Introduction
Uno dei contributi più importanti alla biotecnologia ambientale è stata la progettazione di bioreattori in cui il fanghi utilizzati (inoculo) era in grado di eseguire in condizioni solfato riducendo. Riduzione solfato (SR) consente il trattamento dei flussi di acque reflue che contengono elevate concentrazioni di solfato oltre alla rimozione simultanea di COD, metalli pesanti e inquinanti organici, un fatto che rende una caratteristica desiderabile SR dei fanghi 1. Alcuni esempi di effluenti contaminati con solfato provengono da conceria, carta, farmaceutico e manifatturiero industrie chimiche 1. Tuttavia, la maggior parte della letteratura si riferisce a sulfidogenic fanghi quando metanogenica fango granulare è stata adattata per sulfidogenesis 2. Questo adattamento è comunemente ottenuto manipolando il COD / SO 4 2- rapporto nel bioreattore e aggiunta di prodotti chimici per inibire methanogens del 2,3 fanghi. In aggiunta al tempo che may richiedere la formazione di granuli sulfidogenic, la competizione tra methanogens e riduttori di solfato e la tolleranza del fango ad alte concentrazioni di solfuro sono alcuni dei problemi principali che possono insorgere se l'fanghi sulfidogenic utilizzato nel bioreattore è ottenuto dall'adattamento di prevalentemente fanghi metanogenica di solfato condizioni riducenti. In questo lavoro, si descrive la procedura per ottenere un fango prevalentemente sulfidogenic da sorgenti idrotermali sedimenti (Punta Mita, Nayarit, Messico) in un anaerobico reattore fanghi coperta flusso verso l'alto (UASB), poi si valuta il suo solfato riducendo l'attività nel tempo e condurre un esperimento per valutare la sua applicazione su declorazione riduttiva. La posizione dei sedimenti è stato scelto perché è stato riferito che in quel sito vi è formazione di solfuri dovuta all'attività solfato riducendo esibito dalla comunità microbica che abitano quel determinato posto 4.
Ci sono severAl vantaggi nell'ottenere questo fanghi sulfidogenic da sedimenti più di adattarsi metanogenica fango granulare a sulfidogenesis. Alcuni di questi vantaggi sono: (1) non è necessario formare granuli per il bioreattore di operare, (2) i fanghi tollera concentrazioni relativamente elevate di solfuro rispetto ad altri UASB che operano con adattato fanghi methanogenic, e (3) non viene competizione per substrato con methanogens anche se acetato è utilizzato nella miscela di acidi grassi volatili che è incluso nel mezzo di coltura per promuovere la formazione di fanghi.
Questa procedura è stata seguita per promuovere sulfidogenesis perché sedimenti marini sono una piscina naturale di una grande varietà di microrganismi come batteri solfato riduzione, fermentazione batteri e dealogenante batteri solo per citarne alcuni 5,6. Il tipo di consorzio sviluppato da sedimenti marini utilizzando questo protocollo può presentare efficienza nella riduzione solfato e quindi, alti s ulfate riducendo l'attività nel tempo e maggiore tolleranza al solfuro a concentrazioni superiori al segnalato come tossici per methanogens e solfato riducendo batteri. D'altro canto, è probabile che la capacità dealogenante è anche mostrato nei sedimenti seguendo il protocollo qui proposto ma può dipendere dalla comunità microbica originale. Questa ipotesi viene fatto sulla base del fatto che la declorazione riduttiva può avvenire sia con la respirazione o co-metabolismo, entrambe le condizioni che possono essere promossi nella comunità microbica marina 7. La coltivazione dei sedimenti per ottenere i fanghi è stata condotta utilizzando una miscela di acetato, propionato e butirrato come substrato perché questi acidi grassi volatili sono utilizzati da diversi ceppi di batteri solfato-riduzione. Questi acidi sono anche il tipo di composti di carbonio spesso si trovano nei sedimenti marini, secondo diversi rapporti in letteratura sul materiale carbonioso in sedimenti marini 5,6.
content "> Infine, alcuni dei composti più tossici che si trovano in corpi idrici e altri acqua in tutto il mondo sono i solventi clorurati come il tricloroetilene (TCE) o percloroetilene (PCE). Questi composti sono tossici, non solo per l'essere umano, ma anche a microrganismi, in particolare TCE, che è ancora considerato un inquinante prioritario dall'Agenzia di Protezione Ambientale degli Stati Uniti 8. In questo lavoro abbiamo proposto un esperimento in cui i fanghi sulfidogenic è testato su sua capacità di ridurre TCE a concentrazioni che sono nella gamma riportato per composti clorurati biodegradazione in condizioni methanogenic 9,10. Vale la pena ricordare che la maggior parte della ricerca sulla biodegradazione di composti clorurati è stata condotta in condizioni methanogenic 9,10. Riteniamo che l'esperimento con TCE proposto in questo protocollo è un buon esempio delle potenziali applicazioni del fango. L'obiettivo di questo esperimento era di evalutare la tolleranza del fango al TCE e l'effetto TCE sul solfato riduzione dell'attività. Tenendo conto che la maggior parte della ricerca sulla biodegradazione di composti clorurati è effettuata in condizioni methanogenic, questo protocollo suggerisce la formazione di un fango può essere usato per simultaneamente: (1) rimuovere solfato, (2) rimuovere COD e (3) rimuovere composti clorurati. Un ulteriore passo potrebbe essere quello di valutare l'fanghi sulla rimozione simultanea del TCE e metalli pesanti (in aggiunta a solfato e COD), due condizioni che non possono essere valutati in condizioni methanogenic.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figura 1. Schema per le fasi del protocollo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
1. Raccogliere marine sedimenti per la Formazione dei fanghi
- Identificare un'area sottomarina accessibile sia vicino a sorgenti idrotermali (a causa della presenza di solfuri, che può indicare una maggiore solfato riducendo l'attività) o ad una zona in cui i residui della sostanza organica sono rilevabili.
- Ai fini di questo lavoro, richiede circa 3 o 4 kg di sedimenti e drenare l'acqua fuori i campioni. Mettere i campioni in sacchetti di plastica scuri. Non è necessaria alcuna refrigerazione.
- Una volta in laboratorio, tenere le borse con i campioni in frigorifero, se non sono in corso per essere utilizzata immediatamente. Ai fini di questo lavoro, SAMPles può essere in frigorifero per settimane o mesi prima di utilizzarli.
- Prendere una grande porzione del campione di sedimento (cioè, 1 o 2 kg) e usare una rete appropriata (0,2 cm) per eliminare dai sedimenti grande detriti di materiale carbonioso che possono essere trovati o alcune rocce che possono essere presenti.
Nota: In questo caso una maglia di 0.20 cm di diametro (0,0767 in) è stato utilizzato, ma può essere di dimensioni diverse a seconda delle dimensioni delle particelle nel campione.- Dopo aver superato il sedimento attraverso la maglia, mescolare la porzione selezionata di promuovere che la porzione è omogenea.
- Prendere campioni più piccoli separati (cioè, da 2 a 3 g) determinare i solidi sospesi volatili (VSS) Opere seguendo i metodi standard 11.
Nota: Vedere la Figura 2 per i passaggi 1.2 a 1.4.
Figura 2. Le fotografie dei campioni di sedimento.Campioni (A) del sedimento appena dopo essere prese. Campione (B) del sedimento dopo il passaggio attraverso la rete. (C) Campione prelevato per la pesatura prima solidi sospesi volatili (VSS) determinazione. La piastra di Petri non ha bisogno di essere sterilizzati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
2. Bioreattore Set Up
- Ai fini di questo lavoro, utilizzare un reattore in vetro UASB con un volume totale di lavoro 3 L. In alternativa, utilizzare un reattore di vetro del volume 1 o 2 L.
- Sulla base del contenuto VSS dei sedimenti calcolare la quantità di sedimenti da utilizzare come inoculo per ottenere 5 g di VSS in 1 L.
- Tener conto che se la quantità di sedimenti dopo il calcolo è troppo grande, quindi circa il 25% al 30% del volume del bioreattore dovrebbe essere occupato da sedimenti invece.
- Registrare il contenuto VSS in quantocambierà quando la comunità microbica si arricchisce nel bioreattore. Il contenuto VSS è necessario per i calcoli di solfato di ridurre l'attività nel bioreattore.
- Assicurare che la concentrazione finale della soluzione tampone medio basale nel bioreattore è simile al riportato da Guerrero-Barajas et al. (2014) 12.
- Assicurarsi che i volumi finali dei sedimenti, medio basale, soluzione tampone e acidi grassi volatili sono pari al volume finale di lavoro del reattore. Il basale medio ricetta 12 contiene le concentrazioni adeguate per la metalli in tracce e vitamine soluzione.
- Preparare una soluzione stock di soluzione tampone terreno di base e in una concentrazione appropriata per il volume di lavoro del reattore utilizzato (ad esempio, 2, 3 o 4 volte più concentrato di quello riportato al punto 2.4) per garantire che quando viene diluito è alla concentrazione riportata da Guerrero-Barajas et al. (2014)12).
Nota: La soluzione madre per mezzo base è sempre necessario, tuttavia, la soluzione tampone è necessaria solo all'avviamento. Non è necessario aggiungere soluzione tampone dopo questo tempo. - Preparare una soluzione stock di acidi grassi volatili: acetato, propionato e butirrato in 2.5: 1: 1 COD proporzione. Prendere in considerazione per il calcolo del sodio acetato incluso nel terreno di base. La concentrazione finale COD nel reattore deve essere 2,7 g / L.
Attenzione: Preparare questa soluzione in una cappa aspirante. Indossare guanti di nitrile e occhiali per la preparazione di questa soluzione. Considerare la stechiometria delle reazioni di solfato con acidi grassi volatili che viene mostrato in figura 3. - Preparare una soluzione stock di solfato di sodio (Na 2 SO 4) in una concentrazione appropriata per fornire al reattore una concentrazione finale di 4,000 mg / l di ione solfato (SO 4 2-). In alternativa, includere °e quantità di solfato richiesto nel terreno di base invece di aggiungere da una soluzione madre finché il solfato finale (SO 4 2-) concentrazione è giusto.
- Posizionare i sedimenti nel reattore mescolato con una parte del terreno di base per assicurarsi che raggiungano il fondo del reattore.
- Aggiungere il resto della soluzione tampone basale medio e mescolato con la soluzione di acidi grassi volatili e la soluzione di solfato. Assicurarsi che la soluzione di acidi grassi volatili viene versato nel liquido. Nota: Effettuare questa operazione in una cappa aspirante.
- Impostare le connessioni e tubazioni del reattore per la pompa di riciclo. Impostare la portata di riciclaggio a 60 ml / min. Impostare il bioreattore nella camera di temperatura a 34 ° C. Regolarmente controllare che le variazioni di temperatura sono piccole (ad esempio, 34 ± 1,7 ° C)
- Impostare i collegamenti alla colonna di spostamento del gas.
Nota: La Figura 4 passi da 2.1 a 2.5. </ ol>
Figura 3. Stechiometria di riduzione solfato con VFA (acetato, propionato e butirrato). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. UASB reattore. (A) tempo iniziale. (B) il regime continua dopo 300 giorni di funzionamento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
3. Il funzionamento del reattore per promuovere Sulfidogenesis e crescita dei microrganismi
Nota: Consenti per l'inoculo di consumare la volatile acidi grassi e solfato. A questo scopo, attendere una settimana per effettuare la prima analisi solfato, solfuro e consumi COD.
- Dopo una settimana di incubazione prelevare un campione di 5 a 7 ml di liquido per condurre un'analisi per COD, solfato e solfuro contenuti e pH seguenti metodi standard 11, 13.
- Analizzare solfuro nella spettrofotometricamente liquido (ad una lunghezza d'onda (λ) di 670 nm) seguendo il metodo di metilene blu 13.
- Porre 5 ml di una soluzione di acetato di zinco (2% w / w) in un matraccio da 25 ml, aggiungere 200 ml di rapidamente il campione alla soluzione di acetato di zinco.
- Aggiungere 2,5 ml di N, N -dimethyl- p-fenilendiamina ossalato soluzione (DMP) (0,2% w / w in 20% H 2 SO 4) e 125 ml di ferro (III) soluzione di solfato di ammonio (10% w / w 2% in H 2 SO 4) e terminare con acqua distillata 25 ml in matraccio tarato. Attendere 30 minuti per la reazionea verificarsi, momento in cui il colore blu è stabilizzato. 13.
Nota: Attendere almeno 15 minuti, ma non più di 60 minuti per testare i campioni nello spettrofotometro. Effettuare la lettura della soluzione finale blu nello spettrofotometro.
- Analizzare solfato secondo metodi standard 11. Qui, come quantificare solfato di bario solfato utilizzando un metodo turbidimetrico.
- Mettere 5 ml di una soluzione di condizionamento (acido cloridrico HCl 1: 1) in un pallone tarato da 25 ml, aggiungere 1 ml di campione precedentemente centrifugato (a 11.320 xg), completare l'25 ml del pallone tarato con acqua distillata e aggiungere 1 g di cloruro di bario.
- Miscelare la soluzione per 1 minuto in un vortice. Attendere 4 min per il solfato di bario per formare e leggere il campione nel spettrofotometro a (λ) di 420 nm 11.
- Analizzare COD secondo metodi standard 11. In alternativa, utilizzare un COD DeterminaKit zione.
- Prima della determinazione COD, centrifugare il campione a fondo (a 11.320 xg) per rimuovere il solfuro restando che potrebbero interferire nella determinazione. Se necessario, centrifughi due volte: la prima volta immediatamente dopo il prelievo del campione e la seconda volta attendere 6 o 8 ore e quindi effettuare l'analisi COD.
- Aggiungere 2 ml di campione in una fiala reazione del kit di determinazione del COD, sigillare il flacone e omogeneizzare la miscela agitando con prudenza. Preparare un vuoto aggiungendo 2 ml di acqua distillata in un altro flacone di reazione e omogeneizzare la miscela.
- Posizionare le fiale nel reattore digestione a 150 ° C per 2 ore. Rimuovere le fiale e lasciateli raffreddare nel buio. Prendere le letture dei flaconi nella spettrofotometro ad una lunghezza d'onda di 620 nm.
- Ottenere il volume di gas dalla colonna spostamento gas.
- Analizzare solfuro nella spettrofotometricamente liquido (ad una lunghezza d'onda (λ) di 670 nm) seguendo il metodo di metilene blu 13.
- Attendere fino a un altro 5 a 7 giorni fino a quando il solfato è consumato. Solfato e COD devono essere consumati in unpproximately 85% al 90% prima che sia avviato un nuovo lotto alimentato.
- Una volta solfato (e COD) sono consumati, completamente ripetere il punto 2.4. Fornire un mezzo fresco e nuove sostanze nutritive per ciascun lotto.
- Ripetere i punti 3.1 e 3.2. A questo punto ogni partita dovrebbe durare tra i 7 ei 10 giorni.
- Quando sono state completate da 3 a 4 lotti, ripetere il passaggio 2.4 ma aumentare la concentrazione di COD 4 g / L.
- Ripetere il passaggio 3.1 e punto 3.2.
- Ripetere il punto 3.3, ma aumentare la concentrazione di COD 6 g / L.
- Ripetere 3.6 e 3.6.1 aumentando gradualmente concentrazione COD finché è 10 g / L.
Nota: rendere il grafico che presenta la concentrazione di solfato (mg / L) rispetto al tempo (d).
- Quando il consumo solfato è superiore all'80% in meno di 24 ore e questo avviene per più di una settimana, commutare il funzionamento del reattore a modalità continua. Per il funzionamento continuo impostare il tempo di ritenzione idraulica (HRT) a 24 ore e mantenere la concentrazione di solfato a 4 g / L e il CODa 10 g / L.
Nota: Nel corso del tempo il consumo di solfato dovrebbe essere veloce.
4. Solfato Ridurre test Attività
- Prima di questo test assicurarsi che il bioreattore in regime continuo presenta variazione inferiore al 10% della concentrazione di solfato rimanente.
- In un dato giorno, fermare il reattore dopo un ciclo di terapia ormonale sostitutiva e condotta passo 2.4. Per passo 2.4.3 utilizzare una concentrazione COD di 10 g / L.
- Una volta che il bioreattore è alimentato, prendere 5 a 7 ml di campioni di liquido e per eseguire analisi COD, solfato, solfuro (passo 3.1) e pH ogni ora. Registrare il volume di gas prodotto.
- Calcolare il solfato ridurre l'attività secondo la letteratura 14.
SRA = solfato riducendo l'attività (mg COD-H 2 S) / gVSS * d
m H 2 2 S
VSS = volatili concentrazione di solidi sospesi
t = tempo (d o ore)
- Fare le corrispondenti grafici che mostrano la percentuale di consumo di solfato in funzione della concentrazione di solfuro nel tempo in mg / L. Rendere i grafici che mostrano percentuale del consumo COD nel tempo. Rendere i grafici che mostrano la variazione di pH nel tempo.
5. tricloroetilene (TCE) Riduzione di prova
- Prima di questo test assicurarsi che il bioreattore lavora in regime continuo e presenta variazione inferiore al 10% della concentrazione di solfato rimanente. Non iniziare il test se riduzione solfato nel bioreattore è inferiore al 90%.
- Preparare una soluzione stock di tricloroetilene (TCE) tenendo conto che la concentrazione finale di questo composto nella fase liquida del bioreattore deve essere di 300 micron. Si consideri il partitioning del composto allo spazio di testa utilizzando la costante adimensionale legge Henry's (H') per TCE a 34 ° C. H'at 34 ° C per il TCE è 0,4722.
Attenzione: Preparare questa soluzione in un fumehood e indossare guanti e occhiali protettivi.- Ad esempio, per una soluzione madre 5.000 micron, calcolare come seguito:
Concentrazione TCE fase gassosa = (0,4722) * (5000) = 2.139 micron. Includere questa concentrazione nella preparazione della soluzione di riserva poiché questa quantità di TCE sarà nello spazio di testa.
Poi nel liquido (acqua) della soluzione madre, la concentrazione effettiva TCE sarà: 5,000 + 2,139 = 7.139 pM. Densità TCE = 1,43 g / ml. Convertire il 7139 pM a mg e poi in base alla densità del TCE calcolare il volume del TCE per soluzione madre.
Nota: La concentrazione della soluzione madre TCE may essere inferiore a 5.000 micron, cioè, 3000 o 1000 pM, questo dipende dalla quantità di volume di tale soluzione può essere consegnato al bioreattore secondo il volume fase liquida.
- Ad esempio, per una soluzione madre 5.000 micron, calcolare come seguito:
- Preparare curve standard nel gascromatografo per TCE, cis--1,2 dicloroetilene, trans -1,2-dicloroetilene, cloruro di vinile e etene. Preparare i cis -1,2-dicloroetilene e trans -1,2-DICLOROETILENE curve standard da una soluzione madre di questi composti seguendo la stessa procedura descritta per la soluzione 5.2 TCE magazzino. Preparare le curve standard per il cloruro di vinile e etilene diluendo la concentrazione di ciascun gas dagli standard (cilindri gas).
- Preparare le curve standard di questi composti in una gamma da 20 a 300 micron. Utilizzare il metodo riportato da Guerrero-Barajas et al. (2011) 15 per l'analisi di questi composti nel gascromatografo.
Attenzione: Preparare questi standLe soluzioni ard in un fumehood e indossare guanti e occhiali protettivi.
- Preparare le curve standard di questi composti in una gamma da 20 a 300 micron. Utilizzare il metodo riportato da Guerrero-Barajas et al. (2011) 15 per l'analisi di questi composti nel gascromatografo.
- In un dato giorno, fermare il reattore dopo un ciclo di terapia ormonale sostitutiva e condotta passo 2.4. Per passo 2.4.3 utilizzare una concentrazione COD di 10 g / L.
- Una volta che il bioreattore viene alimentato, aggiungere il TCE direttamente al liquido nel bioreattore dalla soluzione madre preparata in 5.2, la concentrazione finale TCE nella fase liquida del bioreattore deve essere di 300 pM. Impostare la HRT di 12 ore.
- Alla fine di un ciclo HRT prelevare campioni di liquido (500 a 1,000 microlitri) e l'analisi condotta per COD, solfato e solfuro (passi 3.1.1, 3.1.2 e 3.1.3). Prelevare campioni di spazio di testa (100 a 250 microlitri) e condurre analisi per TCE, cis -1,2-dicloroetilene, trans -1,2-dicloroetilene, cloruro di vinile e etilene nel gascromatografo.
- Ripetere il punto 2.4. Per passo 2.4.3 utilizzare una concentrazione COD di 10 g / L.
- Non ripetere qualsiasi test riduzione TCE fino al bioreattore presenta oltre 9Riduzione 0% solfato e meno del 10% di variazione in entrambi, riduzione solfato e solfato rimanente nel bioreattore.
- Ripetere 5.4, 5.5 e 5.6 due o tre volte di più.
- Dai campioni di sedimento (0,5 g) per condurre l'identificazione dei microrganismi subito dopo un test di riduzione TCE è terminata. Fare questo dopo 2 o 3 test di riduzione del TCE.
6. Solfato Ridurre test attività dopo TCE Riduzione Experiment
- Ripetere il punto 4 completamente.
7. Individuazione dei Microrganismi
- Prelevare campioni di fanghi di circa 0,5 g ciascuno e condurre l'estrazione di RNA totale secondo il metodo standard 12.
- Amplificare il gene 16S rRNA con la trascrizione inversa e condurre la reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) Rinforzo un passo 12.
- Progettare i primer per amplificare o usare come un primo approccio quelli proposti nella letteratura 11. Seguire la amplifProcedura icazione suggerito in letteratura 12.
- Costruire le librerie 16S rRNA. Ampliconi della PCR possono essere clonati utilizzando un kit di clonazione-11. Tipicamente, 10 colonie da ciascuna piastra (ogni colonia rappresenta un prodotto PCR) possono essere clonati. Preparare il DNA plasmidico per sequenziamento secondo quanto suggerito in letteratura 12.
- Condurre il sequenziamento dei frammenti. Re-amplificare circa 1.400 bp dei prodotti esterni PCR con il protocollo per l'amplificazione PCR precedentemente descritto (passo 7.4) e clone secondo quanto suggerito in letteratura 12. Isolare il plasmide ricombinante da E. colonie coli come suggerito in letteratura 12. Non condurre la gara parziale per il sequenziamento con M13 primer universali 12.
- Effettuare l'analisi di sequenze. Allineare le sequenze nucleotidiche tramite Clustal X e regolare manualmente nell'editor di testo. Effettuare ricerche BLAST delle databas NCBIe. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) 12.
- Ottenere i numeri di accesso sequenza nucleotidica. Depositare le sequenze nucleotidiche dei cloni individuati nel database sequenza nucleotidica EMBL (Gen-Bank / EMBL / DDBJ) sotto i corrispondenti numeri di accesso (ad esempio, per le sequenze da JQ713915eJQ713925 ampliconi) 12.
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Representative Results
Un comportamento tipico della riduzione solfato nel bioreattore è mostrato in Figura 5. E 'importante notare che durante le prime settimane di riduzione solfato funzionamento sarà lenta. Tuttavia lento, il consumo di oltre il 90% di solfato nel tempo indica che l'inoculo sta sviluppando una comunità microbica in grado di ridurre solfato e quindi arricchito in solforiduttori batteri. I diversi periodi della cifra indicano che la riduzione del solfato aumentava la sua velocità nel corso del tempo. All'inizio, il gruppo ha preso 20 giorni per il solfato di ridurre (Periodo I), allora il suo tasso di riduzione è in aumento, e ci sono voluti circa 10 giorni per ridurre il solfato alimentato (Periodo II). III periodo presentata meno variazione riduzione solfato e ciò è stato ottenuto in una media di 10 giorni, come si vede in Figura 5. Dopo questo periodo, la riduzione di solfato ha una media di 4 giorni (IV) e Tempi V 4.000 mg / L di solfatosono stati consumati in meno di 24 ore. L'andamento nel bioreattore è stato impostato in modalità continua dopo 200 giorni di terapia ormonale sostitutiva di 24 ore.
Figura 5. solfato (SO 4 2-) concentrazione nel tempo durante la formazione di fango sulfidogenic nel bioreattore. La linea continua si riferisce alla concentrazione affluente solfato. Squares riferiscono alla concentrazione di solfato nell'effluente. Questo dato è stato preso da Guerrero-Barajas et al. (2014) 12 con il permesso corrispondente diritto d'autore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Rappresentante buoni risultati su riduzione solfato, la concentrazione di solfuro, il consumo di COD e variazioni di pH nel tempo sono shproprio nella figura 6A. Questi risultati sono stati ottenuti in esperimenti condotti una volta che il bioreattore era sotto regime continuo quasi per un anno. A questo punto la comunità microbica è stata sviluppata nel bioreattore e morchia è stato formato come si può vedere in Figura 4B. Nella figura 6A si può vedere che è stato ridotto nel solfato 4 ore e solfuro raggiunto una concentrazione massima di 1200 ± 30 mg / L e 188 ± 50 mg COD-H 2 S / g VSS * d è stato solfato riduzione dell'attività. Vale la pena ricordare che la concentrazione di solfuro ottenuto nel bioreattore è considerato elevato e tossici per i microrganismi, e in questo caso il bioreattore non cessa solfato riduzione dell'attività.
Figura 6. Andamento del bioreattore prima (A) e dopo (B) l'aggiunta TCE. Solfato (SO 4 2-) (◇), solfuro(H 2 S) (•). I dati presentati sono la media e deviazione standard n = 3. Questo dato è stato preso da Guerrero-Barajas et al. (2014) 12 con il permesso corrispondente diritto d'autore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Per l'esperimento in cui il fango è stato testato sulla capacità di ridurre TCE, i risultati ottenuti sono riportati in Tabella 1. Il solfato di riduzione dell'attività ottenuto era leggermente inferiore al ottenuta prima dell'aggiunta TCE e circa il 80% del TCE è stata ridotta a etilene (vedi tabella 1). Questi risultati dovrebbero essere il previsto secondo il tempo in cui il reattore aveva operato in condizioni di solfato riducendo. È improbabile che la riduzione TCE verifica se è presa fanghi quando il reattore opera in Periodo I o II (vedere Figura 5
| Parametro | Valore durante il test di riduzione TCE | ||
| Percentuale di SO 4 2- rimozione (%) | 98 (± 0,06) | ||
| Solfuro (H 2 S) concentrazione (mg / L) | 971 (± 72) | ||
| Percentuale di conversione di SO 4 2- per H 2 S (%) | 68 (± 2) | ||
| Percentuale di rimozione COD (%) | 93 (± 0,1) | ||
| intervallo di pH | 7,1-7,7 | ||
| La produzione di gas (ml / d) | 200 (± 55) | ||
| Solfato attività riducendo (mg COD-H 2 S / g VSS * d) | 161 (± 7) | ||
| * Concentrazione finale TCE (micron) | 77 (± 8) | La concentrazione di cloruro di vinile (micron) | 16 (± 0.3) |
| Concentrazione etene (micron) | 202 (± 81) | ||
| Percentuale di rimozione TCE (%) | 74,3 (± 14) |
. Tabella 1. I risultati sulle prestazioni dei fanghi sulfidogenic durante l'esperimento TCE biodegradazione Questa tabella è stata modificata da Guerrero-Barajas et al (2014) * TCE concentrazione iniziale:.. 300 micron. I dati presentati sono la media e la deviazione standard dei n = 3.
Dopo il test di riduzione TCE, i risultati per riduzione solfato, concentrazione di solfuro, il consumo di COD e variazioni di pH nel tempo sono riportati nella Figura 6B. Questi risultati mostrano che il solfato è stato ridotto in 5 ore e la concentrazione di solfuro raggiunto 1,400 ± 35 mg / L, con una riduzione dell'attività di solfato248 ± 22 mg di COD-H 2 S / g VSS * d. Il leggermente superiore solfato riduzione dell'attività - rispetto a 188 ± 50 mg di COD-H 2 S / g VSS * d - indica che la comunità microbica non è stato inibito dal TCE.
I risultati sui microrganismi identificati nella fanghi utilizzati in questo protocollo sono presentati nella tabella 2. Solfato riducendo batteri, fermentazione batteri e batteri dealogenante sono stati identificati nella fanghi sviluppato utilizzando questo protocollo. I risultati non sono sorprendenti perché il bioreattore operava nel corso di un anno in solfato condizioni riducenti e diversi giorni con TCE. Generi di batteri quali Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfitobacterium, Clostridium, Dehalobacte r e Sulfurospirillum sono stati relativi alla riduzione solfato e la biodegradazione dei composti clorurati. Inoltre, l'identificazione di questi microrganismi nel fangoconferma che il protocollo era riuscito a sviluppare un fango sulfidogenic che può essere utilizzato per la rimozione simultanea di solfato e tricloroetilene, che è uno dei composti clorurati più tossici.
| Batteri segnalati | Alta somiglianza | max ident |
| gi | 386685641 Uncultured Desulfovibrio sp. | Desulfuricans Desulfovibrio | 96% |
| gi | 386685640 Uncultured Desulfomicrobium sp. | Desulfomicrobium norvegicum | 99% |
| gi | 386685639 Uncultured Desulfomicrobium sp. | Desulfomicrobium baculatum | 99% |
| gi | 386685638 Uncultured Desulfomicrobium sp. | Desulfomicrobium ipogeium | 99% |
| gi | 386685637 Uncultured desulfotomaculum sp. | Acetoxidans desulfotomaculum | 99% |
| gi | 386685636 Uncultured Clostridium sp. | Celerecrescens Clostridium | 99% |
| gi | 386685635 Uncultured Desulfovibrio sp. | Desulfovibrio halophilus | 98% |
| gi | 386685634 Uncultured dehalobacter sp. | Restrictus dehalobacter | 99% |
| gi | 386685633 Uncultured Desulfitobacterium sp. | Desulfitobacterium hafniense | 99% |
| gi | 386685632 Uncultured Sulfurospirillum sp. | Multivorans Sulfurospirillum | 97% |
| gi | 386685631 Uncultured Sulfurospirillum sp. | Halorespirans Sulfurospirillum | 97% |
Tabella 2. Consorzio ha individuato nei fanghi del bioreattore e la sua somiglianza con altri batteri ident Max:. Massimo identità.
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Discussion
Ci sono diverse applicazioni di sulfidogenesis della biotecnologia ambientale, una delle applicazioni più utilizzate del metabolismo dei batteri solfato riducenti in consorzi con fermentazione batteri è in trattamento delle acque reflue. Reattori UASB sono tra i principali approcci di ingegneria al trattamento delle acque reflue industriali con alte concentrazioni di solfato. In questo lavoro, vi presentiamo un protocollo per ottenere fanghi sulfidogenic da sedimenti marini in un reattore UASB. Le fasi critiche nel protocollo per ottenere un fango sulfidogenic da sedimenti marini sono: (1) promuovere l'omogeneità del campione di sedimento da inserire nel reattore, (2) alimentare il diritto concentrazione di acidi solfato e grassi volatili (COD / SO 4 2-) rapporto, (3) l'analisi del solfato, solfuro, COD e pH periodicamente, (4) rinfrescare il mezzo basale, che contiene tracce di metalli e vitamine ogni volta un batch viene avviato. È importante considerare che lo sviluppo del sludge dipende molto dalla comunità microbica del campione originale e sulla destra bilanci di massa (solfato e COD). Anche se ci vuole tempo per il solfato di ridurre l'attività per lo sviluppo, il bioreattore richiede un monitoraggio continuo per evitare perdite, incidenti o temporale mancanza di energia che possono interrompere la pompa di ricircolo o spegnere il controllo della temperatura. Particolare attenzione deve essere prestata nello svolgimento dell'analisi di solfuro, solfato e COD.
Sedimenti marini in generale sono una fonte naturale di un'ampia varietà di microrganismi; è probabile che i fanghi può essere formata con sedimenti marini provenienti da diverse profondità. In questo protocollo è stato scelto di utilizzare idrotermali sedimenti marini per due ragioni principali: (1) questi fori superficiali sono situati vicino al costo e (2) questo tipo di siti sono più abbondanti in solfuri, che è un'indicazione di riduzione solfato e Pertanto, la presenza di batteri solfato riducenti. Se non altro, prendendo le sedimentazionets da qualsiasi altro posto al piano sottomarine avranno solo bisogno di più tempo per il fango di sviluppare, anche se pensiamo che questo è molto improbabile.
Inoltre, è necessario effettuare diverse prove di riduzione TCE promuovere la presenza di microrganismi nel fango dealogenante essere ulteriormente identificati seguendo la procedura proposta in questo protocollo o qualsiasi altra tecnica di biologia molecolare. È importante considerare che lo sviluppo di microrganismi dealogenante dipende anche dalla fonte dei fanghi, anche se la letteratura si riferisce alla presenza di questo tipo di microrganismi in vari sedimenti marini tutto il mondo 7. Un solfato riducendo saggio di attività è consigliato dopo l'esposizione del fango al composto tossico per valutare la vitalità dei fanghi sulfidogenic dopo una condizione di stress, ad esempio, la presenza di TCE. Se il solfato ridurre l'attività del fango diminuisce sarà necessario mantenerlo ssettimane everal in modalità batch alimentati con solfato e COD promuovere nuovamente l'aumento di solfato riduzione dell'attività. Questo può essere fatto seguendo i passi suggeriti nel protocollo di promuovere sulfidogenesis e la crescita di microrganismi. È importante ricordare che si è tentato di ottenere un fango sulfidogenic-dealogenante aggiungendo TCE e solfato dall'inizio della coltura dei sedimenti, ma nessuna attività (sia solfato riducendo o dealogenante) è stata mai osservata. Si è supposto che il basso contenuto di microrganismi presenti nelle prime fasi della coltura non tollerare il TCE (anche a 20 concentrazione uM), tuttavia, l'aggiunta del TCE dall'inizio dell'arricchimento può sempre essere tentata con altri sedimenti.
Un buon risultato in questo caso è stata la riduzione del TCE in etene, tuttavia, a seconda delle microorganismi che potrebbero sono sviluppate nei fanghi riduzione del TCE può produrre principalmente dichloroethenes e vincloruro YL (VC). In questo caso i dati ottenuti per riduzione TCE sono registrati dopo ogni ciclo HRT nel bioreattore invece di campionamento per TCE e suoi prodotti intermedi costante durante la prova. E 'stato fatto in modo che, al fine di evitare l'evaporazione dei composti clorurati dovuta al campionamento frequente. Pertanto, non ci sono grafici di concentrazione TCE nel tempo per mostrare ma le concentrazioni al termine di ogni esperimento. È importante evitare l'evaporazione dei composti clorurati volatili segnalare concentrazioni accurate di loro e di distinguere se le modifiche possono essere attribuiti alla riduzione biologica invece di perdite. La presenza di etilene e l'assenza di intermedi comuni TCE quali cis -1,2-dicloroetilene nei prodotti finali dopo la riduzione TCE è particolarmente interessante. Si è sempre riportato che la completa riduzione TCE in etene può essere eseguita solo da Dehalococcoides sp. e in questo caso queste microorgasmi non sono stati rilevati tra i generi individuate nel fango. Noi attribuiamo la riduzione TCE per il co-metabolismo che sono sorti nel fango tra il dehalorespiring, la fermentazione e la riduzione dei batteri solfato. Un difetto in questo consorzio è che promuove la formazione transitoria di VC, un composto più tossico TCE, tuttavia, è presente concentrazioni relativamente basse. Può essere possibile dire a questo punto che una attività insolita cometabolic stato sviluppato dal consorzio e che un nuovo percorso di riduzione TCE sotto solfato condizioni riducenti può essere ulteriormente studiato in presenza di microrganismi halorespiring identificate in questo lavoro. D'altra parte, è stato precedentemente riportato che i geni dealogenante sono sovente individuate nel sottosuolo sedimenti marini ma non ci sono rapporti sul TCE biodegradazione con sedimenti sottomarini combinate con condizioni solforiduttori, questo è, usando solfato come accettore di elettroni alternativo.
Uno dei limiti di questo metodo è che la struttura dei fanghi dipende dalle caratteristiche fisiche del sedimento utilizzato e anche se in questo modo i fanghi formata consentito una buona fluidificazione del reattore e formazione di biofilm sul vetro, non si può prevedere come sarebbe effettivamente lavorare con sedimenti di luoghi diversi. Può essere possibile utilizzare reattori piccole per prove preliminari eosservare se è fattibile. Se l'intenzione è quella di operare con il fango in un bioreattore, non si consiglia di iniziare con microcosmi. Il suggerimento è di impostare il reattore dall'inizio, anche se con un volume minore per il primo tentativo.
Il metodo qui presentato è significativa in quanto i fanghi formata tollera concentrazioni di solfuro elevati rispetto ad altri fanghi sulfidogenic che si ottengono attraverso l'adattamento di metanogenica fango granulare a sulfidogenesis. Il metodo promuove la formazione di fanghi con un consorzio che include solfato riducendo batteri e batteri fermentazione e facilmente adattabile a biodegradarsi composti tossici. In questo protocollo abbiamo utilizzato TCE come esempio di un composto tossico che è stato biodegradato solo in condizioni methanogenic nei reattori UASB. Ad esempio, se lo scopo del reattore è di biotrasformare solventi clorurati potrebbe essere utile per aumentare gradualmente la concentrazione di solvente, cioè, superiore TCE la concentrazione nelle prove, mentre diminuisce la concentrazione di solfato di stimolare dealogenazione su riduzione solfato. Anche se, in base ai risultati ottenuti in questo lavoro, pensiamo ancora che solfato non può essere completamente rimosso dalla cultura se le condizioni solforiduttori sono desiderabili. Inoltre, condizioni riducenti solfato devono essere mantenuti quanto alcuni dehalorespirers sono anche riduttori solfato. I fanghi generati nelle condizioni descritte in questo protocollo potrebbe essere eventualmente utilizzato per rimuovere simultaneamente COD, solfato, composti tossici clorurati e metalli pesanti. I metalli pesanti possono precipitare con il solfuro prodotta dai fanghi.
Infine, i fanghi sulfidogenic formata può essere testato per: (1) la tolleranza di concentrazioni di solfuro superiore (ad esempio, per far precipitare i metalli pesanti), (2) la biodegradazione di altri inquinanti organici, o (3) il consumo di idrocarburi come donatori di elettroni invece di acidi grassi volatili FUrther esplorare le sue applicazioni nel campo delle biotecnologie ambientali. È importante considerare che, una volta formato il fango può essere usato come fanghi seme per inoculare altri reattori. In tal caso, il processo di riduzione solfato avverrà immediatamente e quindi non sarà necessario attendere un anno per operare pienamente bioreattore.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trichloroethylene | sigma Aldrich | 251402 | |
| cis-1,2-dichlorotehylene | sigma Aldrich | ||
| trans-1,2-dichloroethylene | sigma Aldrich | D-62209 | |
| vinyl chloride scotty standard | supelco | 1,000 ppm v/v in nitrogen | |
| ethene scotty standard | supelco | 99% purity | |
| pump | Masterflex | Model 7553-75 | |
| spectrophotometer | any | ||
| microcentrifuge | any | ||
| gas tight syringes | any | 100 and 200 microliters | |
| UASB glass reactor | any | under design | |
| gas chromatograph | any | FID detector | |
| capillary column SPB-624 | supelco | ||
| pH meter | any | ||
| viton tubing | Masterflex | ||
| basal medium reagents | any | ||
| trace metals reagents | any | ||
| vitamins solution reagents | any | ||
| sodium sulfate | any | ||
| volatile fatty acids | any | ||
| COD determination kit | HACH | range 0-15,000 mg/L | |
| TOPO-TA cloning kit pCR®4.0 | Invitrogen, US | ||
| S.N.A.P. TM Miniprep Kit | Invitrogen, UK | ||
| Pure link TM Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen |
References
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