Introduction
環境バイオテクノロジーへの最も重要な貢献の一つは、（接種材料）を使用した汚泥は硫酸還元条件下で実行することができたしたバイオリアクターの設計でした。硫酸還元（SR）は、COD、重金属や有機汚染物質、SR汚泥1の望ましい特性になるという事実の同時除去に加えて、硫酸塩の高濃度で含有廃水流の処理を可能にします。硫酸で汚染された排水のいくつかの例としては、皮なめし工場、紙、医薬・化学品製造業1から来ます。メタングラニュール汚泥がsulfidogenesis 2に適合されている場合しかし、文献のほとんどはsulfidogenic汚泥を指します。この適応は、一般的に、バイオリアクター内のCOD / SO 4 2-比を操作し、汚泥2,3にメタンを阻害する化学物質を添加することによって達成されます。長い時間メートルに加えて、バイオリアクターで使用sulfidogenic汚泥はの適応から得られた場合AY sulfidogenic顆粒の形成を必要とする、メタン生成菌と硫酸減速や硫化物の高濃度汚泥の許容範囲との間の競合が発生する可能性のある主要な問題のいくつかであります条件を硫酸還元するため、主にメタン生成汚泥。本研究では、我々は時間をかけてその硫酸還元活性を評価し、実験を行う、上向流嫌気性スラッジブランケット型原子炉（UASB）は熱水噴出堆積物から主にsulfidogenic汚泥（プンタミタ、ナヤリット、メキシコ）を取得する手順を説明還元的脱塩素化への適用を評価しました。それはそのサイトで、特定の場所4に生息する微生物群集が示す硫酸還元活性に起因する硫化物の形成があることが報告されているため、堆積物の場所を選択しました。
断絶があります。sulfidogenesisにメタングラニュール汚泥を適応させるの上に堆積物からこのsulfidogenic汚泥を得る際にアル利点。これらの利点のいくつかは、（1）（3）が存在する汚泥を適応さメタン汚泥で動作他UASBと比較して硫化物の比較的高濃度を許容し、（2）、バイオリアクターを操作するための顆粒を形成する必要がなく、かつ酢酸スラッジの形成を促進する培地に含まれる揮発性脂肪酸の混合物で使用してもメタンを有する基板には競合しません。
海洋堆積物が細菌を発酵し、わずか数5,6を言及する細菌を脱ハロゲン化、硫酸塩還元菌などの微生物の多種多様な自然のプールであるため、この手順はsulfidogenesisを促進するために行きました。このプロトコルを使用して、海洋堆積物から開発コンソーシアムの種類は、硫酸還元したがって、高いS効率を示すことができます ulfate時間とメタン生成菌と硫酸還元菌の毒性として報告よりも高い濃度で硫化物に高い許容度にわたって活性を低下させます。一方、脱ハロゲン化機能は、プロトコルに従うことにより、堆積物に示されている可能性があるが、ここで提案されているが、それは元の微生物のコミュニティに依存してもよいです。この仮定は、還元的脱塩素は呼吸やcometabolismのいずれかによって発生する可能性があるという事実に基づいて行われ、海洋微生物群集7に促進することができる両方の条件。これらの揮発性脂肪酸は、硫酸塩還元菌のいくつかの株によって使用されるため、汚泥を得るために、堆積物の培養基質として、酢酸、プロピオン酸および酪酸の混合物を用いて行きました。これらの酸は、海の堆積物5,6における炭素質材料に関する文献にはいくつかの報告によれば、また、しばしば、海洋堆積物中に見られる炭素化合物の一種です。
コンテンツ ">最後に、世界中の地下で発見された最も毒性の強い化合物および他の水域の一部は、トリクロロエチレン（TCE）やパークロロエチレン（PCE）のような塩素化溶媒である。これらの化合物は、人間のみならず毒性があるが、また、まだ米国8の環境保護庁が優先汚染物質と考えられている。本研究ではsulfidogenic汚泥をしている濃度でTCEを削減するその能力にテストされた実験を提案した微生物、特にTCEへメタン生成条件9,10の下で塩素化合物の生分解について報告範囲。それは、塩素化合物の生分解に関する研究のほとんどはメタン生成条件9,10の下で行われていることを言及する価値がある。我々は、このプロトコルで提案されたTCEを用いた実験であることを考慮します汚泥の潜在的なアプリケーションの良い例。この実験の目的は、EとしましたTCEへの汚泥の許容度および活性を硫酸還元のTCEの影響を評価します。 （1）（2）CODを除去し、（3）削除し、硫酸塩を除去する：塩素化合物の生分解に関する研究のほとんどはメタン条件下で行われることを考慮すると、このプロトコルは、スラッジの形成を同時にするために使用され得ることを示唆する塩素化合物。さらなるステップは、（ほかに硫酸塩およびCODする）メタン生成条件で評価することができない二つの条件をTCEと重金属の同時除去に汚泥を評価する可能性があります。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
プロトコルのステップについては、図1のスキーム。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
1.スラッジの形成のための海洋堆積物を収集
- （より高い硫酸還元活性を示すことが硫化物の存在に）熱水噴出孔に近いか有機物の残骸が検出された領域のいずれかに親しみ海中エリアを特定します。
- この研究の目的のために、堆積物の約3または4キロを取ると、サンプルから水を抜きます。暗いビニール袋中のサンプルを置きます。いいえ冷凍は必要ありません。
- 彼らはすぐに使用する予定がない場合は一度研究室で、冷蔵庫内のサンプルで袋を保ちます。この研究の目的のために、SAMPレは、それらを使用する前に、数週間または数ヶ月のために冷蔵庫にすることができます。
- 堆積物試料（ すなわち 、1または2キロ）の大部分を取ると堆積物から見つかった、または存在することができるいくつかの岩することができる炭素質材料の大きな破片を除去するために、適切なメッシュ（0.1センチ）を使用します。
注：この場合には0.20センチの直径（中0.0767）のメッシュを使用したが、それは、試料中の粒子の大きさに応じて異なるサイズであってもよいです。- メッシュを通して沈殿物を通過した後、一部が均一であることを促進するために選択した部分を混ぜます。
- 標準的な方法11に従って、揮発性浮遊物質（VSS）含量を決定するために分離した小さい試料（ すなわち、2~3 gで）を取ります。
注意：手順1.4から1.2のために、図2を参照してください。
堆積物試料の2写真を図。前揮発性懸濁物質（VSS）決意に計量するために取られたメッシュを通過した後の（A）堆積物試料だけ取られた後。（B）土砂サンプル。（C）サンプル 。ペトリ皿を滅菌する必要はありません。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
2.バイオリアクターのセットアップ
- この研究の目的のために、あるいは、3 Lの総作業容積でUASBのガラス反応器を使用して、1または2 L容量のガラス反応器を使用します。
- 堆積物のVSSの内容に基づいて1 LにVSSの5 gを得接種材料として使用する沈殿物の量を算出します
- 計算後の沈殿物の量が多すぎる場合には、バイオリアクターの約25％〜30％の量ではなく、堆積物によって占有されるべきであることを考慮に入れます。
- それ以来、VSSのコンテンツを記録します微生物群集は、バイオリアクター中で濃縮されたときに変更されます。 VSSのコンテンツは、バイオリアクター中の硫酸還元活性の計算のために必要とされます。
- バイオリアクターにおける基礎培地および緩衝液の最終濃度はゲレロ・バラハスらによって報告さに似ていることを確認してください。 （2014年）12。
- 堆積物の最終的な体積を確保する、基礎培地、緩衝液及び揮発性脂肪酸は、反応器の最終的な作業容量に等しいです。基礎培地レシピ12は、微量金属やビタミン解決のための適切な濃度が含まれています。
- それを希釈されたときに、それがあることを確認する（ステップ2.4で報告さよりも濃縮すなわち、2、3または4倍に）使用される反応器の作業容積のために適当な濃度で基本培地および緩衝液のストック溶液を調製しますゲレロ・バラハスらによって報告された濃度で。 （2014年）12）。
注：基礎培地原液が常に必要であるが、緩衝液のみ起動時に必要とされます。これは、この時間の後、緩衝液を添加する必要はありません。 - 1：1のCOD割合2.5で酢酸、プロピオン酸および酪酸：揮発性脂肪酸のストック溶液を準備します。酢酸ナトリウムは、基礎培地に含まれる計算のため考慮してください。反応器内の最後のCOD濃度は、2.7グラム/ Lでなければなりません。
注意：ドラフト内でこの溶液を調製します。この溶液の調製のためのニトリル手袋やゴーグルを着用します。アカウントに図3に示されている揮発性脂肪酸と硫酸の反応の化学量論を取ります。 - 反応器に硫酸イオン（SO 4 2-）の4,000ミリグラム/ Lの最終濃度を提供するために適切な濃度の硫酸ナトリウム（Na 2 SO 4）のストック溶液を調製します。また、目が含まれます代わりに限り、最終的な硫酸（SO 4 2-）濃度が権利であるとして原液からそれを加えるの基礎培地に必要な硫酸の電子量。
- 彼らは反応器の底部に達することを確認する基礎培地の一部と混合し、反応器内の堆積物を置きます。
- 揮発性脂肪酸の溶液と硫酸溶液と混合した基礎培地および緩衝液の残りを加えます。揮発性脂肪酸の溶液を液体中に注ぎ入れていることを確認します。注：ドラフト内でこのステップを実施します。
- リサイクルポンプに接続し、反応器のパイプラインを設定します。 /分60ミリリットルでリサイクル流量を設定します。 34℃の恒温槽内のバイオリアクターを設定します。定期的に温度変化（すなわち、34±1.7℃）に小さいことを確認してください
- ガス置換列への接続を設定します。
注意：手順2.5から2.1のために、図4を参照してください 。 </ OL>
VFA（酢酸、プロピオン酸および酪酸）と硫酸還元の図3.化学量論。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4. UASBリアクター。（A）初期時間。（B）連続運転政権の300日後。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Sulfidogenesisと微生物の成長を促進するために原子炉の3.操作
注意：接種物は、Vを消費するための許可脂肪酸および硫酸olatile。この目的のために、硫酸塩、硫化物およびCOD消費のために第1の分析を実行するために一週間を待ちます。
- インキュベーションの一週間は、CODのための分析を行うために、液体の5~7ミリリットルのサンプルを採取した後、硫酸塩及び硫化物の含有量及びpHを、13は標準的な方法11を以下。
- メチレンブルー法13に従って、（波長670nm（λ）での）液体の分光光度法で硫化物を分析します。
- 25 mlの容量フラスコに酢酸亜鉛溶液（2％w / w）の5mlのを置き、酢酸亜鉛溶液に迅速にサンプル200μLを加えます。
- N、N -ジメチル- p個のフェニレンジアミン、シュウ酸2.5 mlを加え（DMP）溶液（0.2％w / wの20％H 2 SO 4で）、鉄/ W（III）硫酸アンモニウム溶液（10％125μlの2％のH 2 SO 4）し、メスフラスコ中で25 mlの蒸留水で完全でワット反応のために30分を待ちます、ブルー色が安定した時刻13を発生します。
注：分光光度計でサンプルをテストするために60以上の分、少なくとも15分待ってからではなく。分光光度計の青い最終溶液の読み取りを実施します。
- 標準的な方法11に従って、硫酸を分析します。ここで、比濁法を用いて、硫酸バリウムなどの硫酸塩の定量。
- コンディショニング溶液5mlを配置（塩酸HClを1：1）25 mlにメスフラスコに、先に遠心分離したサンプルを1ml（11320×gで）、蒸留水でメスフラスコ中の25 mlのを完了を追加し塩化バリウム1gを追加します。
- ボルテックスで1分間この溶液を混ぜます。 420 nmで11の波長（λ）で分光光度計にサンプルを形成し、読むために、硫酸バリウム、4分間待ちます。
- 標準的な方法11に従って、CODを分析します。また、代金引換determinaを使用ションキット。
- CODの決意に先立ち、決意に干渉する可能性が残っている硫化物を除去するために、（11320×gで）完全にサンプルを遠心します。必要に応じて、遠心分離は二度：すぐに試料を採取した後、1回目と2回目は6または8時間を待ってから、COD分析を行います。
- 、代金引換決意キットの反応バイアルに試料を2 mlを加え、バイアルを密封し、穏やかに撹拌することにより混合物を均質化します。別の反応バイアルに2mlの蒸留水を加えることで、ブランクを準備し、混合物を均質化します。
- 2時間150℃で消化反応器内のバイアルを置きます。バイアルを取り外し、それらを暗闇の中でクールダウンしましょう。波長620nmで分光光度計でのバイアルの読み取りを行います。
- ガス置換塔からのガス量を取得します。
- メチレンブルー法13に従って、（波長670nm（λ）での）液体の分光光度法で硫化物を分析します。
- 硫酸塩が消費されるまでにさらに5〜7日間待ちます。硫酸とCODがで消費されなければなりませんpproximately 85％前〜90％の新しい供給バッチが開始されます。
- 硫酸（代金引換）が消費されると、完全にステップ2.4を繰り返します。バッチごとに新鮮な培地と新しい栄養素を供給してください。
- 繰り返しは3.1と3.2を繰り返します。この時点で、各バッチは7と10日の間持続させるべき。
- 3~4のバッチが完了したら、ステップ2.4を繰り返すが、4グラム/ LにCOD濃度を増加させます。
- 繰り返しステップ3.1およびステップ3.2。
- 手順を繰り返し3.3が、6グラム/ LにCOD濃度を増加させます。
- それは10グラム/ Lになるまで、3.6と3.6.1徐々に増加するCOD濃度を繰り返します。
注：時間（D）対硫酸塩濃度（mg / L）提示グラフを作成します。
- 硫酸の消費量がより少ない、24時間で80％以上であり、これは複数の週間発生した場合、連続モードに原子炉の運転を切り換えます。連続モードのために24時間後に水理学的滞留時間（HRT）を設定し、4グラム/ LとCODで硫酸濃度を維持10g / Lで。
注意：時間の経過とともに硫酸の消費量があるべき 速いです。
4.硫酸塩が活性試験を削減
- この試験の前には、連続的な体制の下、バイオリアクターは、残りの硫酸濃度が10％未満の変動を示していることを確認してください。
- 任意の日には、1 HRT周期や行動ステップ2.4の後に原子炉を停止します。ステップ2.4.3のために10グラム/ LのCOD濃度を使用しています。
- バイオリアクターが供給されると、液体の5~7 mlのサンプルを取り、代金引換、硫酸塩、硫化物（ステップ3.1）及びpHを時間ごとに分析を行います。生成されたガスの量を記録します。
- 文献14によると活性を低下させる硫酸を計算します。
SRA =硫酸還元活性（MG COD-H 2 S）/ GVSS * D
m個の H 2 2 Sのように表現
VSS =揮発性懸濁物質濃度
T =時間（dまたは時間）
- mg / Lでに時間をかけて硫化物濃度に対する硫酸の消費の割合を示し、対応するグラフを作成します。時間をかけて、CODの消費量の割合を示すグラフを作成します。時間をかけてpH変化を示すグラフを作成します。
5.トリクロロエチレン（TCE）還元試験
- この試験の前には、バイオリアクターは、連続的な政権の下で働いて、残りの硫酸濃度の10％未満の変動を示していることを確認してください。バイオリアクター中の硫酸還元が90％未満である場合は、このテストを開始しないでください。
- バイオリアクターの液相中のこの化合物の最終濃度は300μMでなければならないことを考慮してトリクロロエチレンの原液（TCE）を準備します。 partitioniを考えてみましょう34℃でのTCEのためHenry's法律無次元定数（H'）を使用して、ヘッドスペースへの化合物のNG。 TCEのためH'at 34°Cは0.4722です。
注意：換気フードにこの溶液を調製し、手袋とゴーグルを着用してください。- 例えば、5,000μMの原液、以下のように計算します：
TCEの気相濃度=（0.4722）（* 5000）= 2139μM。 TCEのこの量は、ヘッドスペースになりますので、原液の製造においてこの濃度を含めます。
そして、原液の液体（水）に、実際のTCE濃度は次のようになります。5000 + 2139 = 7139μM。 TCE密度= 1.43グラム/ mlです。 mgの7139μMを変換して、TCEの密度を用いて、ストック溶液のためのTCEの量を計算します。
注：TCE原液mの濃度をAY未満5,000μM、 すなわち 、3000または1000μmであること、これは、このソリューションの多くの量は、その液相の量に応じて、バイオリアクターに送達することができる方法によって異なります。
- 例えば、5,000μMの原液、以下のように計算します：
- TCE、 シス -1,2-ジクロロエチレン、 トランス -1,2-ジクロロエチレン、塩化ビニルおよびエテンのためのガスクロマトグラフにおける標準曲線を準備します。 TCEの原液5.2に記載したのと同じ手順に従うことにより、これらの化合物のストック溶液から、シス -1,2-ジクロロエチレン及びトランス-1,2-ジクロロエチレン標準曲線を準備します。規格（ガスボンベ）から各ガスの濃度を希釈することにより、塩化ビニルおよびエテンのための標準曲線を準備します。
- 20〜300μMの範囲で、これらの化合物の標準曲線を準備します。ゲレロ・バラハスらによって報告された方法を使用してください。ガスクロマトグラフにおけるこれらの化合物の分析のために（2011）15。
注意：これらのスタンドを準備ARD換気フード内のソリューションとは、手袋とゴーグルを着用してください。
- 20〜300μMの範囲で、これらの化合物の標準曲線を準備します。ゲレロ・バラハスらによって報告された方法を使用してください。ガスクロマトグラフにおけるこれらの化合物の分析のために（2011）15。
- 任意の日には、1 HRT周期や行動ステップ2.4の後に原子炉を停止します。ステップ2.4.3のために10グラム/ LのCOD濃度を使用しています。
- バイオリアクターが供給されると、5.2で調製したストック溶液からのバイオリアクター内の液体に直接TCEを追加し、バイオリアクターの液相の最終のTCE濃度は300μMである必要があります。 12時間にHRTを設定します。
- 1 HRTサイクルの終わりに（3.1.1、3.1.2および3.1.3ステップ）、COD、硫酸塩および硫化物のための液体（500〜1,000μL）のサンプルや行動分析を取ります。ヘッドスペース（100〜250μL）のサンプルを取り、ガスクロマトグラフでTCE、 シス -1,2-ジクロロエチレン、 トランス -1,2-ジクロロエチレン、塩化ビニルおよびエテンのための分析を行います。
- 手順を繰り返し2.4。ステップ2.4.3のために10グラム/ LのCOD濃度を使用しています。
- バイオリアクタ9の上に提示するまで、任意のTCE還元試験を繰り返さないでください0％の硫酸還元との両方において10％の変動の少ない、バイオリアクター中に残存する硫酸還元および硫酸塩。
- より5.4、5.5および5.6 2〜3回繰り返します。
- TCEの還元試験が終了した直後の微生物の識別を行うために堆積物の試料（0.5 g）を取ります。 2または3 TCE削減試験後、これを行います。
TCE還元実験後に活性試験を減らす6硫酸
- 完全にステップ4を繰り返します。
微生物の7.識別
- 約0.5グラムそれぞれのスラッジのサンプルを取り、標準的な方法12に従ってRNA総抽出を行っています。
- 逆転写と16S rRNA遺伝子を増幅し、ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）増幅を一段階12を行います 。
- 増幅または最初のアプローチとして文献11で提案されているものを使用するようにプライマーを設計します。 amplifに従ってくださいication手順は、文献12で提案されています。
- 16S rRNAのライブラリを構築します。 PCRアンプリコンをクローニングキット11を用いてクローニングすることができます。典型的には、各プレート（1つのPCR産物を表す各コロニー）からの10コロニーをクローニングすることができます。文献12で提案されている手順に従って、配列決定のために、プラスミドDNAを準備します。
- 断片の塩基配列決定を実施します。文献12で提案されている手順に従って、以前に説明したPCR増幅するためのプロトコル（ステップ7.4）とクローンを用いたPCR外部製品の約1,400塩基対を再増幅します。 Eから組換えプラスミドを分離文献12で提案されているように大腸菌コロニー。 M13ユニバーサルプライマー12と配列決定のために部分的な手続きを行ってください。
- シーケンス解析を実施します。クラスタルXを使用してヌクレオチド配列の位置を合わせ、手動でテキストエディタで調整します。 NCBIのdatabasのBLAST検索を実行しますE。 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）12。
- ヌクレオチド配列のアクセッション番号を取得します。対応するアクセッション番号の下でEMBLヌクレオチド配列データベース（ジェンバンク/ EMBL / DDBJ） で同定されたクローンの塩基配列を堆積させる（ すなわち 、アンプリコンからの配列のためのJQ713915eJQ713925）12。
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Representative Results
バイオリアクター中の硫酸化の典型的な動作は、 図5に示されている。これは、操作硫酸還元の最初の週の間に遅くなることを注意することが重要です。しかし、ゆっくりと時間をかけて硫酸の90％以上の消費量は接種物は硫酸還元菌が濃縮された、したがって硫酸を削減し、ことのできる微生物群集を、開発していることを示しています。図中の異なる期間が硫酸還元が経時的にその速度を増加させたことを示しています。初めに、バッチは、（期間I）を低減するために硫酸を20日かかったその減少率が増加し、それが供給される硫酸塩（期間II）を低減するのに約10日かかりました。期間IIIは、硫酸還元でより少ない変化を提示し、これは、それが、図5に見られるように10日間の平均で達成された。この期間の後、硫酸塩の還元は4,000 V 4日間の平均（期間IV）及び期間での取り硫酸塩のmg / Lで未満24時間で消費されました。バイオリアクターでのパフォーマンスは、24時間のHRTでの200日後に連続モードに設定されています。
バイオリアクター内sulfidogenicスラッジ経時図5.硫酸（SO 4 2-）濃度。実線は硫酸濃度が流入することを指します。四角は流出液中の硫酸濃度を指します。この図は、ゲレロ・バラハスらから取られている。（2014）12に対応する著作権の許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
時間をかけて硫酸還元、硫化物濃度、COD消費およびpHの変化に代表良好な結果がSHであり図6Aに自身。これらの結果は、バイオリアクターは、ほぼ年連続政権下にあった後に行われた実験で得られました。この時点で、微生物群集は、バイオリアクター中で開発され、それは図4Bに見られるように、黒色スラッジを形成しました。 図6Aにおいては、硫酸4時間で減少し、硫化物、最大1200±30ミリグラム/ Lの濃度及び188±50mgのCOD-H 2 S / GのVSS * dは硫酸活性を低下させるたに達し分かります。これは、バイオリアクターで得られた硫化物の濃度は、微生物に対して高い毒性と考えられ、この場合、バイオリアクターの活性を減少させる硫酸を停止しなかったことを言及する価値があります。
バイオリアクターの図6.パフォーマンス前（A）と（B）のTCE追加。硫酸（SO 4 2-）（◇）、硫化後（H 2 S）（•）。提示されたデータは、n = 3の平均値と標準偏差です。この図は、ゲレロ・バラハスらから取られている。（2014）12に対応する著作権の許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
スラッジがTCEを低減する能力について試験した実験のために、得られた結果を表1に示した。得られた活性を減少させる硫酸TCEの添加の前に取得され、TCEの約80％に減少したが、よりわずかに低かったですエテン（ 表1参照）。これらの結果は、反応器は、硫酸塩還元条件下で運営されていた時間に応じて期待されるべきです。反応器は期間IまたはIIで動作しているときにスラッジが取られている場合には、TCEの低下が起こる可能性は低い（ 図5参照
| パラメータ | TCE還元試験時の値 | ||
| SO 4 2-除去（％）の割合 | 98（0.06±） | ||
| 硫化（H 2 S）の濃度（mg / Lで） | 971（±72） | ||
| HにSO 4 2-の変換の割合2 S（％） | 68（±2） | ||
| COD除去の割合（％） | 93（±0.1） | ||
| pH領域 | 7.1から7.7 | ||
| ガス生産（ミリリットル/ D） | 200（±55） | ||
| 硫酸還元活性（MG COD-H 2 S / GのVSS * d）は | 161（±7） | ||
| * TCE最終濃度（μM） | 77（±8） | 塩化ビニル濃度（μM） | 16（±0.3） |
| エテン濃度（μM） | 202（±81） | ||
| TCEの除去の割合（％） | 74.3（±14） |
表TCEの生分解実験中sulfidogenic汚泥の性能1.結果この表はゲレロ・バラハスらから変更されている（2014年）* TCE初期濃度：。。。300μM。提示されたデータは、平均値であり、n = 3の標準偏差です。
TCEの還元試験の後、経時的硫酸還元、硫化物濃度、COD消費量及びpHの変動の結果を図6Bに示されています。これらの結果は、硫酸が5時間で減少し、硫化物濃度は、その活性を低下させる硫酸塩と一緒に、1400±35 mg / Lでに達したことを示しています248±22mgのCOD-H 2 S / GのVSS * dの。わずかに高い硫酸還元活性- 188±50mgのCOD-H 2 S /グラムのVSS * dで比較は-微生物群集は、TCEによって阻害されなかったことを示しています。
このプロトコルで使用される汚泥において同定微生物に対する結果を表2に示す 。硫酸還元菌、発酵細菌と脱ハロゲン化細菌は、このプロトコルを使用して開発された汚泥で同定されました。バイオリアクターは、TCEとの条件と数日硫酸還元下で1年の間に動作していたので、結果は驚くべきことではありません。このようなデスルホビブリオ、Desulfomicrobium、Desulfitobacterium、クロストリジウム、Dehalobacte rとSulfurospirillumなどの細菌の属は、硫酸還元および塩素化合物の生分解に関連しています。また、汚泥中のこれらの微生物の識別プロトコルは、最も毒性の強い塩素化合物の一つである硫酸塩、トリクロロエチレンの同時除去に使用することができるsulfidogenic汚泥の開発に成功したことを確認します。
| 細菌報告 | 高い類似性 | 最大のident |
| GI | 386685641未培養デスルホビブリオ属 。 | デスルホビブリオdesulfuricans | 96％ |
| GI | 386685640未培養Desulfomicrobium・エスピー 。 | Desulfomicrobium norvegicum | 99％ |
| GI | 386685639未培養Desulfomicrobium・エスピー 。 | Desulfomicrobium baculatum | 99％ |
| GI | 386685638未培養Desulfomicrobium・エスピー 。 | Desulfomicrobiumハイポgeium | 99％ |
| GI | 386685637未培養Desulfotomaculum・エスピー 。 | Desulfotomaculum acetoxidans | 99％ |
| GI | 386685636未培養クロストリジウム・エスピー。 | クロストリジウム・celerecrescens | 99％ |
| GI | 386685635未培養デスルホビブリオ属 。 | デスルホビブリオhalophilus | 98％ |
| GI | 386685634未培養Dehalobacter・エスピー 。 | Dehalobacter restrictus | 99％ |
| GI | 386685633未培養Desulfitobacterium・エスピー 。 | Desulfitobacterium hafniense | 99％ |
| GI | 386685632未 培養Sulfurospirillum・エスピー 。 | Sulfurospirillum multivorans | 97％ |
| GI | 386685631未培養Sulfurospirillum・エスピー 。 | Sulfurospirillum halorespirans | 97％ |
表2コンソーシアムは、バイオリアクターのスラッジおよび他の細菌との類似性で特定さ最大のident：最大のアイデンティティを。
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Discussion
環境バイオテクノロジーにおけるsulfidogenesisのいくつかのアプリケーション、細菌を発酵する廃水処理であるとのコンソーシアム中の硫酸還元菌の代謝の最も使用されるアプリケーションの一つがあります。 UASB反応器は、高硫酸濃度の産業廃水処理の主な設計アプローチの一つです。本研究では、UASB反応器内での海洋堆積物からsulfidogenic汚泥を取得するためのプロトコルを提示します。海洋堆積物からsulfidogenic汚泥を取得するためのプロトコル内の重要なステップである：（1）反応器内に配置される堆積物試料の同性の促進、（2）硫酸の右濃度と揮発性脂肪酸の供給量（COD / SO 4 2-）の比、（3）分析硫酸塩、硫化物、定期COD及びpHが、（4）微量金属およびビタミンバッチが開始されるたびに含まれている基礎培地をリフレッシュ。それはsludgの開発することを考慮することが重要ですeは、元のサンプルの微生物群集に、右の物質収支（硫酸とCOD）に大きく依存します。それが開発する活動を硫酸還元のための時間がかかりますが、バイオリアクターは、再循環ポンプを停止したり、温度制御を停止することが漏れ、事故、またはエネルギーの時間的な不足を回避するために、継続的な監視が必要です。特別な注意は、硫化物、硫酸塩およびCODの分析の性能に支払わなければなりません。
一般的に、海洋堆積物は、微生物の多種多様の天然の供給源です。それはスラッジが異なる深さから採取した海底堆積物を形成することができる可能性があります。このプロトコルでは、それは2つの主な理由のために熱水海底堆積物を使用することを選択した：（1）これらの浅い通気口がコストの近くに位置しており、（2）サイトのこれらのタイプは、硫化物で、より豊富で、硫酸還元の指標であると従って、硫酸塩還元細菌の存在。どちらかといえば、sedimenを取ります我々は、これは非常に低いだと思うが、海中階に他の場所からのtsが唯一、汚泥を開発するために多くの時間が必要になります。
また、さらに、このプロトコルまたは他の任意の分子生物学技術において提案手順で識別される汚泥に脱ハロゲン化微生物の存在を促進するために、いくつかのTCE還元試験を実施する必要があります。文学は世界7各地の海の堆積物中の微生物のこのタイプの存在を指すが、それは、脱ハロゲン化微生物の開発はまた、汚泥の発生源に依存することを考慮することが重要です。硫酸還元活性のアッセイは、 例えば 、TCEの存在過酷な状態の後sulfidogenic汚泥の有効性を評価するために、毒性化合物への汚泥の曝露後に推奨されます。汚泥の硫酸還元活性が低下した場合、それがだ維持することが必要となりますバッチモードでeveral週間は再び硫酸還元活性の増加を促進するために硫酸とCODを与えました。これは、微生物のsulfidogenesisと成長を促進するためのプロトコルで提案されている手順に従って行うことができます。それはそれは堆積物の培養の初めからTCEと硫酸を加えることによって、sulfidogenic-脱ハロゲン化汚泥を得ることが試みられたことを言及することは重要であるが、（いずれかの硫酸塩還元または脱ハロゲン化）は活性は、これまで認められませんでした。しかしながら、濃縮の初めからTCEの添加は常に他の堆積物を試みることができ、文化の初期段階中に存在する微生物の低含有量が（でも、20μMの濃度で）TCEを容認していなかったと仮定しました。
この場合では良い結果がTCEの減少は、主にdichloroethenesとVINをもたらすことができる汚泥中に開発している可能性が微生物に応じて、しかし、エテンにTCEの減少でしたイルクロリド（VC）。この場合、TCEの減少のために得られたデータは常に、試験中のTCE及びその中間製品のバイオリアクターの代わりに、サンプリングの各HRTサイクル後に記録しました。これは、頻繁なサンプリングに起因する塩素化合物の蒸発を避けるためにそのように行きました。したがって、表示する時間をかけてTCE濃度のないグラフが、濃度は、各実験の終了時にはありません。これは、それらの正確な濃度を報告するために、変更は、生物学的還元の代わりに、損失に起因し得るかどうかを区別するために、揮発性塩素化合物の蒸発を回避することが重要です。エテンの存在や、TCEの減少後の最終製品の-1,2-ジクロロエチレンシスとしてTCEの共通の中間体が存在しないことは、特に興味深いものです。常にエテンへの完全なTCEの減少のみDehalococcoides属によって行うことができることが報告されています。その場合には、これらのmicroorgaニズムは、汚泥中で同定属の中では検出されませんでした。我々はdehalorespiring、発酵や細菌を減らす硫酸の中で汚泥中に発生した可能性がありcometabolismにTCEの減少を属性。このコンソーシアムにおける欠点は、VC、TCE以上の毒性化合物の一時的な形成は、しかしながら、それは比較的低濃度で存在する、促進することです。これは非常に珍しいcometabolic活動はコンソーシアムによって開発され、条件を硫酸還元の下に新しいTCE還元経路は、さらに本研究で同定されたhalorespiring微生物の存在下で調べることができることをされたことをこの時点で言うことも可能です。一方、それは以前に脱ハロゲン化する遺伝子は、しばしば地下海洋堆積物中で検出されることが報告されているが、TCEの生分解に関する報告は硫酸塩還元条件と組み合わせて海底堆積物に存在しない、これは別の電子受容体として硫酸を使用して、です。
この方法の制限の1つは、汚泥の構造が使用され堆積物の物理的特性に依存し、この方法で形成された汚泥は、反応器及びガラス上のバイオフィルムの形成の良好な流動化を許可されているが、我々はどのように予測することができないということですそれは実際には別の場所の堆積物を使用して動作します。これは、予備試験を実施するために小さい反応器を使用することが可能であるとそれが可能であるかどうかを観察。意図はバイオリアクター中のスラッジで動作する場合、我々は小宇宙から始まるお勧めしません。提案は最初の試みのためのより小さい体積でも、最初から原子炉を設定することです。
ここで紹介する方法は、形成された汚泥をsulfidogenesisにメタングラニュール汚泥の適応を介して取得されている他のsulfidogenicスラッジより高い硫化物濃度を許容することで重要です。この方法は、硫酸塩還元菌と発酵菌が含まれており、容易に有毒な化合物を生物分解するように適合されているコンソーシアムでのスラッジの形成を促進します。このプロトコルでは、我々は唯一のUASBリアクター内のメタン生成条件下で生分解された毒性化合物の例としてTCEを使用していました。反応器の目的は、塩素化溶媒をbiotransformする場合、例えば、それは、徐々に溶媒濃度、 すなわち 、より高いTCを増加させるために有用であり得ます硫酸還元にわたって脱ハロゲン化を刺激するために硫酸濃度を減少させながら試験におけるE濃度。が、本研究で得られた結果によれば、我々はまだ硫酸還元条件が望ましい場合、硫酸は完全に培養物から除去することができないと思います。いくつかのdehalorespirersも硫酸減速しているので、硫酸塩還元条件は維持されるべきです。このプロトコールに記載された条件下で発生する汚泥は、最終的に同時にCOD、硫酸塩、塩素化毒性化合物及び重金属を除去するために使用することができます。重金属スラッジによって生成硫化沈殿することができます。
最後に、形成されたsulfidogenicスラッジを試験することができる：（1）より高い硫化物濃度の許容範囲（ 例えば 、重金属を沈殿させるために）、他の有機汚染物質の（2）生分解、または電子供与体のような炭化水素の（3）消費代わりに、FUの揮発性脂肪酸のrtherは、環境、バイオテクノロジーへの応用を探ります。これは、スラッジが形成されると、それは他の反応器に接種する種汚泥として使用できることを考慮することが重要です。その場合には、硫酸塩還元プロセスは直ちに、従って発生し、それが完全にバイオリアクターを操作するために年に待機する必要はありません。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trichloroethylene | sigma Aldrich | 251402 | |
| cis-1,2-dichlorotehylene | sigma Aldrich | ||
| trans-1,2-dichloroethylene | sigma Aldrich | D-62209 | |
| vinyl chloride scotty standard | supelco | 1,000 ppm v/v in nitrogen | |
| ethene scotty standard | supelco | 99% purity | |
| pump | Masterflex | Model 7553-75 | |
| spectrophotometer | any | ||
| microcentrifuge | any | ||
| gas tight syringes | any | 100 and 200 microliters | |
| UASB glass reactor | any | under design | |
| gas chromatograph | any | FID detector | |
| capillary column SPB-624 | supelco | ||
| pH meter | any | ||
| viton tubing | Masterflex | ||
| basal medium reagents | any | ||
| trace metals reagents | any | ||
| vitamins solution reagents | any | ||
| sodium sulfate | any | ||
| volatile fatty acids | any | ||
| COD determination kit | HACH | range 0-15,000 mg/L | |
| TOPO-TA cloning kit pCR®4.0 | Invitrogen, US | ||
| S.N.A.P. TM Miniprep Kit | Invitrogen, UK | ||
| Pure link TM Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen |
References
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