Introduction
אחת התרומות החשובות ביותר לביוטכנולוגיה הסביבתית היה העיצוב של bioreactors בי הבוצה משמשת (הבידוד) הייתה מסוגלת לבצע בתנאי סולפט הפחתה. הפחתת סולפט (SR) מאפשרת הטיפול בזרמי שפכים המכילים ריכוז גבוה של חומצה גופרתית בנוסף להסרת הזמנית של COD, מתכות כבדות ומזהמים אורגניים, עובדה שהופכת את SR אופייני רצויה של הבוצה 1. כמה דוגמאות של שפכים מזוהמים עם סולפט מגיעות מתעשיות הבורסקי, נייר, תרופות והייצור כימי 1. עם זאת, רוב הספרות מתייחס לsulfidogenic בוצה כאשר בוצת גרגירי Methanogenic הותאמה לsulfidogenesis 2. הסתגלות זו מושגת בדרך כלל על ידי מניפולציה של COD / SO 4 2 היחס בbioreactor והוספת כימיקלים לעכב methanogens ב2,3 הבוצה. בנוסף לזמן הארוך שמ 'איי דורשים ההיווצרות של גרגרי sulfidogenic, התחרות בין methanogens מוריד סולפט והסובלנות של הבוצה לריכוזים גבוהים של גופרי הוא חלק מהבעיות העיקריות שעלולות להתעורר אם בוצת sulfidogenic משמשת בbioreactor מתקבלת מהעיבוד של בעיקר בוצת Methanogenic סולפט הפחתת תנאים. בעבודה זו, אנו מתארים את ההליך לקבלת בוצה בעיקר sulfidogenic ממשקעי פתחים הידרותרמיות (Punta Mita, Nayarit, מקסיקו) בשמיכת בוצת כור אנאירובי upflow (UASB), ולאחר מכן אנו מעריכים סולפט צמצום פעילות לאורך זמן ולערוך ניסוי כדי להעריך את בקשתו על dechlorination המצמצם. המיקום של המשקעים נבחר משום שהוא כבר דווח כי באתר שיש היווצרות של סולפידים בשל פעילות סולפט הפחתה הוצגה על ידי קהילת החיידקים המאכלסת מקום המסוים ש4.
יש לנתקיתרונות אל בקבלת בוצת sulfidogenic זה ממשקעים מעל התאמת בוצת גרגירי Methanogenic לsulfidogenesis. חלק מיתרונות אלה הם: (1) זה לא הכרחי כדי ליצור גרגרים לbioreactor לפעול, (2) הבוצה סובלת ריכוזים גבוהים יחסית של גופרי בהשוואה לאחרים UASB הפועלים עם בוצת Methanogenic מותאמת, ו- (3) אין אין תחרות על מצע עם methanogens גם אם אצטט משמש בתערובת של חומצות שומן נדיפות שנכללה במדיום התרבות כדי לקדם את הקמתה של הבוצה.
כך נהג לקדם sulfidogenesis בגלל משקעים ימיים הם בריכה טבעית של מגוון רחב של מיקרואורגניזמים כגון סולפט הפחתת חיידקים, תסיסת חיידקים וdehalogenating חיידקים רק כדי להזכיר כמה 5,6. הסוג של קונסורציום התפתח ממשקעים ימיים על ידי שימוש בפרוטוקול זה עשוי להפגין יעילות בהפחתת סולפט ולכן, של גבוה ulfate צמצום פעילות לאורך זמן וסובלנות גבוהה לגופרתי בריכוזים גבוהים יותר מאשר דווח כרעיל לmethanogens וחיידקים סולפט הפחתה. מצד השני, סביר להניח שיכולת dehalogenating מוצגת גם במשקעים על ידי ביצוע הפרוטוקול מוצע כאן, אבל זה עשוי להיות תלוי בקהילת החיידקים המקורית. הנחה זו על סמך העובדה שdechlorination המצמצם יכול להתרחש גם על ידי נשימה או cometabolism, שני המצבים שעשויים להיות מקודם בקהילת החיידקים הימית 7. הטיפוח של המשקעים להשיג הבוצה נערך על ידי שימוש בתערובת של אצטט, propionate ווטיראט כמצע כי חומצות שומן נדיפות אלה משמשות בכמה זנים של חיידקי סולפט הפחתה. חומצות אלו הן גם הסוג של תרכובות פחמן לעתים קרובות נמצאות במשקעים ימיים, על פי כמה דיווחים בספרות על חומר פחמני במשקעי ים 5,6.
תוכן "> לבסוף, חלק מהתרכובות הרעילות ביותר שנמצאות בגוף מי תהום ומים אחרים ברחבי העולם הם הממסים כלור כגון טריכלורואתילן (TCE) או perchlorethylene (PCE). תרכובות אלה הן רעילות לא רק לאדם אלא גם למיקרואורגניזמים, בעיקר TCE, שעדיין נחשב למזהם עדיפות על ידי הסוכנות להגנת הסביבה בארה"ב 8. בעבודה זו הצענו ניסוי שבו בוצת sulfidogenic נבדקה על יכולתה של הפחתת TCE בריכוזים הנמצאים ב מגוון דיווח לפירוק תרכובות כלור בתנאי Methanogenic 9,10. ראוי להזכיר כי רוב המחקר על פירוק תרכובות כלור נערך בתנאי Methanogenic 9,10. אנו רואים כי הניסוי עם TCE המוצע בפרוטוקול זה הוא דוגמא טובה ליישומים הפוטנציאליים של הבוצה. מטרת ניסוי זה הייתה לדוארלהעריך את הסובלנות של הבוצה לTCE והשפעת TCE על סולפט הפחתת פעילות. אם ניקח בחשבון שרוב המחקר על פירוק תרכובות כלור מתבצע בתנאי Methanogenic, פרוטוקול זה מצביע על היווצרות בוצה ניתן להשתמש בו זמנית ל: (1) להסיר סולפט, (2) להסיר את COD ו( 3) להסיר תרכובות כלור. צעד נוסף יכול להיות להעריך את הבוצה בהסרה הזמנית של TCE ומתכות כבדות (בנוסף לסולפט וCOD), שני תנאים שלא ניתן להעריך בתנאי Methanogenic.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
באיור 1. תכנית לצעדים של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
1. איסוף ימי משקעים לכינונה של הבוצה
- לזהות אזור או קרוב לפתחים הידרותרמיות (בשל נוכחותם של סולפידים, אשר עשוי להצביע על פעילות סולפט גבוהה הפחתה) או לאזור שבו פסולת של חומר אורגני היא לגילוי נגיש התת ימי.
- לצורך עבודה זו, לקחת קילוגרם כ 3 או 4 של משקעים ולנקז את המים מהדגימות. מניחים את הדגימות בשקיות פלסטיק כהות. אין צורך בקירור.
- פעם אחת במעבדה, לשמור את השקיות עם הדגימות במקרר אם הם לא הולכים להיות בשימוש באופן מיידי. לצורך העבודה, SAMP זהles יכול להיות במקרר במשך שבועות או חודשים לפני השימוש בהם.
- קח חלק גדול ממדגם המשקעים (כלומר, 1 קילוגרם או 2) ולהשתמש ברשת מתאימה (0.2 סנטימטרים) לחסל ממשקעי הפסולת הגדולה של חומר פחמני שניתן למצוא או כמה סלעים שעשויות להיות נוכח.
הערה: במקרה זה רשת של קוטר 0.20 סנטימטר (.0767 ב) שימשה אבל זה יכול להיות בגודל שונה על פי גודל החלקיקים במדגם.- לאחר שעבר את המשקעים דרך הרשת, לערבב את החלק שנבחר כדי לקדם את החלק הוא הומוגנית.
- לקחת דגימות קטנות מופרדות (כלומר, 2 עד 3 גרם) כדי לקבוע את המוצקים מרחפים נדיפים תוכן (VSS) על ידי ביצוע השיטות סטנדרטי 11.
הערה: ראה איור 2 לצעדים 1.2-1.4.
איור 2. תמונות של הדגימות משקעים.דגימות משקעות () רק לאחר שנלקחו. מדגם משקעים (ב ') לאחר שעברה דרך הרשת. לדוגמא (ג) נלקחה לשקילת נחישות לפני מוצקים מרחפים נדיפים (VSS). צלחת פטרי לא צריכה להיות מעוקרת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
2. bioreactor על הגדר
- לצורך עבודה זו, להשתמש בכור זכוכית UASB עם סך עבודה נפח של 3 ל לחלופין, להשתמש בכור זכוכית נפח 1 ליטר או 2.
- בהתבסס על תוכן VSS של המשקעים לחשב את כמות המשקעים שישמש כבידוד להשיג 5 גרם של VSS ב 1 ל
- קח בחשבון שאם כמות המשקעים לאחר החישוב היא גדולה מדי, אז כ -25% עד 30% בנפח של bioreactor צריך להיות נכבש על ידי המשקעים במקום.
- רשום את תוכן VSS מאז אותוישתנה כאשר קהילת החיידקים מועשרת בbioreactor. תוכן VSS נחוץ לחישובים של סולפט הפחתת פעילות בbioreactor.
- ודא שהריכוז הסופי של הפתרון הבינוני וחיץ הבסיסי בbioreactor דומה שלדווח על ידי אל-בראחס גררו et. (2014) 12.
- ודא שהכרכים האחרונים של המשקעים, בינוני בסיסית, פתרון חיץ וחומצות שומן נדיפות שווים סופי העבודה הנפח של הכור. המתכון הבינוני הבסיס 12 מכיל הריכוזים המתאימים לפתרון מתכות קורט ויטמינים.
- הכן פתרון מניות של מדיום בסיסי ופתרון חיץ בריכוז מתאים להיקף העבודה של הכור בשימוש (כלומר, 2, 3 או פי 4 יותר מרוכזים מאשר דווח בשלב 2.4) כדי להבטיח שכאשר הוא מדולל, זה בריכוז שדווח על ידי גררו-Barajas et al. (2014)12).
הערה: פתרון המניות למדיום הבסיסי הוא תמיד הכרחי, עם זאת, פתרון החיץ יש צורך רק בתחילתו. אין צורך להוסיף פתרון חיץ לאחר שעה זו. - הכן פתרון מניות של חומצות שומן נדיפות: אצטט, propionate ווטיראט ב2.5: שיעור COD 1: 1. קח בחשבון לצורך חישוב נתרן אצטט כלול במדיום הבסיסי. ריכוז COD הסופי בכור חייב להיות 2.7 g / L.
זהירות: הכן את הפתרון הזה במנדף. ללבוש כפפות nitrile ומשקפי להכנה של פתרון זה. קח בחשבון את ההרכב של התגובות של סולפט עם חומצות שומן נדיפות שמוצגת באיור 3. - הכן פתרון מניות של נתרן גופרתי (Na 2 SO 4) בריכוז מתאים כדי לספק לכור ריכוז סופי של 4,000 מ"ג / ליטר של היון גופרתי (SO 4 2). לחלופין, כולל הכמות דואר של סולפט הדרוש במדיום הבסיסי במקום הוספתו מפתרון מניות כל עוד סולפט הסופי (SO 4 2) הריכוז נכון.
- מניחים את המשקעים בכור מעורבב עם חלק של המדיום הבסיסי כדי לוודא שהם מגיעים לתחתית של הכור.
- מוסיף את שאר הפתרון הבינוני וחיץ הבסיסי מעורבב עם פתרון חומצות שומן הנדיפות ופתרון סולפט. ודא כי הפתרון של חומצות שומן נדיפות הוא שפך לתוך הנוזל. הערה: ניהול שלב זה במנדף.
- הגדר את החיבורים וצינורות של הכור למשאבת המיחזור. הגדר את קצב זרימת המיחזור ב 60 מיליליטר / דקה. הגדר את bioreactor בתא הטמפרטורה על 34 מעלות צלזיוס. באופן קבוע לבדוק שוריאציות הטמפרטורה קטנות (כלומר, C 34 ± 1.7 °)
- הגדר את החיבורים לעמודת עקירת גז.
הערה: ראה איור 4 לצעדים 2.1-2.5. </ Ol>
איור 3. הרכב של הפחתת סולפט עם VFA (אצטט, propionate ווטיראט). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. UASB כור. () זמן ראשוני. (ב) משטר רציף לאחר 300 ימים של מבצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
3. מבצע של הכור לקידום Sulfidogenesis וצמיחה של מיקרואורגניזמים
הערה: אפשר לבידוד לצרוך נ 'olatile חומצות שומן וסולפט. לצורך כך, לחכות לשבוע אחד לבצע את הניתוח הראשון לסולפט, גופרי וצריכת COD.
- לאחר שבוע של דגירה אחד לקחת דגימה של 5 עד 7 מיליליטר של הנוזל לבצע ניתוח לCOD, סולפט ותוכן גופרתי וpH הבא שיטות סטנדרטי 11, 13.
- לנתח גופרתי בspectrophotometrically הנוזלי (באורך גל (λ) של 670 ננומטר) על ידי הבא מתילן השיטה כחולה 13.
- מקום 5 מיליליטר של פתרון אצטט אבץ (2% w / w) בבקבוק נפח 25 מיליליטר, להוסיף במהירות 200 μl של המדגם לפתרון אצטט אבץ.
- פתרון להוסיף 2.5 מיליליטר של אוקסלט -phenylenediamine עמ 'N, -dimethyl- N (DMP) (0.2% w / w 20% H 2 SO 4) ו- 125 μl של ברזל פתרון אמוניום סולפט (III) (10% w / w ב 2% H 2 SO 4) ומלא במים מזוקקים 25 מיליליטר בבקבוק הנפח. חכה 30 דקות לתגובהלהתרחש, זמן שבו הצבע הכחול הוא התייצב. 13.
הערה: המתן לפחות 15 דקות, אך לא יותר מ -60 דקות כדי לבדוק את הדגימות בספקטרופוטומטר. לנהל את הקריאה של הפתרון הסופי הכחול בספקטרופוטומטר.
- לנתח סולפט פי שיטות סטנדרטי 11. כאן, לכמת סולפט כסולפט בריום באמצעות שיטת turbidimetric.
- מקום 5 מיליליטר של פתרון אוויר (חומצה הידרוכלורית 1 HCl: 1) בבקבוק נפח של 25 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר של מדגם centrifuged בעבר (ב11320 × ז), להשלים את 25 מיליליטר של בקבוק הנפח עם מים מזוקקים ו להוסיף 1 גרם של כלוריד בריום.
- מערבבים את פתרון דקות 1 במערבולת. חכה 4 דקות לסולפט הבריום כדי ליצור ולקרוא את המדגם בספקטרופוטומטר באורך גל (λ) של 420 ננומטר 11.
- לנתח COD על פי שיטות סטנדרטי 11. לחלופין, להשתמש determina CODערכת tion.
- לפני קביעת COD, צנטריפוגות המדגם ביסודיות (ב11320 XG) כדי להסיר את גופרי נותר שעלולה להפריע בנחישות. במידת הצורך, צנטריפוגות פעמיים: בפעם הראשונה מייד לאחר נטילת הדגימה והפעם השנייה לחכות 6 או 8 שעות ולאחר מכן לבצע את ניתוח COD.
- הוסף 2 מיליליטר של מדגם לבקבוקון תגובה של ערכת נחישות COD, לאטום את הבקבוקון וhomogenize התערובת על ידי תסיסה עדינה. הכן ריק על ידי הוספת 2 מיליליטר של מים מזוקקים לבקבוקון תגובה אחרת וhomogenize התערובת.
- מניחים את הבקבוקונים בכור העיכול ב 150 מעלות צלזיוס במשך שעה 2. הסר את הבקבוקונים ולתת להם להתקרר בחושך. קח את הקריאה של הבקבוקונים בספקטרופוטומטר באורך גל של 620 ננומטר.
- השג את נפח הגז מעמודת עקירת גז.
- לנתח גופרתי בspectrophotometrically הנוזלי (באורך גל (λ) של 670 ננומטר) על ידי הבא מתילן השיטה כחולה 13.
- חכה עד 5 עד 7 ימים נוספים עד סולפט נצרך. סולפט וCOD חייבים להיות נצרכים בpproximately 85% עד 90% לפני אצווה הפד חדש שנפתחו.
- ברגע סולפט (וCOD) נצרכים, לגמרי חזור על שלב 2.4. לספק בינוני טריים וחומרים מזינים חדשים עבור כל אצווה.
- חזור על שלבים 3.1 ו -3.2. בשלב זה כל אצווה צריכה להימשך בין 7 ו -10 ימים.
- כאשר 3 עד 4 קבוצות הושלמו, חזור על שלב 2.4, אבל להגדיל את ריכוז COD 4 g / L.
- חזור על שלב 3.1 ושלב 3.2.
- חזור על שלב 3.3, אבל להגדיל את ריכוז COD 6 גרם / L.
- חזור על 3.6 ו3.6.1 בהדרגה ריכוז COD עד שהוא 10 גר '/ ל'.
הערה: הפוך את הגרף המציג את ריכוז סולפט (מ"ג / ליטר) לעומת זמן (ד).
- כאשר צריכת סולפט היא מעל 80% בפחות מ 24 שעות וזה קורה ליותר משבוע אחד, לעבור את הניתוח של הכור למצב מתמשך. למצב המתמשך להגדיר את זמן שמירה ההידראולית (HRT) בשעה 24 ולשמור על ריכוז סולפט ב 4 g / L וCODב 10 גר '/ ל'.
הערה: עם זמן צריכת סולפט צריכה להיות מהר יותר.
4. סולפט צמצום מבחן פעילות
- לפני בדיקה זו לוודא כי bioreactor תחת משטר רציף מציג וריאציה פחות מ -10% בריכוז סולפט שנותר.
- בכל יום נתון, לעצור את הכור לאחר שלב מחזור והתנהגות HRT אחד 2.4. לצעד 2.4.3 להשתמש ריכוז COD של 10 גר '/ ל'.
- ברגע שbioreactor מוזן, לקחת 5 עד 7 דגימות מיליליטר של הנוזל ולבצע ניתוח לCOD, סולפט, גופרי (שלב 3.1) ו- pH בכל שעה. רשום את הגז שיופק הנפח.
- לחשב את סולפט הפחתת פעילות לפי הספרות 14.
SRA = סולפט הפחתת פעילות (מ"ג COD-H 2 S) / gVSS * ד
מ 'H 2 2 S
VSS = ריכוז מוצקים מרחפים נדיפים
t = זמן (ד או שעות)
- הפוך את הגרפים המקבילים המציגים את אחוז צריכת סולפט לעומת ריכוז גופרי לאורך הזמן במ"ג / ליטר. הפוך את הגרפים המציגים אחוזי צריכת COD לאורך זמן. הפוך את הגרפים המציגים וריאציה pH לאורך זמן.
5. טריכלוריטן (TCE) מבחן הפחתה
- לפני בדיקה זו לוודא כי bioreactor פועל תחת משטר רציף ומציג וריאציה פחות מ -10% בריכוז סולפט שנותר. אל תתחיל את המבחן הזה אם הפחתת סולפט בbioreactor היא פחות מ -90%.
- הכן פתרון מניות של טריכלורואתילן (TCE) בהתחשב בכך שהריכוז הסופי של המתחם הזה בשלב הנוזלי של bioreactor חייב להיות 300 מיקרומטר. קחו למשל את partitioning של המתחם לאמיץ באמצעות מתמיד חוק Henry's ממדים (H') לTCE על 34 מעלות צלזיוס. H'at 34 מעלות צלזיוס במשך TCE היא .4722.
זהירות: הכן את הפתרון הזה בfumehood וללבוש כפפות ומשקפי מגן.- לדוגמא, לפתרון מניות מיקרומטר 5000, לחשב אחריו כמו:
ריכוז TCE שלב גז = (0,4722) * (5.000) = 2.139 מיקרומטר. כולל ריכוז זה בהכנת פתרון המניות מאז סכום זה של TCE יהיה באמיץ.
אז בנוזל (מים) של פתרון המניות, ריכוז TCE בפועל יהיה: 5,000 + 2,139 = 7139 מיקרומטר. צפיפות TCE = 1.43 גר '/ מיליליטר. המרת מיקרומטר 7139 מ"ג ולאחר מכן על ידי שימוש בצפיפות של TCE לחשב את הנפח של TCE לפתרון המניות.
הערה: הריכוז של מטר פתרון מניות TCEאיי להיות נמוך מ -5,000 מיקרומטר, כלומר, 3,000 או 1,000 מיקרומטר, זה תלוי בכמה נפח של פתרון זה עשוי להיות מועבר לbioreactor לפיה נוזל שלב נפח.
- לדוגמא, לפתרון מניות מיקרומטר 5000, לחשב אחריו כמו:
- הכן עקומות סטנדרטי בגז כרומטוגרף לTCE, cis -1,2-dichloroethylene, -1,2-dichloroethylene טרנס, ויניל כלוריד וethene. הכן את חבר העמים -1,2-dichloroethylene ועקומות סטנדרטי -1,2-dichloroethylene טרנס מפתרון מניות של תרכובות אלה על ידי ביצוע ההליך אותו תאר ב5.2 לפתרון מניות TCE. הכן את העקומות סטנדרטית וליניל כלוריד וethene על ידי דילול הריכוז של כל גז מהסטנדרטים (בלוני גז).
- הכן את העקומות סטנדרטי של תרכובות אלו במגוון של 20 עד 300 מיקרומטר. השתמש בשיטה שדווחה על ידי גררו-Barajas et al. (2011) 15 לניתוח של תרכובות אלו בגז כרומטוגרף.
זהירות: הכן אלה עומדיםפתרונות ארד בfumehood וללבוש כפפות ומשקפי מגן.
- הכן את העקומות סטנדרטי של תרכובות אלו במגוון של 20 עד 300 מיקרומטר. השתמש בשיטה שדווחה על ידי גררו-Barajas et al. (2011) 15 לניתוח של תרכובות אלו בגז כרומטוגרף.
- בכל יום נתון, לעצור את הכור לאחר שלב מחזור והתנהגות HRT אחד 2.4. לצעד 2.4.3 להשתמש ריכוז COD של 10 גר '/ ל'.
- ברגע שbioreactor מוזן, להוסיף TCE ישירות לנוזל בbioreactor ממניות הפתרון מוכן ב5.2, ריכוז TCE הסופי בשלב הנוזלי של bioreactor חייב להיות 300 מיקרומטר. הגדר את הטיפול בתחליפי ההורמונים לשעה 12.
- בסופו של מחזור טיפול הורמונלי אחד לקחת דגימות של הנוזלים (500 עד 1,000 μl) וניתוח התנהגות לCOD, סולפט וגופרי (שלבים 3.1.1, 3.1.2 ו3.1.3). לקחת דגימות של אמיץ (100-250 μl) ולבצע ניתוח לTCE, cis -1,2-dichloroethylene, -1,2-dichloroethylene טרנס, ויניל כלוריד וethene בגז כרומטוגרף.
- חזור על שלב 2.4. לצעד 2.4.3 להשתמש ריכוז COD של 10 גר '/ ל'.
- אל תחזור על כל מבחן הפחתת TCE עד bioreactor מציג מעל 90% הפחתת סולפט ווריאציה פחות של 10% בשניהם, הפחתת סולפט וסולפט שנותר בbioreactor.
- חזור על 5.4, 5.5 ו -5.6 פעמים או שלוש פעמים יותר.
- קח דגימות משקעים (0.5 גר ') לנהל זיהוי מיקרואורגניזמים רק לאחר בדיקת הפחתת TCE סיימה. לעשות את זה אחרי 2 או 3 בדיקות הפחתת TCE.
6. סולפט צמצום מבחן פעילות לאחר ניסוי TCE הפחתה
- חזור על שלב 4 לחלוטין.
7. זיהוי של מיקרואורגניזמים
- לקחת דגימות של בוצה של כ 0.5 גרם כל אחד ולנהל מיצוי מוחלט RNA על פי שיטה סטנדרטית 12.
- להגביר את גן 16S rRNA עם שעתוק לאחור ולנהל את תגובת השרשרת של פולימראז הגברה (RT-PCR) צעד אחד 12.
- עיצוב פריימרים כדי להגביר או להשתמש כגישה ראשונית אלה הציעו בספרות 11. בצע את המחזקיםהליך ication הציע בספרות 12.
- לבנות ספריות 16S rRNA. ניתן לשכפל amplicons PCR באמצעות שיבוט-ערכה 11. בדרך כלל, 10 מושבות מכל צלחת (כל מושבה מייצגת מוצר אחד PCR) ניתן לשכפל. הכן את ה- DNA פלסמיד רצף בהתאם לנוהל שהוצע בספרות 12.
- לנהל את הרצף של שברים. Re-להגביר כ -1,400 נקודות בסיס של המוצרים החיצוניים PCR עם הפרוטוקול להגברת PCR שתואר לעיל (שלב 7.4) ושיבוט על פי הנוהל המוצע בספרות 12. לבודד את פלסמיד רקומביננטי מא מושבות coli כפי שהוצעו בספרות 12. אל תנהל את ההליך החלקי עבור סידור עם פריימרים אוניברסליים M13 12.
- לנהל את ניתוח הרצפים. יישר את רצפי נוקליאוטידים באמצעות X Clustal ולהתאים באופן ידני בעורך הטקסט. לבצע חיפושי פיצוץ של databas צמח השדהדואר. (Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) 12.
- השג את מספרי הצטרפות רצף נוקליאוטידים. להפקיד את רצפי נוקליאוטידים של השיבוטים מזוהים באתר רצף נוקליאוטידים EMBL (אלוף בנק / EMBL / DDBJ) תחת מספרי ההצטרפות המקבילים (כלומר, JQ713915eJQ713925 לרצפים מamplicons) 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התנהגות אופיינית להפחתת סולפט בbioreactor מוצגת באיור 5. זה חשוב לשים לב כי במהלך השבועות הראשונים של הפחתת סולפט פעולה יהיה איטית. עם זאת איטי, הצריכה של מעל 90% מסולפט לאורך הזמן מצביעה על כך שהבידוד הוא פיתוח קהילת חיידקים מסוגל להפחית סולפט ולכן, מועשרת בחיידקי סולפט הפחתה. תקופות השונות בדמות מצביעות על כך שהפחתת סולפט הייתה הגדלת שיעורה לאורך זמן. בתחילת, אצווה לקח 20 ימים לסולפט להיות מופחתים (התקופה), ולאחר מכן שיעור ההפחתה שלה הלך וגודל, וזה לקח בערך 10 ימים כדי להפחית את סולפט הפד (התקופה השנייה). התקופה השלישית הציגה פחות וריאציה בהפחתת סולפט וזה הושג בממוצע של 10 ימים כפי שהוא נראה באיור 5. לאחר תקופה זו, הירידה של סולפט לקחה ממוצעת של 4 ימים (IV התקופה) ובתקופת V 4000 מ"ג / ליטר של סולפטהיו נצרך בפחות מ 24 שעות. הביצועים בbioreactor הוקם תחת מצב מתמשך לאחר 200 ימים בטיפול הורמונלי של 24 שעות.
ריכוז 5. סולפט (SO 4 2) איור לאורך הזמן במהלך היווצרות בוצת sulfidogenic בbioreactor. הקו הרציף מתייחס לinfluent ריכוז סולפט. ריבועים מתייחסים לריכוז סולפט בשפכים. נתון זה נלקח מאל-בראחס גררו et. (2014) 12 עם בעלי הזכויות המקביל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תוצאות טובות נציג בהפחתת סולפט, ריכוז גופרתי, צריכת COD ווריאציות pH לאורך הזמן הן shשלו באיור 6 א. תוצאות אלה התקבלו בניסויים שנערכו בעבר bioreactor היה תחת משטר רציף כמעט לשנה. בשלב זה קהילת החיידקים פותחה בbioreactor ובוצה שחורה הוקמה כפי שניתן לראות באיור 4. באיור 6 א ניתן לראות סולפט שהופחת בשעה 4 וגופרתי הגיע ריכוז מרבי של 1,200 ± 30 מ"ג / ליטר ו± 50 מ"ג 188 COD-H 2 S ד * VSS / g היה סולפט הפחתת פעילות. ראוי להזכיר כי הריכוז של גופרי שהושג בbioreactor נחשב גבוה ורעיל למיקרואורגניזמים, ובמקרה זה bioreactor לא פסק סולפט הפחתת פעילות.
איור 6. ביצועים של bioreactor לפני () ואחרי (ב) בנוסף TCE. סולפט (SO 4 2) (◇), סולפיד(H 2 S) (•). הנתונים שהוצגו הם הסטייה הממוצעת וסטנדרטית של n = 3. נתון זה נלקח מאל-בראחס גררו et. (2014) 12 עם בעלי הזכויות המקביל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
לניסוי שבו הבוצה נבדקה על היכולת להפחית TCE, התוצאות שהתקבלו מוצגות בלוח 1. סולפט הפחתת פעילות שהושגה היה נמוך במעט מהושג לפני תוספת TCE וכ -80% מTCE הופחתו ל ethene (ראה טבלה 1). יש צפויות תוצאות אלו בהתאם לזמן שבו הכור פעל בתנאי סולפט הפחתה. אין זה סביר כי הפחתת TCE מתרחשת אם הבוצה נלקחת כאשר הכור פועל בתקופה I או II (ראה איור 5
| פרמטר | ערך במהלך בדיקת הפחתת TCE | ||
| אחוז SO 4 2 הסר (%) | 98 (± 0.06) | ||
| סולפיד (S 2 H) ריכוז (מ"ג / ל ') | 971 (± 72) | ||
| 2 S אחוז ההמרה של SO 4 2 לH (%) | 68 (± 2) | ||
| אחוז הסרת COD (%) | 93 (± 0.1) | ||
| טווח ה- pH | 7.1-7.7 | ||
| הפקת גז (מיליליטר / ד) | 200 (± 55) | ||
| פעילות הפחתת סולפט (מ"ג COD-H 2 S ד / * VSS ז) | 161 (± 7) | ||
| * ריכוז סופי TCE (מיקרומטר) | 77 (± 8) | הריכוז ויניל כלוריד (מיקרומטר) | 16 (± 0.3) |
| ריכוז Ethene (מיקרומטר) | 202 (± 81) | ||
| אחוז הסרת TCE (%) | 74.3 (± 14) |
. טבלת 1. תוצאות על הביצועים של בוצת sulfidogenic במהלך ניסוי פירוק TCE טבלה זו שונה מאל-בראחס גררו et (2014) * ריכוז ראשוני TCE:.. 300 מיקרומטר. הנתונים שהוצגו הם ממוצעים וסטיית התקן של n = 3.
לאחר בדיקת הפחתת TCE, התוצאות להפחתת סולפט, ריכוז גופרתי, צריכת COD ווריאציות pH לאורך הזמן מוצגות באיור 6. תוצאות אלו מראות כי סולפט הופחת ב 5 שעות וריכוז גופרי הגיע 1,400 ± 35 מ"ג / ליטר, יחד עם סולפט הפחתת פעילות של248 ± 22 מ"ג COD-H 2 S ד * VSS / g. הפעילות מעט גבוהה יותר סולפט הפחתת - לעומת 188 ± 50 מ"ג COD-H 2 S / g ד * VSS - מצביעה על כך שקהילת החיידקים לא מעוכבת על ידי TCE.
תוצאות על מיקרואורגניזמים שזוהו בבוצה שימוש בפרוטוקול זה מוצגות בטבלה 2. סולפט הפחתת חיידקים, תסיסת חיידקים והחיידקים dehalogenating זוהו בבוצה שפותחה על ידי שימוש בפרוטוקול זה. התוצאות אינן מפתיעות משום bioreactor פעל במשך שנה תחת סולפט הפחתת תנאים וכמה ימים עם TCE. Genera של חיידקים כגון Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfitobacterium, Clostridium, r Dehalobacte וSulfurospirillum היה קשור לירידה ופירוק של תרכובות כלור סולפט. יתר על כן, זיהוי של מיקרואורגניזמים אלה בבוצהמאשר כי הפרוטוקול היה מוצלח בפיתוח בוצת sulfidogenic שעשויה לשמש להסרת זמנית של סולפט וטריכלורואתילן, שהוא אחד מתרכובות כלור הרעילות ביותר.
| חיידקים דיווחו | דמיון גבוה | זיהוי מקסימום |
| GI | 386685641 sp חסר תרבות Desulfovibrio. | desulfuricans Desulfovibrio | 96% |
| GI | 386685640 sp חסר תרבות Desulfomicrobium. | norvegicum Desulfomicrobium | 99% |
| GI | 386685639 sp חסר תרבות Desulfomicrobium. | baculatum Desulfomicrobium | 99% |
| GI | 386685638 sp חסר תרבות Desulfomicrobium. | Desulfomicrobium היפוgeium | 99% |
| GI | 386685637 sp חסר תרבות Desulfotomaculum. | acetoxidans Desulfotomaculum | 99% |
| GI | 386685636 sp Clostridium חסר תרבות. | celerecrescens Clostridium | 99% |
| GI | 386685635 sp חסר תרבות Desulfovibrio. | halophilus Desulfovibrio | 98% |
| GI | 386685634 sp חסר תרבות Dehalobacter. | restrictus Dehalobacter | 99% |
| GI | 386685633 sp חסר תרבות Desulfitobacterium. | hafniense Desulfitobacterium | 99% |
| GI | 386685632 sp חסר תרבות Sulfurospirillum. | multivorans Sulfurospirillum | 97% |
| GI | 386685631 sp חסר תרבות Sulfurospirillum. | halorespirans Sulfurospirillum | 97% |
הטבלה 2. קונסורציום שזוהה בבוצה של bioreactor והדמיון לחיידקים אחרים זיהוי מקס:. זהות המרבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם מספר יישומים של sulfidogenesis בביוטכנולוגיה הסביבתית, אחד היישומים הנפוצים ביותר של חילוף החומרים של חיידקי הפחתת סולפט בקונסורציומים עם תסיסת חיידקים היא בטיפול בשפכים. כורי UASB הם בין הגישות העיקריות מהונדסות לטיפול בשפכים תעשייתי בריכוזים גבוהים סולפט. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול להשיג בוצת sulfidogenic ממשקעים ימיים בכור UASB. השלבים הקריטיים בפרוטוקול להשיג בוצת sulfidogenic ממשקעים ימיים הם: (1) קידום homogeny של מדגם המשקעים להיות ממוקמים בכור, (2) האכלת הריכוז הנכון של חומצות גופרתי ושומן נדיפות (COD / SO 4 2) יחס, (3) ניתוח סולפט, גופרי, COD ו- pH מעת לעת, (4) מרעננים הבינוני הבסיסית, המכיל מתכות קורט ויטמינים בכל פעם שיצווה הוא התחיל. חשוב לקחת בחשבון כי הפיתוח של sludgדואר תלוי במידה רבה בקהילת החיידקים של המדגם המקורי ועל יתרות הזכות ההמוניות (סולפט וCOD). למרות שזה לוקח זמן לסולפט הפחתת פעילות לפתח, bioreactor דורש ניטור רציף כדי למנוע דליפות, תאונות, או חוסר זמני של אנרגיה שיכולה לעצור את משאבת סחרור או לכבות את בקרת הטמפרטורה. תשומת לב מיוחדת צריכה להיות משולם בביצועים של ניתוח הגופרתי, סולפט וCOD.
משקעים ימיים בכלל הם מקור טבעי של מגוון רחב של מיקרואורגניזמים; סביר להניח כי בוצה יכולה להיווצר עם משקעים ימיים נלקחו מעומקים שונים. בפרוטוקול זה שבחר להשתמש משקעים ימיים הידרותרמיות משתי סיבות עיקריות: (1) הפתחים הרדודים אלה ממוקמים בסמוך לעלות ו( 2) הסוג של אתרים אלה הם יותר בשפע בסולפידים, אשר היא אינדיקציה לירידת סולפט ו לכן, הנוכחות של חיידקי הפחתת סולפט. אם כל דבר, לוקח את sedimenTS מכל מקום אחר בקומה התת ימי רק ידרוש זמן רב יותר לבוצה לפתח, למרות שאנו חושבים שזה מאוד לא סביר.
כמו כן, יש צורך לערוך מספר בדיקות הפחתת TCE כדי לקדם את הנוכחות של מיקרואורגניזמים dehalogenating בבוצה להיות מזוהה יותר על ידי ביצוע ההליך הציע בפרוטוקול זה או בכל טכניקה אחרת ביולוגיה מולקולרית. חשוב לקחת בחשבון כי הפיתוח של מיקרו-אורגניזמים dehalogenating גם תלוי במקור של הבוצה, למרות שהספרות מתייחסת לנוכחות של סוג זה של מיקרואורגניזמים בכמה משקעי ים ברחבי העולם 7. Assay פעילות סולפט הפחתה מומלץ לאחר החשיפה של הבוצה הרעיל למתחם על מנת להעריך את הכדאיות של בוצת sulfidogenic לאחר מצב מלחיץ, למשל, הנוכחות של TCE. אם פעילות הפחתת סולפט של הבוצה מקטינה יהיה צורך לשמור על זה זהשבועות everal במצב אצווה נמאס עם סולפט וCOD לקדם שוב הגידול של פעילות הפחתת סולפט. ניתן לעשות זאת על ידי ביצוע הצעדים שהוצעו בפרוטוקול כדי לקדם sulfidogenesis וצמיחה של מיקרואורגניזמים. חשוב להזכיר שזה היה ניסיון להשיג בוצת dehalogenating-sulfidogenic ידי הוספת TCE וסולפט מאז תחילת culturing של המשקעים, אבל אין פעילות (או הפחתת סולפט או dehalogenating) אי פעם נצפתה. הנחה היה שהתוכן הנמוך של מיקרו-אורגניזמים הנמצאים בשלבים המוקדמים של התרבות לא לסבול TCE (אפילו בריכוז 20 מיקרומטר) השלבים, עם זאת, התוספת של TCE מאז תחילת ההעשרה תמיד יכול להיות ניסיון עם משקעים אחרים.
תוצאה טובה במקרה זה הייתה ההפחתה של TCE לethene, עם זאת, בהתאם למיקרואורגניזמים שהיו יכולות להיות מפותחים בבוצה ההפחתה של TCE עשויה להניב בעיקר dichloroethenes וvinכלוריד י.ל. (VC). במקרה זה הנתונים להפחתת TCE נרשמו לאחר כל מחזור טיפול הורמונלי בbioreactor במקום דגימה למוצרי ביניים שלה TCE ובמהלך המבחן הזמן. זה נעשה בדרך זו על מנת למנוע אידוי של תרכובות כלור בשל דגימה תכופה. לכן, אין גרפים של ריכוז TCE לאורך הזמן להראות אך הריכוזים בסוף כל ניסוי. חשוב כדי למנוע אידוי של תרכובות נדיפות כלור לדווח ריכוזים מדויקים שלהם ולהבחין אם ניתן לייחס את השינויים להפחתה ביולוגית במקום הפסדים. הנוכחות של ethene והעדר ביניים משותפים של TCE כגון ציס--1,2 dichloroethylene במוצרים הסופיים לאחר הפחתת TCE הוא מעניין במיוחד. זה כבר דווח כי תמיד הפחתת TCE המלאה לethene יכולה להתבצע רק על ידי sp Dehalococcoides. ובמקרה זה microorga אלהnisms לא אותר בקרב genera זוהה בבוצה. אנו מייחסים את הירידה לTCE cometabolism שאולי התעורר בבוצה בין dehalorespiring, התוסס וסולפט הפחתת חיידקים. חסרון בקונסורציום זה הוא שזה מקדם את הקמתה החולפת של VC, מתחם רעיל יותר TCE, לעומת זאת, זה ריכוזים נמוכים יחסית בהווה. ייתכן שניתן לומר בשלב זה פעילות cometabolic מאוד יוצאת דופן שפותחה על ידי קונסורציום ושמסלול הפחתת TCE חדש תחת סולפט הפחתת תנאים יכול להיחקר נוסף בנוכחות מיקרואורגניזמים halorespiring שזוהו בעבודה זו זו. מצד השני, זה כבר דווח בעבר כי גני dehalogenating לעתים קרובות זוהו במשקעים ימיים מתחת לפני הקרקע אך אין דיווחים על פירוק TCE עם משקעי התת ימי בשילוב עם תנאי סולפט הפחתה, זה, באמצעות סולפט כמקבל אלקטרונים חלופיים.
אחת המגבלות של שיטה זו היא שהמבנה של הבוצה תלויה במאפיינים הפיזיים של המשקעים משמשים ואף בשיטה זו הבוצה שנוצרה אפשרה fluidization טוב של הכור והיווצרות biofilm על הזכוכית, אנחנו לא יכולים לחזות כיצד זה באמת יעבוד באמצעות משקעים של מקומות שונים. ייתכן שניתן יהיה להשתמש בכורים קטנים יותר לבצע בדיקות מוקדמות ולהתבונן אם זה אפשרי. אם הכוונה היא לפעול בבוצה בbioreactor, אנחנו לא ממליצים להתחיל עם מיקרוקוסמוס. ההצעה היא לקבוע את הכור מההתחלה, אם כי בהיקף קטן יותר לניסיון הראשון.
השיטה שהוצגה כאן היא משמעותית שבבוצה שנוצרה סובלת ריכוזים גופרתי גבוהים מבוצת sulfidogenic אחרת שהושגו באמצעות התאמה של בוצת גרגירי Methanogenic לsulfidogenesis. השיטה מקדמת את הקמתה של בוצה עם קונסורציום הכולל חיידקי סולפט הפחתת חיידקים תסיסה ומותאמים בקלות כדי שיתפרקו תרכובות רעילות. בפרוטוקול זה השתמשנו TCE כדוגמא לתרכובת רעילה שכבר biodegraded רק בתנאי Methanogenic בכורים UASB. לדוגמא, אם המטרה של הכור היא biotransform ממסים כלור זה יכול להיות שימושי כדי להגדיל בהדרגה את ריכוז הממס, כלומר, TC גבוה יותרריכוז E בבדיקות, תוך הפחתת ריכוז סולפט כדי לעורר dehalogenation על הפחתת סולפט. אמנם, על פי התוצאות שהתקבלו בעבודה זו, אנחנו עדיין חושבים שסולפט לא ניתן להסיר לחלוטין מהתרבות אם תנאי סולפט הפחתה רצויים. יתר על כן, יש לשמור על תנאי הפחתת סולפט שכן חלק dehalorespirers גם מוריד סולפט. הבוצה שנוצרה בתנאים שתוארו בפרוטוקול זה יכול לשמש סופו של דבר כדי להסיר זמנית COD, סולפט, תרכובות רעילות כלור ומתכות כבדות. המתכות הכבדות יכולות לזרז עם הגופרתי היוצר על ידי הבוצה.
לבסוף, בוצת sulfidogenic נוצרה ניתן לבדוק עבור: (1) הסובלנות של ריכוזים גופרתי גבוהים יותר (למשל, כדי לזרז מתכות כבדות), (2) הפירוק של מזהמים אורגניים אחרים, או (3) הצריכה של פחמימנים כתורמי אלקטרונים במקום חומצות שומן נדיפות לפוrther לחקור היישומים שלה בביוטכנולוגיה הסביבתית. חשוב לקחת בחשבון שברגע שנוצרה הבוצה שהוא יכול לשמש כבוצת זרע לחסן כורים אחרים. במקרה כזה, תהליך הפחתת סולפט יתרחש באופן מיידי ולכן, זה לא יהיה צורך לחכות שנה כדי להפעיל את bioreactor באופן מלא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trichloroethylene | sigma Aldrich | 251402 | |
| cis-1,2-dichlorotehylene | sigma Aldrich | ||
| trans-1,2-dichloroethylene | sigma Aldrich | D-62209 | |
| vinyl chloride scotty standard | supelco | 1,000 ppm v/v in nitrogen | |
| ethene scotty standard | supelco | 99% purity | |
| pump | Masterflex | Model 7553-75 | |
| spectrophotometer | any | ||
| microcentrifuge | any | ||
| gas tight syringes | any | 100 and 200 microliters | |
| UASB glass reactor | any | under design | |
| gas chromatograph | any | FID detector | |
| capillary column SPB-624 | supelco | ||
| pH meter | any | ||
| viton tubing | Masterflex | ||
| basal medium reagents | any | ||
| trace metals reagents | any | ||
| vitamins solution reagents | any | ||
| sodium sulfate | any | ||
| volatile fatty acids | any | ||
| COD determination kit | HACH | range 0-15,000 mg/L | |
| TOPO-TA cloning kit pCR®4.0 | Invitrogen, US | ||
| S.N.A.P. TM Miniprep Kit | Invitrogen, UK | ||
| Pure link TM Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen |
References
- Lens, P., Esposito, M. V. G., Zandvoort, M. Perspectives of sulfate reducing bioreactors in environmental biotechnology. ReViews Environmental Science and Biotechnology. 1 (4), 311-325 (2002).
- Omil, F., Lens, P., Hulshoff, P., Lettinga, G. Characterization of biomass from a sulfidogenic, volatile fatty acid-degrading granular sludge reactor. Enzyme and MicrobialTechnology. 20, 229-236 (1997).
- Lopes, S. I. C., Wang, X., Capela, M. I., Lens, P. N. L. Sulfate reduction during the acidification of sucrose at pH 5 under thermophilic (55 °C) conditions.II: Effect of sulfide and COD/SO4-2 ratio. Bioresource Technology. 101, 4278-4284 (2010).
- Alfonso, P., Prol-Ledesma, R. M., Canet, C., Melgarejo, J. C., Fallick, A. E. Sulfur isotope geochemistry of the submarine hydrothermal coastal vents of Punta Mita, Mexico. Journal of Geochemical Exploration. 78-79, 301-304 (2003).
- Valdemarsen, T., Kristensen, E. Degradation of dissolved organic monomers and short chain fatty acids in sandy marine sediment by fermentation and sulfate reduction. Geochimica et Cosmochimica Acta. 74, 1593-1605 (2010).
- Quistad, S. D., Valentine, D. L. Anaerobic propane oxidation in marine hydrocarbon seep sediments. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75, 2159-2169 (2011).
- Futagami, T., Morono, Y., Terada, T., Kaksonen, A. H., Inagaki, F. Dehalogenation activities and distribution of reductive dehalogenase homologous genes in marine subsurface sediments. Applied and Environmental Microbiology. 75 (21), 6905-6909 (2009).
- U.S. Environmental Protection Agency. List of priority pollutants. Clean Water Methods. , (2014).
- Ozdemir, C., Dursun, S., Karatas, M., Sen, N., Sahinkaya, S. Removal of trichloroethylene (TCE) in upFlow anaerobic sludge blanket reactors (UASB). Biotechnology and Biotechnological Equipment. 21 (1), 107-112 (2007).
- Zhang, Y., Wang, X., Hu, M., Li, P. Effect of hydraulic retention time (HRT) on the biodegradation of trichloroethylene wastewater and anaerobic bacterial community in the UASB reactor. Applied Microbiology and Biotechnology. 99, 1977-1987 (2015).
- Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. , 20th Edn., American Public Health Association. Washington, DC. (1998).
- Guerrero-Barajas, C., et al. Enhanced sulfate reduction and trichloroethylene (TCE) biodegradation in a UASB reactor operated with sludge developed from hydrothermal vents sediments: process and microbial ecology. International Biodeterioration and Biodegradation. 94, 182-191 (2014).
- Trüper, H. G., Schlegel, H. G. Sulphur metabolism in Thiorhodaceae I. Quantitative measurements on growing cells of Chromatium okenii. Antoine van Leeuwenhoek. 30, 225-238 (1964).
- Gallegos-García, M. G. Biological processes of sulfate reduction in biofilms for metals precipitation [Ph D thesis]. , Intituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica. San Luis potosí, Mexico. (2009).
- Guerrero-Barajas, C., Garibay-Orijel, C., Rosas-Rocha, L. E. Sulfate reduction and trichloroethylene biodegradation by a marine microbial community from hydrothermal vents sediments. International Biodeterioration and Biodegradation. 65, 116-123 (2011).
