Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Ontwikkeling van Sulfidogenic Slib van mariene sedimenten en Trichloorethyleen Vermindering van een Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

Published: October 15, 2015 doi: 10.3791/52956

Introduction

Een van de belangrijkste bijdragen aan milieubiotechnologie was het ontwerpen van bioreactoren waarbij het slib gebruikt (inoculum) kon presteren onder sulfaat reducerende omstandigheden. Sulfaat (SR) maakt de behandeling van afvalwater dat hoge concentraties sulfaat bevatten naast de gelijktijdige verwijdering van CZV, zware metalen en organische verontreinigingen, een feit dat SR maakt een gewenste eigenschap van het slib 1. Enkele voorbeelden van afvalwater verontreinigd met sulfaat afkomstig van leerlooierij, papier, farmaceutische en chemische industrie 1. Echter, de meeste van de literatuur heeft betrekking op slib sulfidogenic wanneer methanogene korrelslib is aangepast aan sulfidogenesis 2. Deze aanpassing wordt gewoonlijk bereikt door het manipuleren van de CZV / SO 4 2- verhouding in de bioreactor en het toevoegen van chemicaliën aan methanogenen in het slib 2,3 remmen. Naast de lange tijd dat may vereisen de vorming van de sulfidogenic granules, de concurrentie tussen methanogenen en sulfaatreduceerders en de tolerantie van het slib aan hoge concentraties van sulfide zijn enkele van de belangrijkste problemen die kunnen ontstaan ​​indien de sulfidogenic gebruikt slib in de bioreactor wordt verkregen uit de aanpassing van voornamelijk methanogene slib sulfaat reducerende omstandigheden. In dit werk, de procedure om een ​​overwegend sulfidogenic slib van hydrothermale bronnen sedimenten (Punta Mita, Nayarit, Mexico) in een opwaartse stroming anaerobe slibdeken reactor (UASB) te verkrijgen beschrijven we, dan evalueren we de sulfaat reducerende activiteit in de tijd en voeren een experiment aan de toepassing ervan op de reductieve dechlorering te evalueren. De locatie van het sediment werd gekozen omdat het is vermeld dat doordat er ter vorming van sulfiden vanwege de sulfaat reducerende activiteit vertoond door de microbiële gemeenschap bevolken aldus vastgestelde plaats 4.

Er zijn several voordelen in het verkrijgen van deze sulfidogenic slib uit sedimenten op de aanpassing van methanogene korrelslib te sulfidogenesis. Sommige van deze voordelen zijn: (1) het is niet nodig om granules de bioreactor te werken, (2) het slib tolereert relatief hoge concentraties van sulfide in vergelijking met andere UASB die werken met aangepaste methanogene slib, en (3) wordt geen concurrentie substraat methanogens zelfs als acetaat wordt toegepast in het mengsel van vluchtige vetzuren die is opgenomen in het kweekmedium om de vorming van het slib te bevorderen.

Deze procedure werd gevolgd om sulfidogenesis bevorderen, omdat mariene sedimenten een natuurlijke pool van diverse micro-organismen zoals sulfaat reducerende bacteriën fermenteren bacteriën en dehalogeneren bacteriën slechts een paar te noemen 5,6. Het type consortium ontwikkeld uit mariene sedimenten door het gebruik van dit protocol kan de efficiëntie vertonen in sulfaat en dus hoge s ulfate reducerende activiteit in de tijd en een hogere tolerantie voor sulfide bij concentraties hoger dan de gerapporteerde als giftig voor methanogenen en sulfaat reducerende bacteriën. Aan de andere kant, is het waarschijnlijk dat de dehalogeneringsactiviteit vermogen ook in de sedimenten wordt door de protocol hier wordt voorgesteld, maar kan afhangen van de oorspronkelijke microbiële gemeenschap. Deze aanname wordt gedaan op basis van het feit dat reductieve dechlorering kan plaatsvinden hetzij ademhaling of cometabolisme beide omstandigheden die kunnen worden bevorderd mariene microbiële gemeenschap 7. De teelt van sedimenten aan het slib verkrijgen werd uitgevoerd door toepassing van een mengsel van acetaat, propionaat en butyraat als substraat omdat deze vluchtige vetzuren worden gebruikt door verschillende stammen van sulfaat reducerende bacteriën. Deze zuren zijn ook type koolstofverbindingen vaak gevonden in mariene sedimenten volgens verschillende rapporten in de literatuur over koolstofhoudend materiaal in zee sedimenten 5,6.

content "> Tenslotte aantal van de giftige stoffen die worden aangetroffen in het grondwater en andere waterlichamen wereldwijd zijn de gechloreerde oplosmiddelen zoals trichloorethyleen (TCE) en perchloorethyleen (PCE). Deze verbindingen zijn toxisch niet alleen de mens, maar Ook voor micro-organismen, met name TCE, die nog steeds wordt beschouwd als een prioriteit verontreiniging door de Environmental Protection Agency in de VS 8. In dit werk voorgesteld we een experiment waarin de sulfidogenic slib wordt getest op zijn vermogen reduceren TCE bij concentraties die in de range gerapporteerd voor gechloreerde verbindingen biologische afbraak onder methanogene omstandigheden 9,10. Vermeldenswaard is dat het grootste deel van het onderzoek naar de biologische afbraak van gechloreerde verbindingen is uitgevoerd onder methanogene omstandigheden 9,10 waard. Wij zijn van mening dat het experiment met TCE in dit protocol wordt voorgesteld, is een goed voorbeeld van de mogelijke toepassingen van het slib. Het doel van dit experiment was om ewaarderen de tolerantie van het slib naar de TCE en TCE effect op de sulfaat reducerende activiteit. Aangezien het meeste onderzoek naar biologische afbraak van gechloreerde verbindingen onder methanogene condities plaatsvindt, dit protocol stelt de vorming van een slib kan worden gebruikt om gelijktijdig: (1) verwijderen sulfaat, (2) verwijderen COD en (3) verwijderen gechloreerde verbindingen. Een volgende stap kan zijn om het slib op de gelijktijdige verwijdering van TCE en zware metalen te evalueren (naast sulfaat en COD), twee aandoeningen die niet onder methanogene condities worden geëvalueerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Figuur 1
Figuur 1. Regeling voor de stappen van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Verzamel mariene sedimenten voor de vorming van het slib

  1. Identificeer een laagdrempelige onderzeese omgeving ofwel dichtbij warmwaterkraters (door de aanwezigheid van sulfiden, die een hogere sulfaat reducerende activiteit kan duiden) of naar een gebied waar afval van organische stof detecteerbaar.
  2. Voor de toepassing van dit werk, duurt ongeveer 3 of 4 kg sediment en laat het water uit de monsters. Plaats de monsters in het donker plastic zakken. Geen koeling nodig.
  3. Eenmaal in het laboratorium, houdt de zakken met de monsters in de koelkast als ze niet zullen onmiddellijk worden gebruikt. Voor de toepassing van dit werk, samples kan worden in de koelkast voor weken of maanden voordat u ze gebruikt.
  4. Neem een groot deel van het sediment monster (dat wil zeggen 1 of 2 kg) en gebruik een geschikt mesh (0,2 cm) ter verwijdering van sedimenten de grote brokstukken van het koolstofhoudende materiaal te vinden of een stenen die aanwezig kunnen zijn.
    Opmerking: In dit geval is een maaswijdte van 0,20 cm diameter (0,0767 inch) werd gebruikt, maar het kan van een ander formaat volgens de grootte van de deeltjes in het monster.
    1. Na het passeren van het sediment door de mazen, meng de geselecteerde bevorderen dat het gedeelte homogeen gedeelte.
    2. Neem gescheiden kleinere monsters (dat wil zeggen, 2 tot 3 g) de vluchtige gesuspendeerde vaste stoffen (VSS) gehalte te bepalen volgens de standaardmethoden 11.
      Let op: Zie figuur 2 voor de stappen 1,2 tot 1,4.

Figuur 2
Figuur 2. Foto's van de sediment monsters.(A) Sedimentstalen net na na het passeren door de mazen genomen. (B) Sediment monster. (C) Monster genomen voor het wegen voorafgaand aan vluchtige gesuspendeerde vaste stoffen (VSS) bepalen. De petrischaal hoeft niet te worden gesteriliseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Bioreactor Set Up

  1. Voor de toepassing van dit werk, gebruik dan een UASB glazen reactor met een totaal werkvolume van 3 L. alternatief gebruik maken van een 1 of 2 L volume glazen reactor.
  2. Op basis van de VSS inhoud van de sedimenten berekenen van de hoeveelheid sediment worden gebruikt als inoculum voor 5 g VSS verkrijgen 1 L.
  3. Er rekening mee dat indien de hoeveelheid sediment na berekening te groot, dan ongeveer 25% tot 30% volume van de bioreactor moet plaats ingenomen door de sedimenten.
    1. Noteer de VSS inhoud aangezienverandert wanneer de microbiële gemeenschap verrijkt in de bioreactor. De VSS inhoud is nodig voor de berekening van sulfaat reducerende activiteit in de bioreactor.
  4. Ervoor zorgen dat de uiteindelijke concentratie van het basismedium en bufferoplossing in de bioreactor is vergelijkbaar met de gerapporteerde door Guerrero-Barajas et al. (2014) 12.
    1. Ervoor zorgen dat de laatste delen van de sedimenten, basaal medium, bufferoplossing en vluchtige vetzuren gelijk aan de uiteindelijke werkvolume van de reactor. De basale medium recept 12 bevat de juiste concentraties voor de spoormetalen en vitaminen oplossing.
    2. Bereid een voorraadoplossing van basismedium en bufferoplossing in een geschikte concentratie van het werkvolume van de reactor gebruikte (dat wil zeggen, 2, 3 of 4 maal meer geconcentreerd dan gerapporteerd in stap 2,4), zodat wanneer het wordt verdund, is de concentratie die door Guerrero-Barajas et al. (2014)12).
      Opmerking: De voorraadoplossing van het basismedium is altijd noodzakelijk, echter de bufferoplossing alleen nodig bij het opstarten. Het is niet nodig om bufferoplossing toevoegen nadat deze tijd.
    3. Bereid een voorraadoplossing van vluchtige vetzuren: acetaat, propionaat en butyraat in een 2,5: 1: 1 verhouding COD. Rekening te houden bij de berekening van de natriumacetaat opgenomen in de basale medium. De uiteindelijke CZV-concentratie in de reactor moet 2,7 g / l zijn.
      Let op: Maak deze oplossing in een zuurkast. Draag nitril handschoenen en een bril voor het opstellen van deze oplossing. Rekening houden met de stoichiometrie van de reactie van sulfaat met de vluchtige vetzuren die wordt getoond in figuur 3.
    4. Bereid een voorraadoplossing van natriumsulfaat (Na 2 SO 4) in een geschikte concentratie te leveren aan de reactor een uiteindelijke concentratie van 4000 mg / l van het sulfaation (SO 4 2-). Als alternatief omvatten the hoeveelheid sulfaat vereist het basismedium in plaats van toe te voegen uit een voorraadoplossing zolang de uiteindelijke sulfaat (SO 4 2-) concentratie gelijk.
  5. Plaats de afzettingen in de reactor gemengd met een gedeelte van het basismedium ervoor zorgen dat ze de bodem van de reactor te bereiken.
    1. Doe de rest van het basismedium en bufferoplossing gemengd met het vluchtige vetzuren oplossing en de sulfaatoplossing. Zorg ervoor dat de oplossing van vluchtige vetzuren in de vloeistof wordt gegoten. Let op: Voer deze stap in een zuurkast.
    2. Stel de aansluitingen en leidingen van de reactor naar de recirculatiepomp. Stel de recycling debiet 60 ml / min. Stel de bioreactor in de temperatuurkamer op 34 ° C. Controleer regelmatig of de temperatuurverschillen klein zijn (dat wil zeggen, 34 ± 1,7 ° C)
    3. Stel de aansluitingen op de kolom gasverplaatsing.
      Let op: Zie figuur 4 voor de stappen 2,1-2,5.
    4. </ ol>

    Figuur 3
    Figuur 3. Stoichiometrie van sulfaat reductie met VFA (acetaat, propionaat en butyraat). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    Figuur 4
    Figuur 4. UASB-reactor. (A) Eerste tijd. (B) Continue regime na 300 dagen van de operatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    3. De werking van de reactor te bevorderen Sulfidogenesis en de groei van de micro-organismen

    Opmerking: Laat de entstof van de v verbruikenolatile vetzuren en sulfaat. Hiertoe wacht één week uitvoeren van de eerste analyse van sulfaat, sulfide en COD consumptie.

    1. Na één week incubatie een monster van 5-7 ml van de vloeistof analyse uit te voeren voor CZV, sulfaat en sulfide inhoud en pH volgens standaard werkwijzen 11, 13.
      1. Analyseer sulfide in de vloeistof spectrofotometrisch (bij een golflengte (λ) van 670 nm) door de methyleenblauw methode 13.
        1. Plaats 5 ml van een zinkacetaatoplossing (2% w / w) in een 25 ml volumetrische kolf en voeg snel 200 ul van het monster op de zinkacetaat-oplossing.
        2. Voeg 2,5 ml van een N, N-dimethyl-p-fenyleendiamine-oxalaat (DMP) oplossing (0,2% w / w in 20% H 2 SO 4) en 125 gl van de ijzer (III) ammoniumsulfaat-oplossing (10% w / w in 2% H 2 SO 4) en compleet met gedestilleerd water van 25 ml in de maatkolf. Wacht 30 min voor de reactieoptreden, tijdstip waarop de blauwe kleur wordt gestabiliseerd. 13.
          Opmerking: Wacht ten minste 15 minuten, maar niet meer dan 60 minuten om de monsters te testen in de spectrofotometer. Het gedrag van de lezing van de blauwe definitieve oplossing in de spectrofotometer.
      2. Analyseer sulfaat volgens standaardmethoden 11. Hier kwantificeren sulfaat bariumsulfaat met behulp van een turbidimetrische methode.
        1. Plaats 5 ml van een conditionering oplossing (zoutzuur HCl 1: 1) in een maatkolf van 25 ml, voeg 1 ml van de eerder gecentrifugeerd monster (bij 11.320 x g), voltooi de 25 ml van de maatkolf met gedestilleerd water en Voeg 1 g bariumchloride.
        2. Meng de oplossing gedurende 1 min in een vortex. Wacht 4 min voor de barium sulfaat te vormen en te lezen het monster in de spectrofotometer bij een golflengte (λ) van 420 nm 11.
      3. Analyseer COD volgens standaardmethoden 11. U kunt ook gebruik maken van een COD Determinatie kit.
        1. Voorafgaand aan de COD-bepaling, centrifuge het monster grondig (bij 11.320 xg) om de resterende sulfide die kunnen ingrijpen in de bepaling te verwijderen. Indien nodig, centrifuge twee keer: de eerste keer direct na het nemen van het monster en de tweede tijd wachten 6 of 8 uur en dan is de COD-analyse uit te voeren.
        2. Voeg 2 ml van het monster aan een reactie flacon van de COD bepaling kit, sluit de flacon en homogeniseren van het mengsel door voorzichtig schudden. Bereid een blanco door toevoeging van 2 ml gedestilleerd water tot een reactievat en het mengsel gehomogeniseerd.
        3. Plaats de injectieflacons in de digestie reactor bij 150 ° C gedurende 2 uur. Verwijder de flesjes en laat ze in het donker te koelen. Neem de aflezingen van de injectieflacons in de spectrofotometer bij een golflengte van 620 nm.
      4. Het verkrijgen van het volume gas uit de kolom gas verplaatsing.
    2. Wacht tot een 5 tot 7 dagen tot het sulfaat wordt verbruikt. Sulfaat en COD moet een worden geconsumeerdpproximately 85% tot 90% voordat een nieuwe fed-batch wordt gestart.
    3. Zodra sulfaat (en COD) worden verbruikt, volledig Herhaal stap 2.4. Leveren vers medium en nieuwe voedingsmiddelen voor elke partij.
    4. Herhaal de stappen 3.1 en 3.2. Op dit moment moet elke partij duren tussen de 7 en 10 dagen.
    5. Wanneer 3 tot 4 batches zijn voltooid, herhaal stap 2.4, maar verhogen de CZV concentratie 4 g / l.
    6. Herhaal stap 3.1 en stap 3.2.
      1. Herhaal stap 3,3, maar verhoging van de CZV-concentratie tot 6 g / l.
      2. Herhaal 3.6 en 3.6.1 geleidelijk toenemende concentratie COD totdat deze 10 g / l.
        Let op: Maak de grafiek dat de sulfaat concentratie (mg / l) versus tijd (d) presenteert.
    7. Wanneer sulfaat verbruik dan 80% in minder dan 24 uur en dit gebeurt meer dan één week, schakelt de werking van de reactor voor continue modus. Voor de continue modus zet de hydraulische retentietijd (HRT) bij 24 uur en de sulfaat concentratie 4 g / l en de COD te behoudenbij 10 g / l.
      Let op: Na verloop van tijd de sulfaat verbruik moet worden sneller.

    4. sulfaat reducerende activiteit Test

    1. Voorafgaand aan deze test te zorgen dat de bioreactor onder continue regeling weer minder dan 10% variatie in de concentratie overgebleven sulfaat.
    2. Op een bepaalde dag, stop de reactor na één HRT cyclus en gedrag stap 2.4. Voor stap 2.4.3 een CZV-concentratie van 10 g / l.
    3. Zodra de bioreactor wordt toegevoerd, nemen 5-7 ml monsters van de vloeistof en analyses uitvoeren voor CZV, sulfaat, sulfide (stap 3,1) en pH ieder uur. Noteer het gasvolume geproduceerd.
    4. Bereken de sulfaat reducerende activiteit volgens de literatuur 14.

      Vergelijking 1

    SRA = sulfaat reducerende activiteit (mg COD-H 2 S) / gVSS * d

    m H 2 2 S

    VSS = vluchtige zwevende stoffen concentratie

    t = tijd (d of hr)

    1. Maak de bijbehorende grafieken die het percentage sulfaat consumptie versus sulfide concentratie in de tijd weergeven in mg / l. Maak de grafieken die percentage van COD verbruik over tijd. Maak de grafieken die pH-variatie in de tijd te laten zien.

    5. Trichloorethyleen (TCE) Reduction Test

    1. Voorafgaand aan deze test te zorgen dat de bioreactor werkt onder continue regeling en bevat minder dan 10% variatie in de concentratie overgebleven sulfaat. Deze test niet starten als sulfaatreductie in de bioreactor kleiner is dan 90%.
    2. Bereid een voorraadoplossing van trichloorethyleen (TCE) met dien verstande dat de uiteindelijke concentratie van deze verbinding in de vloeistoffase van de bioreactor moet 300 uM. Denk aan de partitioning van de verbinding aan de gasruimte met de Henry's Law dimensieloze constante (H') voor TCE bij 34 ° C. H'at 34 ° C voor TCE is 0,4722.
      Vergelijking 2
      Let op: Bereid deze oplossing in een zuurkast en draag handschoenen en een veiligheidsbril.
      1. Bijvoorbeeld, een 5000 pM voorraadoplossing wordt er als volgt:
        Vergelijking 3
        TCE gasfaseconcentratie = (0,4722) * (5000) = 2139 uM. Omvat deze concentratie bij de bereiding van de voorraadoplossing aangezien hoeveelheid TCE zal in de kopruimte.
        Dan in de vloeistof (water) van de voorraadoplossing zal de feitelijke concentratie TCE: 5000 + 2139 = 7139 uM. TCE dichtheid = 1,43 g / ml. Zet de uM tot 7139 mg en met de dichtheid van TCE berekent de hoeveelheid TCE van de voorraadoplossing.
        Opmerking: De concentratie van de voorraadoplossing m TCEay lager dan 5000 uM, bijvoorbeeld, 3000 of 1000 uM, dit hangt af van hoeveel volume van deze oplossing kan worden geleverd aan de bioreactor volgens de vloeistoffase volume.
    3. Bereid standaard curves in de gaschromatograaf voor TCE, cis-1,2-dichloorethyleen, trans-1,2-dichloorethyleen, vinylchloride en etheen. Bereid de cis-1,2-dichloorethyleen en trans-1,2-dichloorethyleen standaard curves uit een voorraadoplossing van deze verbindingen volgens dezelfde in 5,2 beschreven voor de TCE voorraadoplossing procedure. Bereid de standaard curves van vinylchloride en etheen door verdunning van de concentratie van elk gas uit de normen (gasflessen).
      1. Bereid de standaard curves van deze verbindingen in een bereik van 20 tot 300 uM. Gebruik de methode gerapporteerd door Guerrero-Barajas et al. (2011) 15 voor de analyse van deze verbindingen in de gaschromatograaf.
        Let op: Bereid deze standard oplossingen in een zuurkast en draag handschoenen en een veiligheidsbril.
    4. Op een bepaalde dag, stop de reactor na één HRT cyclus en gedrag stap 2.4. Voor stap 2.4.3 een CZV-concentratie van 10 g / l.
    5. Zodra de bioreactor wordt toegevoerd, voeg de TCE rechtstreeks aan de vloeistof in de bioreactor van de voorraadoplossing bereid in 5,2 dient de uiteindelijke TCE-concentratie in de vloeistoffase van de bioreactor is 300 uM. Stel de HRT tot 12 uur.
      1. Aan het einde van een HST-cyclus nemen monsters van de vloeistof (500 tot 1.000 III) en het gedrag analyse voor CZV, sulfaat en sulfide (stappen 3.1.1, 3.1.2 en 3.1.3). Neem monsters van de kopruimte (100 om 250 pl) en analyse verricht voor TCE, cis-1,2-dichloorethyleen, trans-1,2-dichloorethyleen, vinylchloride en etheen in de gaschromatograaf.
    6. Herhaal stap 2.4. Voor stap 2.4.3 een CZV-concentratie van 10 g / l.
    7. Gebruik geen TCE reductie-test niet herhalen totdat de bioreactor presenteert meer dan 90% sulfaat en 10% minder variatie in zowel sulfaatreductie sulfaat en nog in de bioreactor.
    8. Herhaal 5.4, 5.5 en 5.6 twee of drie keer meer.
    9. Neem sedimentstalen (0,5 g) om identificatie van de micro-organismen voeren net na een TCE van doorstroom is voltooid. Doe dit na 2 of 3 TCE reductie testen.

    6. sulfaat reducerende activiteit Test na TCE Reduction Experiment

    1. Herhaal stap 4 volledig.

    7. Identificatie van Micro-organismen

    1. Monsters te nemen van slib van ongeveer 0,5 g per stuk en voeren totale RNA-extractie volgens de standaard methode 12.
    2. Amplify het 16S rRNA-gen met reverse transcriptie en leidt de polymerasekettingreactie (RT-PCR) amplificatie een stap 12.
    3. Het ontwerp van de primers te versterken of te gebruiken als een eerste benadering van de degenen die in de literatuur gesuggereerd 11. Volg de versterker;icatie procedure voorgesteld in de literatuur 12.
    4. Construct het 16S rRNA bibliotheken. PCR amplicons kunnen worden gekloneerd door een klonering-kit 11. Meestal kan 10 kolonies van elke plaat (elke kolonie die een PCR-product) worden gekloneerd. Bereid het plasmide DNA voor sequentiebepaling volgens de werkwijze voorgesteld in de literatuur 12.
    5. Het gedrag van de sequencing van fragmenten. Opnieuw amplificeren ongeveer 1400 bp van de PCR-producten met de externe protocol voor PCR-amplificatie eerder beschreven (stap 7,4) en kloon volgens de werkwijze voorgesteld in de literatuur 12. Isoleer het recombinante plasmide uit E. coli kolonies zoals voorgesteld in de literatuur 12. Geleiden de partiële procedure voor sequentiebepaling met M13 universele primers 12.
    6. Het gedrag van de sequenties analyse. Lijn de nucleotide sequenties met behulp van de Clustal X en handmatig aan te passen in de teksteditor. Het uitvoeren van BLAST zoekopdrachten van de NCBI database. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) 12.
    7. Het verkrijgen van de nucleotidesequentie toetreding nummers. Deponeer de nucleotide sequenties van de klonen die in de EMBL nucleotidesequentie-database (Gen-Bank / EMBL / DDBJ) in de overeenkomstige toegangsnummers (dwz JQ713915eJQ713925 voor sequenties van amplicons) 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een typische gedrag van de sulfaatreductie in de bioreactor wordt getoond in figuur 5. Het is belangrijk op te merken dat tijdens de eerste weken bedrijf sulfaatreductie verloopt traag. Echter langzaam het verbruik van meer dan 90% van sulfaat in de tijd geeft aan dat de entstof ontwikkelt een microbiële gemeenschap kan reduceren sulfaat en bijgevolg verrijkt sulfaat reducerende bacteriën. De verschillende periodes in de figuur geeft aan dat sulfaat werd het verhogen van de rente in de tijd. Aan het begin van de batch duurde 20 dagen sulfaat te reduceren (periode I), dan zijn reductiegraad toenam, en het duurde ongeveer 10 dagen gevoed sulfaat (periode II) te beperken. Periode III gepresenteerd minder variatie in sulfaat en deze werd in gemiddeld 10 dagen bereikt zoals is te zien in figuur 5. Na deze periode, de reductie van sulfaat werd gemiddeld 4 dagen (IV) en in periode V de 4000 mg / l sulfaatwerden verbruikt in minder dan 24 uur. De prestaties in de bioreactor werd ingesteld onder continue modus na 200 dagen bij HRT van 24 uur.

Figuur 5
Figuur 5. sulfaat (SO 4 2-) de concentratie in de tijd tijdens de sulfidogenic slibvorming in de bioreactor. De continue lijn verwijst naar sulfaatconcentratie behoud hiervan. Squares zie sulfaat concentratie in het effluent. Dit cijfer is overgenomen uit Guerrero-Barajas et al. (2014) 12 met de bijbehorende toestemming van het auteursrecht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Representatieve goede resultaten op sulfaat, sulfide concentratie, COD consumptie en pH variaties in de tijd zijn sheigen in figuur 6A. Deze resultaten werden verkregen in experimenten wanneer de bioreactor werd onder continue regeling bijna een jaar. Op dit moment werd de microbiële gemeenschap ontwikkeld in de bioreactor en een zwarte slib gevormd zoals te zien is in figuur 4B. In figuur 6A is te zien dat sulfaat werd verlaagd 4 uur sulfide en bereikte een maximale concentratie van 1200 ± 30 mg / L en 188 ± 50 mg CZV-H 2 S / VSS g * d werd de sulfaat reducerende activiteit. Het is vermeldenswaard dat de concentratie van sulfide verkregen in de bioreactor hoog toxisch voor micro-organismen wordt beschouwd, en in dit geval de bioreactor de sulfaat reducerende activiteit niet ophouden.

Figuur 6
Figuur 6. prestaties van de bioreactor vóór (A) en na (B) de TCE toevoeging. Sulfaat (SO 4 2-) (◇), Sulfide(H2S) (•). Gepresenteerde gegevens zijn het gemiddelde en de standaarddeviatie van n = 3. Dit cijfer is overgenomen uit Guerrero-Barajas et al. (2014) 12 met de bijbehorende toestemming van het auteursrecht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voor het experiment waarbij het ​​slib werd getest op het vermogen om TCE verminderen, worden de resultaten getoond in Tabel 1. Het sulfaat reducerende activiteit verkregen was enigszins lager dan die vóór de TCE toevoeging en ongeveer 80% van de TCE werd verminderd tot etheen (zie tabel 1). Deze resultaten moeten het verwacht op basis van de tijd waarin de reactor opereerde onder sulfaat reducerende omstandigheden. Het is onwaarschijnlijk dat TCE vermindering optreedt wanneer het slib wordt genomen wanneer de reactor werkt in periode I en II (zie figuur 5

Parameter Waarde tijdens de TCE reductie-test
Percentage van SO 4 2- verwijdering (%) 98 (± 0,06)
Sulfide (H2S) concentratie (mg / l) 971 (± 72)
Percentage omzetting van SO 4 2- H 2 S (%) 68 (± 2)
Percentage van COD verwijdering (%) 93 (± 0,1)
pH-bereik 7,1-7,7
Gasproductie (ml / d) 200 (± 55)
Sulfaat reducerende activiteit (mg COD-H 2 S / g VSS * d) 161 (± 7)
* TCE uiteindelijke concentratie (uM) 77 (± 8) Vinylchloride concentratie (uM) 16 (± 0,3)
Etheen concentratie (uM) 202 (± 81)
Percentage van TCE verwijdering (%) 74,3 (± 14)

. Tabel 1. De resultaten van de prestaties van de sulfidogenic slib tijdens de TCE biologische afbraak experiment Deze tabel is gewijzigd van Guerrero-Barajas et al (2014) * TCE aanvankelijke concentratie:.. 300 uM. Gepresenteerde gegevens zijn het gemiddelde en de standaardafwijking van n = 3.

Na de TCE vermindering test worden de resultaten van sulfaat, sulfide concentratie COD consumptie en pH schommelingen in de tijd weergegeven in figuur 6B. Deze resultaten tonen aan dat sulfaat werd gereduceerd in 5 uur en sulfide concentratie bereikte 1400 ± 35 mg / l, samen met een sulfaat reducerende activiteit van248 ± 22 mg COD-H 2 S / g VSS * d. De iets hogere sulfaat reducerende activiteit - in vergelijking met 188 ± 50 mg CZV-H 2 S / VSS g * d - geeft aan dat de microbiële niet werd geremd door de TCE.

Resultaten voor de micro-organismen die in het slib in dit protocol worden in tabel 2. Sulfaat reducerende bacteriën fermenteren bacteriën en dehalogeneren bacteriën werden geïdentificeerd in het slib ontwikkeld met dit protocol. De resultaten zijn niet verrassend omdat de bioreactor actief was gedurende één jaar onder sulfaat reducerende omstandigheden en enkele dagen met TCE. Geslachten van bacteriën zoals Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfitobacterium, Clostridium, Dehalobacte r en Sulfurospirillum zijn met betrekking tot sulfaat en biologische afbraak van gechloreerde verbindingen. Bovendien is de identificatie van deze micro-organismen in het slibbevestigt dat het protocol succesvolle ontwikkeling van een sulfidogenic slib kan worden gebruikt voor gelijktijdige verwijdering van sulfaat en trichloorethyleen, dat is een van de meest toxische gechloreerde verbindingen was.

Bacteriën gemeld Hoge gelijkenis max ident
gi | 386685641 onbeschaafde Desulfovibrio sp. Desulfovibrio desulfuricans 96%
gi | 386685640 onbeschaafde Desulfomicrobium sp. Desulfomicrobium norvegicum 99%
gi | 386685639 onbeschaafde Desulfomicrobium sp. Desulfomicrobium baculatum 99%
gi | 386685638 onbeschaafde Desulfomicrobium sp. Desulfomicrobium hypogeium 99%
gi | 386685637 onbeschaafde Desulfotomaculum sp. Desulfotomaculum acetoxidans 99%
gi | 386685636 onbeschaafde Clostridium sp. Clostridium celerecrescens 99%
gi | 386685635 onbeschaafde Desulfovibrio sp. Desulfovibrio halophilus 98%
gi | 386685634 onbeschaafde Dehalobacter sp. Dehalobacter restrictus 99%
gi | 386685633 onbeschaafde Desulfitobacterium sp. Desulfitobacterium hafniense 99%
gi | 386685632 onbeschaafde Sulfurospirillum sp. Sulfurospirillum multivorans 97%
gi | 386685631 onbeschaafde Sulfurospirillum sp. Sulfurospirillum halorespirans 97%

Tabel 2. Consortium die in het slib van de bioreactor en de gelijkenis met andere bacteriën Max ident. Maximum identiteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er zijn verschillende toepassingen van sulfidogenesis in milieubiotechnologie, een van de meest gebruikte toepassingen van het metabolisme van sulfaat reducerende bacteriën in consortia fermenterende bacteriën in afvalwaterzuivering. UASB reactoren behoren tot de belangrijkste gemanipuleerde benaderingen van industrieel afvalwater met hoge concentraties sulfaat. In dit werk, presenteren we een protocol om sulfidogenic slib uit mariene sedimenten te verkrijgen in een UASB-reactor. De kritische stappen in het protocol een sulfidogenic slib verkregen uit mariene sedimenten zijn: (1) het bevorderen van de homogeniteit van de sediment monster wordt geplaatst in de reactor (2) toevoeren van de juiste concentratie van sulfaat en vluchtige vetzuren (COD / SO 4 2-) verhouding (3) het analyseren van het sulfaat, sulfide, COD en pH periodiek (4) vernieuwen het basismedium, die sporenmetalen en vitamines telkens een partij wordt gestart bevat. Het is belangrijk om te overwegen dat de ontwikkeling van de sludge is sterk afhankelijk van de microbiële gemeenschap van het oorspronkelijke monster en rechts massabalans (sulfaat en COD). Hoewel het kost tijd voor de sulfaat reducerende activiteit te ontwikkelen, de bioreactor vergt permanente monitoring te lekken, ongevallen of tijdelijk gebrek aan energie die de circulatiepomp kan stoppen of het afsluiten van de temperatuur te voorkomen. Speciale aandacht moet worden besteed aan de uitvoering van de analyse van sulfide, sulfaat en COD.

Mariene sedimenten in het algemeen een natuurlijke bron van een breed scala aan micro-organismen; is het waarschijnlijk dat slib kan worden gevormd met mariene sedimenten uit verschillende dieptes. In dit protocol werd gekozen hydrothermische mariene sedimenten gebruikt om twee belangrijke redenen: (1) deze ondiepe openingen liggen dicht bij de kosten en (2) dit soort plaatsen zijn overvloedig in sulfiden, die een indicatie van sulfaatreductie en Derhalve, de aanwezigheid van sulfaat reducerende bacteriën. Als er iets, het nemen van de sediments uit een andere plaats in de onderzeese vloer zal alleen maar meer tijd om het slib te ontwikkelen nodig, hoewel we denken dat dit is zeer onwaarschijnlijk.

Ook moeten meerdere TCE vermindering proeven de aanwezigheid van micro-organismen bevorderen dehalogeneren in het slib verder te identificeren volgens de procedure die in dit protocol of andere moleculair biologische technieken. Het is belangrijk om te overwegen dat de ontwikkeling van micro-organismen dehalogeneren ook afhankelijk van de bron van het slib, hoewel literatuur verwijst naar de aanwezigheid van dergelijke micro-organismen in verschillende zee sedimenten wereldwijd 7. Een sulfaat reducerende activiteit assay wordt aanbevolen na de blootstelling van het slib naar de toxische verbinding om de levensvatbaarheid van de sulfidogenic slib evaluatie na een stressvolle toestand, bijvoorbeeld de aanwezigheid van TCE. Indien de sulfaat reducerende activiteit van het slib afneemt zal het nodig zijn om handhaven several weken ladingsgewijs gevoed met sulfaat en COD opnieuw bevorderen van de groei van sulfaat reducerende activiteit. Dit kan door de stappen voorgesteld in het protocol sulfidogenesis en groei van de micro-organismen bevorderen. Het is belangrijk te vermelden dat gepoogd werd een sulfidogenic-dehalogeneren slib verkrijgen door toevoeging TCE en sulfaat sinds het begin van het kweken van de sedimenten, maar geen activiteit (ofwel sulfaatreducerende of dehalogeneren) nooit waargenomen. Er werd aangenomen dat het lage gehalte aan micro-organismen in het beginstadium van de kweek niet tolereren TCE (zelfs bij 20 uM concentratie), maar de toevoeging van TCE sinds het begin van de verrijking kan altijd getracht andere afzettingen.

Een goed resultaat in dit geval de reductie van TCE om etheen, echter afhankelijk van de micro-organismen die kunnen worden ontwikkeld in het slib vermindering van TCE kan vooral dichloorethenen en vin opleverenyl chloride (VC). In dit geval is de voor de TCE datareductie werden geregistreerd na elke cyclus HRT in de bioreactor plaats van bemonstering voor TCE en de tussenproducten voortdurend gedurende de proef. Het werd gedaan op die wijze om verdamping van de gechloreerde verbindingen voorkomen als gevolg van frequente bemonstering. Daarom zijn er geen grafieken van TCE-concentratie in de tijd te tonen, maar de concentratie aan het eind van elk experiment. Het is belangrijk om verdamping van de vluchtige gechloreerde verbindingen voorkomen nauwkeurige concentraties te melden en te onderscheiden of de veranderingen toe te schrijven aan biologische reductie plaats van verliezen. De aanwezigheid van etheen en het ontbreken van gemeenschappelijke tussenproducten met TCE zoals cis-1,2-dichloorethyleen in eindprodukten nadat de TCE verlaging is bijzonder interessant. Het is altijd al gemeld dat de volledige TCE reductie tot etheen alleen door Dehalococcoides sp kunnen worden uitgevoerd. en in dit geval deze microorganismen werden niet waargenomen bij de genera die in het slib. We schrijven de TCE verlaging tot de cometabolisme die kunnen zijn ontstaan ​​in het slib onder de dehalorespiring, het vergisten en de sulfaat reducerende bacteriën. Een tekortkoming in consortium dat bevordert de tijdelijke vorming van VC, een verbinding giftiger dan TCE, echter aanwezig in relatief lage concentraties. Het kan mogelijk zijn om op dit punt zeggen dat een zeer ongebruikelijke cometabolic activiteit werd ontwikkeld door het consortium en dat een nieuwe TCE vermindering traject onder sulfaat reducerende omstandigheden kunnen verder worden onderzocht in aanwezigheid van de halorespiring micro-organismen die in dit werk. Anderzijds, is eerder gemeld dat dehalogeneren genen vaak aangetroffen in mariene sedimenten ondergrond, maar er zijn geen rapporten over TCE afbraak met onderzeese sedimenten in combinatie met sulfaat reducerende omstandigheden dit gebruik sulfaat als alternatieve elektronenacceptor.

5,6. Acetaat-butyraat, propionaat-butyraat of slechts butyraat: we zouden combinaties zoals bevelen. Echter, we niet het gebruik van lactaat aanbevolen omdat wanneer het werd gebruikt, ondervonden we de ontwikkeling van sulfaat reducerende bacteriën, maar de accumulatie van acetaat in de bioreactor en het doel van deze methode is een slib acetaat kunnen gebruiken verkrijgen. Acetaat accumulatie is een tekortkoming in veel van de sulfidogenic reactoren in de literatuur. Ook hebben we het gebruik van alcoholen geprobeerd. Aan de andere kant, raden we - indien gewenst - te beginnen met een lagere concentraties van sulfaat (dwz 1 g / l) en geleidelijk verhogen van de concentratie met behoud van de juiste massabalans, dat wil zeggen, de juiste concentratie van de kabeljauw in de bioreactor (COD / SO 4 2- ratio). Het is niet geschikt, echter beginnen met hogere concentraties sulfaat (hoger dan 4 g / l), hoewel kan worden verhoogd in de tijd samen met de bijbehorende CZV. De COD / SO 4 2- verhouding kan in een bereik tussen 0,67 en 2,5 te beginnen, en kan gewijzigd worden het slib wordt ontwikkeld.

Een van de beperkingen van deze methode is dat de structuur van het slib is afhankelijk van de fysische eigenschappen van het sediment gebruikt en hoewel bij deze werkwijze het slib gevormd kon een goede fluïdisatie van de reactor en vorming van biofilm op het glas, kunnen we niet voorspellen hoe het zou eigenlijk met sedimenten van verschillende locaties. Het is mogelijk om kleinere reactoren voorlopige tests enobserveren als het haalbaar is. Als het de bedoeling is om te werken met het slib in een bioreactor, raden we niet aan beginnen met microkosmossen. Voorgesteld wordt om de reactor te stellen vanaf het begin, maar met een kleiner volume voor de eerste poging.

De hier gepresenteerde methode is belangrijk omdat het slib gevormde sulfide tolereert hogere concentraties dan andere sulfidogenic slib die worden verkregen via aanpassing van methanogene korrelslib te sulfidogenesis. De werkwijze bevordert de vorming van slib met een organisatie welke sulfaat reducerende bacteriën en bacteriën fermenteren omvat en eenvoudig aan toxische stoffen biologisch afbreekbaar. In dit protocol TCE we als een voorbeeld van een toxische verbinding die slechts is biologisch afgebroken onder methanogene condities in UASB reactors. Bijvoorbeeld, als het doel van de reactor gechloreerde oplosmiddelen biotransform het nuttig kan zijn om geleidelijk de oplosmiddelconcentratie, dat wil zeggen, hogere TCE-concentratie in de tests, terwijl het verminderen van de sulfaat concentratie dehalogenering stimuleren dan sulfaat. Hoewel volgens de aldus verkregen werkresultaten, we nog steeds dat sulfaat niet volledig kunnen worden verwijderd uit de kweek als sulfaat reducerende omstandigheden wenselijk. Bovendien moet sulfaat reducerende omstandigheden worden gehandhaafd omdat sommige dehalorespirers zijn ook sulfaat verloopstukken. Het slib gegenereerd onder de in dit protocol beschreven voorwaarden kan uiteindelijk worden gebruikt om tegelijkertijd te verwijderen COD, sulfaat, gechloreerde toxische stoffen en zware metalen. De zware metalen kan neerslaan met sulfide door het slib.

Tenslotte kan de sulfidogenic slib gevormd worden getest: (1) de tolerantie van hogere sulfide concentraties (bijvoorbeeld zware metalen neer te slaan), (2) de afbraak van andere organische verontreinigingen, of (3) het gebruik van koolwaterstoffen als elektronendonoren in plaats van vluchtige vetzuren further verkennen haar toepassingen in het milieu biotechnologie. Het is belangrijk om te overwegen dat wanneer het slib wordt gevormd kan worden gebruikt als zaden slib naar andere reactoren inoculeren. In dat geval zal het sulfaat direct reductieproces en dus optreedt, is het niet nodig om te wachten per jaar aan de bioreactor volledig te bedienen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
trichloroethylene  sigma Aldrich 251402
cis-1,2-dichlorotehylene sigma Aldrich
trans-1,2-dichloroethylene sigma Aldrich D-62209
vinyl chloride scotty standard supelco 1,000 ppm v/v in nitrogen
ethene scotty standard supelco 99% purity
pump Masterflex Model 7553-75
spectrophotometer any
microcentrifuge any
gas tight syringes  any 100 and 200 microliters
UASB glass reactor any under design
gas chromatograph  any FID detector
capillary column SPB-624 supelco
pH meter any
viton tubing Masterflex
basal medium reagents any
trace metals reagents any
vitamins solution reagents any
sodium sulfate any
volatile fatty acids any
COD determination kit HACH range 0-15,000 mg/L
TOPO-TA cloning kit pCR®4.0  Invitrogen, US
S.N.A.P. TM Miniprep Kit  Invitrogen, UK
Pure link TM Quick Plasmid Miniprep kit Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lens, P., Esposito, M. V. G., Zandvoort, M. Perspectives of sulfate reducing bioreactors in environmental biotechnology. ReViews Environmental Science and Biotechnology. 1 (4), 311-325 (2002).
  2. Omil, F., Lens, P., Hulshoff, P., Lettinga, G. Characterization of biomass from a sulfidogenic, volatile fatty acid-degrading granular sludge reactor. Enzyme and MicrobialTechnology. 20, 229-236 (1997).
  3. Lopes, S. I. C., Wang, X., Capela, M. I., Lens, P. N. L. Sulfate reduction during the acidification of sucrose at pH 5 under thermophilic (55 °C) conditions.II: Effect of sulfide and COD/SO4-2 ratio. Bioresource Technology. 101, 4278-4284 (2010).
  4. Alfonso, P., Prol-Ledesma, R. M., Canet, C., Melgarejo, J. C., Fallick, A. E. Sulfur isotope geochemistry of the submarine hydrothermal coastal vents of Punta Mita, Mexico. Journal of Geochemical Exploration. 78-79, 301-304 (2003).
  5. Valdemarsen, T., Kristensen, E. Degradation of dissolved organic monomers and short chain fatty acids in sandy marine sediment by fermentation and sulfate reduction. Geochimica et Cosmochimica Acta. 74, 1593-1605 (2010).
  6. Quistad, S. D., Valentine, D. L. Anaerobic propane oxidation in marine hydrocarbon seep sediments. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75, 2159-2169 (2011).
  7. Futagami, T., Morono, Y., Terada, T., Kaksonen, A. H., Inagaki, F. Dehalogenation activities and distribution of reductive dehalogenase homologous genes in marine subsurface sediments. Applied and Environmental Microbiology. 75 (21), 6905-6909 (2009).
  8. U.S. Environmental Protection Agency. List of priority pollutants. Clean Water Methods. , (2014).
  9. Ozdemir, C., Dursun, S., Karatas, M., Sen, N., Sahinkaya, S. Removal of trichloroethylene (TCE) in upFlow anaerobic sludge blanket reactors (UASB). Biotechnology and Biotechnological Equipment. 21 (1), 107-112 (2007).
  10. Zhang, Y., Wang, X., Hu, M., Li, P. Effect of hydraulic retention time (HRT) on the biodegradation of trichloroethylene wastewater and anaerobic bacterial community in the UASB reactor. Applied Microbiology and Biotechnology. 99, 1977-1987 (2015).
  11. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. , 20th Edn., American Public Health Association. Washington, DC. (1998).
  12. Guerrero-Barajas, C., et al. Enhanced sulfate reduction and trichloroethylene (TCE) biodegradation in a UASB reactor operated with sludge developed from hydrothermal vents sediments: process and microbial ecology. International Biodeterioration and Biodegradation. 94, 182-191 (2014).
  13. Trüper, H. G., Schlegel, H. G. Sulphur metabolism in Thiorhodaceae I. Quantitative measurements on growing cells of Chromatium okenii. Antoine van Leeuwenhoek. 30, 225-238 (1964).
  14. Gallegos-García, M. G. Biological processes of sulfate reduction in biofilms for metals precipitation [Ph D thesis]. , Intituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica. San Luis potosí, Mexico. (2009).
  15. Guerrero-Barajas, C., Garibay-Orijel, C., Rosas-Rocha, L. E. Sulfate reduction and trichloroethylene biodegradation by a marine microbial community from hydrothermal vents sediments. International Biodeterioration and Biodegradation. 65, 116-123 (2011).

Tags

Environmental Sciences Sulfidogenic slib hydrothermale bronnen sedimenten mariene sedimenten opwaartse stroming anaerobe slibdeken reactoren sulfaat reducerende bacteriën trichloorethyleen reductieve dechlorering.
Ontwikkeling van Sulfidogenic Slib van mariene sedimenten en Trichloorethyleen Vermindering van een Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guerrero-Barajas, C., Ordaz, A.,More

Guerrero-Barajas, C., Ordaz, A., García-Solares, S. M., Garibay-Orijel, C., Bastida-González, F., Zárate-Segura, P. B. Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor. J. Vis. Exp. (104), e52956, doi:10.3791/52956 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter