合物的顶空。 H'at 34℃，TCE为0.4722。
注意：准备这个解决方案在通风柜和戴手套和护目镜。- 例如，对于一个5000微米原液，计算如下：
TCE气相浓度=（0.4722）*（5000）= 2139微米。包括这个浓度，因为这一数额TCE将是在顶空原液的制备。
然后，在原液中的液体（水），实际的TCE的浓度将是：5000 + 2139 = 7139μM。 TCE密度=1.43克/毫升。转换7139微米为mg，然后通过使用三氯乙烯的密度计算的TCE为原液的体积。
注：的TCE原液米浓度唉低于5000微米， 即 3000或1000微米，这取决于如何将该溶液的体积太大，根据其液相体积可以被传递至生物反应器。
- 例如，对于一个5000微米原液，计算如下：
- 制备标准曲线，在气相色谱仪的三氯乙烯， 顺 -1,2-二氯乙烯， 反式 -1,2-二氯乙烯，氯乙烯和乙烯。通过以下在5.2的三氯乙烯原液描述的相同方法制备的顺式 -1,2-二氯乙烯，反式-1,2-二氯乙烯的标准曲线从这些化合物的贮备液。通过从标准（气瓶）稀释每种气体的浓度制备氯乙烯和乙烯的标准曲线。
- 制备这些化合物的标准曲线的范围内的20至300微米。使用报告格雷罗-巴拉哈斯等人的方法 。 （2011）15，用于这些化合物在气相色谱仪的分析。
注意：这些准备站在通风柜ARD解决方案，并戴上手套和护目镜。
- 制备这些化合物的标准曲线的范围内的20至300微米。使用报告格雷罗-巴拉哈斯等人的方法 。 （2011）15，用于这些化合物在气相色谱仪的分析。
- 在任何给定的一天后，其中HRT周期和行为的步骤2.4停止反应器。对于步2.4.3用10克/升的COD浓度。
- 一旦在生物反应器被供给，直接添加到三氯乙烯中的液体从在5.2制备的原液的生物反应器，生物反应器中的液相中的最终的TCE浓度必须为300μm。水力停留时间设定为12小时。
- 在一个HRT周期结束取液（500〜1000微升）和行为分析的COD，硫酸盐和硫化物的样品（步骤3.1.1，3.1.2和3.1.3）。取的顶部空间（100〜250微升）的样品，并进行分析，三氯乙烯，顺-1,2-二氯乙烯， 反式 -1,2-二氯乙烯，氯乙烯和乙烯在气相色谱仪。
- 重复步骤2.4。对于步2.4.3用10克/升的COD浓度。
- 不要重复任何TCE还原试验，直到生物反应器中呈现超过900硫酸盐0％减少和较少的10％的变化两者，硫酸盐还原和硫酸中剩余的生物反应器。
- 重复5.4，5.5和5.6两三次以上。
- 取沉积物样品（0.5克）只需经过TCE减少测试完成后进行鉴定微生物。经过2或3 TCE减少测试执行此操作。
6.硫酸盐还原TCE实验后还原活性测试
- 完全重复步骤4。
7.鉴定微生物
- 取各得到大约0.5g污泥样品，并按照标准方法进行12总RNA提取。
- 扩增16S rRNA基因用反转录，并进行聚合酶链反应（RT-PCR）扩增一个步骤12。
- 设计引物扩增或作为初始的方法使用那些在文学11建议。按照amplif在文学12 ication程序建议。
- 构建的16S rRNA库。 PCR扩增子可以通过使用克隆杰11被克隆。通常情况下，从各板（各菌落代表一个PCR产物）10个菌落可以克隆。根据在文献12提出的程序制备的质粒DNA进行测序。
- 进行片段的测序。根据在文献中12建议的程序重新扩增大约1400 bp的对PCR外部产物与先前描述的方案进行PCR扩增（步骤7.4）和克隆。隔离来自大肠杆菌的质粒大肠杆菌菌落如文献12建议。不要进行部分程序进行测序应用M13通用引物12。
- 进行序列分析。通过使用Clustal X对齐的核苷酸序列，并在文本编辑器中手动调整。执行NCBI databas的BLAST搜索即（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）12。
- 得到的核苷酸序列的登录号。沉积下的对应登录号（即，JQ713915eJQ713925从扩增子序列）12确定在EMBL核苷酸序列数据库（根银行/ EMBL / DDBJ） 克隆的核苷酸序列。
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Representative Results
的生物反应器中硫酸盐还原的典型行为示于图5。注意到，在硫酸操作减少第一周将是缓慢的是很重要的。然而慢，硫酸随时间的90％以上的消耗表明接种物正在开发的微生物群落能够减少干燥并因此，富含硫酸盐还原菌。图中的不同时期表明，硫酸盐还原反应增加其速度随时间。在开始时，批料用了20天的硫酸将减少（期间I）中，那么它的降低率正在增加，这需要大约10天减少进食硫酸盐（第二时期）。时期III中更少的变化在硫酸盐还原并且这实现了在平均10天，因为它被认为是在图5中 。在此期间后，硫酸盐的还原了的4天（周期Ⅳ）的平均和在期间V 4000毫克/升的硫酸被消耗在不到24小时。在生物反应器的性能进行了下连续模式设置经过200天的24小时停留时间。
图5.硫酸盐（SO 4 2-）的浓度随时间期间sulfidogenic泥形成生物反应器中的连续线是指进水硫酸盐浓度。正方形是指硫酸盐浓度在流出物中。这个数字已经被来自格雷罗州-巴拉哈斯等人 （2014年）12与相应的版权许可。 请点击此处查看该图的放大版本。
随着时间的推移硫酸盐还原，硫化物浓度，化学需氧量消费和pH值的变化代表了良好的效果是SH自己的在图6A中。这些结果表明，在一次进行的生物反应器是连续的制度下，几乎一年的实验获得。在这一点上的微生物群落，开发在生物反应器和形成一个黑色油泥，因为它可以在图4B中可以看出。 在图6A中，可以看出，硫酸盐减少在4小时和硫化物达到1200±30毫克/升的最大浓度和188±50毫克的COD-H 2 S /克的VSS *天得到了硫酸盐还原活性。值得一提的是硫化物的生物反应器中获得的浓度被认为是高和有毒的微生物，并在这种情况下，生物反应器没有停止的硫酸盐还原活性。
生物反应器图6.性能之前（A）和（b）后的TCE此外，硫酸盐（SO 4 2-）（◇），硫化物（H 2 S）（•）。提出的数据是n = 3时的平均和标准偏差。这个数字已经被来自格雷罗州-巴拉哈斯等人 （2014年）12与相应的版权许可。 请点击此处查看该图的放大版本。
对于其中污泥的能力进行测试，以降低三氯乙烯的实验，得到的结果示于表1中。将硫酸盐还原得到的活性比的三氯乙烯加成之前所获得的和三氯乙烯约80％降低到略低乙烯（ 见表 1）。这些结果应根据时间，其中反应器已被硫酸盐还原条件下操作的预期。这是不可能发生的TCE减少，如果污泥时拍摄该反应器在时期I或II操作（见图5
| 参数 | 传统文化表现形式还原试验中的应用价值 | ||
| 的SO 4 2-去除率（％）比例 | 98（±0.06） | ||
| 硫化物（H 2 S）浓度（mg / L）的 | 971（±72） | ||
| 转化的SO 4 2-的百分比成 H 2 S（％） | 68（±2） | ||
| COD的去除率比例（％） | 93（±0.1） | ||
| pH范围 | 7.1 - 7.7 | ||
| 天然气产量（毫升/天） | 200（±55） | ||
| 硫酸盐还原活性（毫克COD-H 2 S / G VSS * D） | 161（±7） | ||
| * TCE终浓度（μM） | 77（±8） | 氯乙烯浓度（μM） | 16（±0.3） |
| 乙烯浓度（μM） | 202（±81） | ||
| 的TCE去除比例（％） | 74.3（±14） |
表1的结果对sulfidogenic污泥的TCE生物降解实验过程中的表现该表已经被修改格雷罗-巴拉哈斯等人 （2014）* TCE初始浓度：300微米。呈现数据是平均值和n = 3的标准偏差。
TCE的还原试验后，其结果为硫酸盐还原，硫化物浓度，COD消耗和pH随时间的变化示于图6B。这些结果表明，硫酸降低在5小时和硫化物浓度达到1400±35毫克/升，以及一个硫酸盐还原活性248±22毫克COD-H 2 S / G VSS * D。稍高的硫酸盐还原活动-与188±50毫克COD-H 2 S / G VSS * D相比-表明微生物群落不是由TCE抑制。
结果就在该协议中使用的污泥中标识的微生物列于表2。硫酸盐还原菌，发酵菌和脱卤细菌中通过使用该协议制定的污泥识别。结果并不令人惊讶，因为生物反应器是在一年操作下硫酸盐还原条件和若干天TCE。细菌如脱硫，Desulfomicrobium，Desulfitobacterium，梭状芽孢杆菌，Dehalobacte r和Sulfurospirillum的属已涉及到硫酸盐还原和氯化合物的生物降解。此外，这些微生物的污泥中的识别确认该协议成功地开发一个sulfidogenic污泥可用于同时去除硫酸钠和三氯乙烯，这是最毒的氯化合物中的一个。
| 细菌报道 | 很高的相似性 | 最大的ident |
| GI | 386685641未培养脱硫菌。 | 脱硫脱硫弧菌 | 96％ |
| GI | 386685640未培养Desulfomicrobium藻。 | Desulfomicrobium norvegicum | 99％ |
| GI | 386685639未培养Desulfomicrobium藻。 | Desulfomicrobium baculatum | 99％ |
| GI | 386685638未培养Desulfomicrobium藻。 | Desulfomicrobium低geium | 99％ |
| GI | 386685637未培养脱硫肠菌。 | 脱硫肠acetoxidans | 99％ |
| GI | 386685636未培养梭菌属。 | 梭菌celerecrescens | 99％ |
| GI | 386685635未培养脱硫菌。 | 嗜盐脱硫 | 98％ |
| GI | 386685634未培养脱卤菌属 。 | 脱卤restrictus | 99％ |
| GI | 386685633未培养Desulfitobacterium藻。 | Desulfitobacterium hafniense | 99％ |
| GI | 386685632未 培养Sulfurospirillum藻。 | Sulfurospirillum multivorans | 97％ |
| GI | 386685631未培养Sulfurospirillum藻。 | Sulfurospirillum halorespirans | 97％ |
表2.财团确定在生物反应器的污泥和其相似的其他细菌最大的ident：最大同一性。
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Discussion
有sulfidogenesis的环境生物技术多个应用程序，硫酸盐还原细菌的代谢的最常用的应用程序在财团与发酵菌是在废水处理中的一个。 UASB反应器是主要的设计方法，以工业废水处理与硫酸盐高浓度之间。在这项工作中，我们提出了一个协议，以获得从海洋沉积物sulfidogenic污泥的UASB反应器。在协议中的关键步骤，以从海洋沉积物获得sulfidogenic污泥是：（1）促进沉积物样品的的同源被放置在反应器中，（2）进料的硫酸盐和挥发性脂肪酸的权利浓度（COD / SO 4 2-）的比，（3）分析该硫酸盐，硫化物，COD和pH值周期性地，（4）刷新基础培养基，它包含痕量金属和维生素每一个批次开始时间。考虑到，sludg的发展是非常重要的ê在很大程度上取决于原始样品的微生物群落，在右侧质量平衡（硫酸和COD）。虽然这要花费时间硫酸盐还原活性的发展，生物反应器需要连续监测，以避免泄漏，事故，或颞精神不振可能会停止再循环泵或关闭温度控制。必须特别注意在硫化锌，硫酸和COD分析的性能支付。
一般海洋沉积物是各种各样的微生物的天然来源;它很可能是污泥可以与来自不同深度采取海洋沉积物形成。在这个协议中有人选择用热水海洋沉积物中，主要有两个原因：（1）这些浅通风孔位于接近成本和（2）这些类型的网站都在硫化物更丰富，这是硫酸盐还原的指示和硫酸盐还原细菌的存在的，因此，。如果有什么事情，走的是sedimen从海底地面的任何其他地方TS只需要更多的时间进行污泥的发展，虽然我们认为这是非常不可能的。
此外，有必要进行一些三氯乙烯减少测试，以促进脱卤微生物的存在在污泥通过按照此协议，或任何其他分子生物学技术建议的程序来进一步鉴定。考虑到脱卤的微生物的发展也取决于污泥的来源上是很重要的，虽然文献指这类微生物在几个海沉积物的存在世界7周围。污泥对有毒化合物的曝光后甲硫酸盐还原活性测定法，建议为了后紧张条件，例如三氯乙烯的存在来评价sulfidogenic污泥的生存能力。如果污泥硫酸盐还原活性降低，有必要保持其ševeral周以间歇方式供给用硫酸和COD再次促进硫酸盐还原活性的增加。这可以通过以下中的协议建议促进sulfidogenesis微生物和生长的步骤来完成。重要的是要提的，它是试图通过自沉积物的培养开始加入三氯乙烯和硫酸获得sulfidogenic，脱卤污泥是很重要的，但没有任何活动（无论是硫酸盐还原或脱卤），是有史以来观测到。据推断，存在于培养没有耐受TCE（甚至在20μM的浓度）的早期阶段微生物的含量低，但是，由于富集的开头加入三氯乙烯总是可以与其它沉积物企图。
良好的效果在此情况下是三氯乙烯与乙烯的减少，然而，这取决于可能已经开发在污泥TCE的还原可产生主要dichloroethenes和VIN微生物基氯（VC）。在这种情况下，对于三氯乙烯减少所获得的数据不断在测试期间记录每HRT循环在生物反应器，而不是采样为三氯乙烯和其中间产品之后。据以这种方式，由于频繁的采样做是为了避免氯化合物的蒸发。因此，不存在图TCE的浓度随时间的显示，但该浓度在每个实验结束时。为了避免挥发性氯化化合物的蒸发来报告它们的准确浓度和区分，如果变化可以归因于生物还原，而不是损失是很重要的。乙烯的存在和不存在的TCE共同中间体，如顺式 -1,2-二氯乙烯在最终产品后的三氯乙烯减少是特别有趣的。它一直报道，完整的三氯乙烯减少至乙烯可以进行只由Dehalococcoides藻。在这种情况下，这些microorga共享机制未在污泥中确定的属间检测到。我们认为在三氯乙烯减少至可能出现在dehalorespiring，发酵和硫酸盐还原细菌中的污泥中的共代谢。在此财团的缺点在于它促进瞬态形成VC，化合物比TCE更毒的，但是，它是存在于相对较低的浓度。有可能在这一点上，一个非常不寻常的共代谢活性通过财团和，根据硫酸盐还原条件一个新的TCE还原途径可以进一步研究了在该工作中所确定的halorespiring微生物的存在开发的话。另一方面，已经以前报道，脱卤基因在地下海洋沉积物经常检测到，但也有对TCE的降解没有报道与海底沉积物结合硫酸盐还原条件下，这是使用硫酸作为备用电子受体。
一个该方法的局限性是，污泥的结构取决于所用的沉降物的物理特性，虽然在该方法中形成的污泥所允许的反应器中并形成生物膜在玻璃的一个良好的流化，我们无法预测如何它实际上工作中使用不同位置的沉积物。有可能使用更小的反应器，以进行初步测试和观察，如果它是可行的。如果目的是要与污泥在生物反应器进行操作，我们建议不要开始缩影。该建议是从一开始就设置在反应器，虽然是对在第一次尝试一个更小的体积。
这里介绍的方法是在所形成的污泥容忍更高硫化物浓度高于那些通过甲烷颗粒污泥到sulfidogenesis适应获得的其他sulfidogenic污泥显著。该方法促进了形成污泥与财团包括硫酸盐还原菌和发酵细菌和很容易适应生物降解有毒化合物。在这个协议中，我们使用三氯乙烯作为其仅被在UASB反应器甲烷条件下生物降解毒性化合物的例子。例如，如果反应器的目的是为了生物转化氯化溶剂也可能是有用的，以逐步增加的溶剂浓度， 即 ，更高的TC在测试E水平，同时降低了硫酸浓度，刺激脱卤过硫酸盐还原。虽然，根据本工作所获得的结果，我们仍认为硫酸盐不能完全从培养物中取出，如果硫酸盐还原条件是理想的。此外，应维持硫酸盐还原条件，因为某些dehalorespirers也硫酸盐还原。在这个协议中描述的条件下所产生的污泥可最终用于同时去除COD，硫酸盐，氯化有毒化合物和重金属。重金属可以与由污泥产生的硫化物沉淀。
最后，形成在sulfidogenic污泥可用于进行测试：更高硫化物浓度 （如，以沉淀重金属）（1）的耐受性，（2）其他有机污染物的生物降解，或烃作为电子供体（3）的消费代替挥发性脂肪酸来福rther探讨其在环境生物技术的应用。考虑，一旦污泥形成它可被用作种子污泥接种其它反应器是很重要的。在这种情况下，将立即并由此发生的硫酸盐还原过程中，它没有必要等待一年到完全操作的生物反应器。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trichloroethylene | sigma Aldrich | 251402 | |
| cis-1,2-dichlorotehylene | sigma Aldrich | ||
| trans-1,2-dichloroethylene | sigma Aldrich | D-62209 | |
| vinyl chloride scotty standard | supelco | 1,000 ppm v/v in nitrogen | |
| ethene scotty standard | supelco | 99% purity | |
| pump | Masterflex | Model 7553-75 | |
| spectrophotometer | any | ||
| microcentrifuge | any | ||
| gas tight syringes | any | 100 and 200 microliters | |
| UASB glass reactor | any | under design | |
| gas chromatograph | any | FID detector | |
| capillary column SPB-624 | supelco | ||
| pH meter | any | ||
| viton tubing | Masterflex | ||
| basal medium reagents | any | ||
| trace metals reagents | any | ||
| vitamins solution reagents | any | ||
| sodium sulfate | any | ||
| volatile fatty acids | any | ||
| COD determination kit | HACH | range 0-15,000 mg/L | |
| TOPO-TA cloning kit pCR®4.0 | Invitrogen, US | ||
| S.N.A.P. TM Miniprep Kit | Invitrogen, UK | ||
| Pure link TM Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen |
References
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