Introduction
En av de viktigste bidrag til miljø bioteknologi var utformingen av bioreaktorer, hvor slammet som brukes (inoculum) var i stand til å utføre i henhold til sulfat reduserende betingelser. Sulfat reduksjon (SR) tillater rensing av avløpsvann strømmer som inneholder høye konsentrasjoner av sulfat i tillegg til den samtidige fjerning av COD, tungmetaller og organiske miljøgifter, et faktum som gjør SR en ønskelig egenskap av slammet 1. Noen eksempler på utslipp forurenset med sulfat kommer fra garveri, papir, farmasøytisk og kjemisk industri 1. Men de fleste av litteraturen viser til sulfidogenic slam når metanogenisk granulert slam har blitt tilpasset til sulfidogenesis 2. Denne tilpasningen er vanligvis oppnådd ved å manipulere COD / SO 4 2- forholdet i bioreaktoren og tilsetning av kjemikalier for å hemme metanogener i slammet 2,3. I tillegg til den lange tid som may krever dannelsen av sulfidogenic granuler, konkurransen mellom metanogener og sulfatreduserende midler og toleransen av slammet for høye konsentrasjoner av sulfid er noen av de viktigste problemene som kan oppstå dersom sulfidogenic slam som brukes i bioreaktoren er hentet fra tilpasning av overveiende metanogenisk slam til sulfatreduserende forhold. I dette arbeidet, beskriver vi fremgangsmåten for å få en overveiende sulfidogenic slam fra hydrotermale sedimenter (Punta Mita, Nayarit, Mexico) i en oppstrøms anaerob slamteppe reaktor (UASB), så vi evaluere sitt sulfatreduserende aktivitet over tid og gjennomføre et eksperiment for å evaluere dens anvendelse ved reduktiv dechlorination. Plasseringen av sedimentene ble valgt fordi det er blitt rapportert at i dette området er det dannelse av sulfider på grunn av den sulfatreduserende aktivitet som utvises av den mikrobielle samfunnet bebor det aktuelle sted 4.
Det er several fordeler med å få dette sulfidogenic slam fra sedimenter i løpet tilpasse metanogenisk granulert slam til sulfidogenesis. Noen av disse fordeler er: (1) det er ikke nødvendig for å danne granuler for bioreaktoren å operere, (2) den slam tåler forholdsvis høye konsentrasjoner av sulfid i forhold til andre UASB som opererer med tilpasset metanogenisk slam, og (3) det er ingen konkurranse for underlaget med metanogener selv om acetat anvendes i en blanding av flyktige fettsyrer som inngår i kulturmediet for å fremme dannelsen av slam.
Denne prosedyren ble fulgt for å fremme sulfidogenesis fordi marine sedimenter er et naturlig basseng av et bredt spekter av mikroorganismer som sulfatreduserende bakterier, fermen bakterier og dehalogenating bakterier bare for å nevne noen få 5,6. Den type konsortium utviklet fra marine sedimenter ved hjelp av denne protokollen kan utvise effektivitet i sulfat reduksjon, og derfor høye s ulfate redusere aktivitet over tid og høyere toleranse for sulfid i konsentrasjoner høyere enn rapportert som giftig for metanogener og sulfatreduserende bakterier. På den annen side er det sannsynlig at dehalogenating evne er også vist i sedimentene ved å følge protokollen foreslått her, men det kan være avhengig av den opprinnelige mikrobielle samfunnet. Denne antakelsen er gjort basert på det faktum at reduktive dechlorination kan skje enten ved respirasjon eller cometabolism, begge forhold som kan bli fremmet i det marine mikrobielle samfunn 7. Dyrking av sedimentene for å oppnå slammet ble utført ved anvendelse av en blanding av acetat, propionat og butyrat som substrat, fordi disse flyktige fettsyrer blir brukt av flere stammer av sulfatreduserende bakterier. Disse syrene er også typen av karbonforbindelser som ofte finnes i marine sedimenter, ifølge flere rapporter i litteraturen med karbonholdig materiale i marine sedimenter 5,6.
innhold "> Endelig er noen av de mest giftige forbindelser som finnes i grunnvann og andre vassdrag i verden er de klorerte løsningsmidler slik som trikloretylen (TCE) eller perkloretylen (PCE). Disse forbindelser er giftige, ikke bare for mennesket, men også for mikroorganismer, særlig TCE, som fortsatt betraktet som en prioritet forurensende av Environmental Protection Agency i USA 8. I dette arbeidet foreslo vi et eksperiment hvor sulfidogenic slammet blir testet på sin evne til å redusere TCE ved konsentrasjoner som er i spredningen for klorerte forbindelser biologisk nedbrytning i henhold metanogenisk forhold 9,10. Det er verdt å nevne at det meste av forskningen på biologisk nedbrytning av klorerte forbindelser har blitt gjennomført under metanogenisk forhold 9,10. Vi anser at forsøket med TCE foreslått i denne protokollen er en godt eksempel på de potensielle anvendelser av slammet. Formålet med dette eksperimentet var å evaluate toleransen av slammet til TCE og TCE virkning på sulfatreduserende aktivitet. Tatt i betraktning at det meste av forskningen på biologisk nedbrytning av klorerte forbindelser blir utført under metanogenisk forhold, foreslår denne protokollen dannelse av et slam kan brukes for samtidig å: (1) å fjerne sulfat, (2) fjerne COD og (3) fjerne klorerte forbindelser. Et ytterligere trinn kan være å evaluere slammet på den samtidige fjerning av TCE og tungmetaller (i tillegg til sulfat og COD), to forhold som ikke kan bli evaluert under metanogenisk betingelser.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1. Skjema for trinnene i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
1. Samle marine sedimenter for dannelse av slam
- Identifisere et slick undersjøisk område enten nær hydrotermale (på grunn av tilstedeværelsen av sulfider, som kan indikere en høyere sulfatreduserende aktivitet) eller til et område der rester av organisk materiale kan påvises.
- For hensikten med dette arbeidet, ta ca 3 eller 4 kg sediment og tapp ut vannet av prøvene. Plasser prøvene i mørke plastposer. Ingen kjøling er nødvendig.
- En gang i laboratoriet, holde poser med prøvene i kjøleskapet hvis de ikke kommer til å bli brukt umiddelbart. For hensikten med dette arbeidet, SAMPles kan være i kjøleskapet i flere uker eller måneder før du bruker dem.
- Ta en stor del av sedimentprøve (dvs. 1 eller 2 kg) og bruke en passende mesh (0,2 cm) for å eliminere fra sedimentene den store vrakrester av karbonholdig materiale som kan bli funnet eller noen steiner som kan være til stede.
NB: I dette tilfelle et nett med 0,20 cm diameter (0,0767 tommer) ble anvendt, men det kan være av en forskjellig størrelse i forhold til størrelsen av partiklene i prøven.- Etter å ha passert gjennom sedimentet mesh, blandes det parti valgt for å fremme at delen er homogen.
- Ta adskilte små prøver (dvs. 2 til 3 g) for å bestemme de flyktige suspenderte faststoffer (VSS) innhold ved å følge standardmetoder 11.
Merk: Se figur 2 for trinn 1.2 til 1.4.
Figur 2. Fotografier av sedimentprøvene.(A) sedimentprøver like etter at de er tatt. (B) Sediment prøven etter å ha passert gjennom maskene. (C) Prøve tatt ved veiing før flyktige suspenderte faste stoffer (VSS) bestemmelse. Petriskålen trenger ikke å bli sterilisert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. bioreaktor Set Up
- For formålet med dette arbeidet, bruke en UASB-glassreaktor med en total arbeidsvolum på 3 L. Alternativt kan en bruke en eller to L volum glassreaktor.
- Basert på det VSS innholdet av sedimentene beregne mengden av sedimentet som skal brukes som inokulum for å oppnå 5 g av VSS i 1 L.
- Ta hensyn til at dersom mengden av sediment etter beregningen er for stor, bør da omtrent 25% til 30% volum av bioreaktoren være okkupert av sedimenter i stedet.
- Spill VSS innhold siden detvil endre seg når den mikrobielle samfunnet er anriket i bioreaktoren. VSS innholdet er nødvendig for beregning av sulfatreduserende aktivitet i bioreaktoren.
- Sørge for at den endelige konsentrasjon av basal medium og bufferoppløsningen i bioreaktoren er lik den rapportert av Guerrero-Barajas et al. (2014) 12.
- Sikre at det endelige volum av sedimentene, basal medium, bufferoppløsning og flyktige fettsyrer er lik de endelige arbeidsvolum av reaktoren. Basal medium oppskrift 12 inneholder de riktige konsentrasjoner for spormetaller og vitaminer løsning.
- Tilbered en stamløsning av basal medium og bufferløsning i en passende konsentrasjon for den arbeidsvolum av reaktoren som brukes (dvs. to, tre eller fire ganger mer konsentrert enn den rapportert i trinn 2.4) for å sikre at når det er fortynnet, er det ved konsentrasjonen rapportert av Guerrero-Barajas et al. (2014)12).
Merk: stamløsning for den basale mediet er alltid nødvendig, men er bufferoppløsningen bare nødvendig ved start opp. Det er ikke nødvendig å tilsette bufferoppløsning etter denne tid. - Tilbered en stamløsning av flyktige fettsyrer: acetat, propionat og butyrat i et 2,5: 1: 1 COD proporsjon. Ta hensyn til beregningene av natriumacetat inkludert i basal medium. Den endelige COD-konsentrasjonen i reaktoren må være 2,7 g / l.
Forsiktig: Forbered denne løsningen i en avtrekkshette. Bruke nitrilhansker og goggles for utarbeidelsen av denne løsningen. Ta hensyn til støkiometrien av reaksjoner av sulfat med de flyktige fettsyrer som er vist i figur 3. - Tilbered en stamløsning av natriumsulfat (Na 2 SO 4) i en passende konsentrasjon til å levere til reaktoren en sluttkonsentrasjon på 4000 mg / l av sulfationet (SO 4 2-). Alternativt isere mengde sulfat som kreves i basalmedium i stedet for å legge det fra en stamløsning, så lenge den endelige sulfat (SO 4 2-) konsentrasjonen er riktig.
- Plasser sedimenter i reaktoren blandes med en del av det basale medium for å sikre at de når bunnen av reaktoren.
- Tilsett resten av basal medium og bufferløsning blandet med den flyktige fettsyrer løsning og sulfatoppløsningen. Sørg for at løsningen av flyktige fettsyrer helles i væsken. Merk: Gjennomføre dette trinnet i en avtrekkshette.
- Angi de forbindelser og rørledninger fra reaktoren til resirkuleringspumpen. Still resirkuleringsstrømningshastighet på 60 ml / min. Satt bioreaktoren i temperaturkammer ved 34 ° C. Kontroller regelmessig at temperaturvariasjonene er små (dvs. 34 ± 1.7 ° C)
- Still forbindelser til gass fortrengning kolonnen.
Merk: Se figur 4 for trinn 2,1 til 2,5. </ ol>
Figur 3. Støkiometri av sulfat reduksjon med VFA (acetat, propionsyre og smørsyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. UASB reaktoren. (A) Initial tid. (B) Kontinuerlig regime etter 300 dagers drift. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. drift av reaktoren for å fremme Sulfidogenesis og vekst av mikroorganismer
Merk: Tillat for inokulumet å konsumere volatile fettsyrer og sulfat. For dette formål, vente i en uke for å gjennomføre den første analysen av sulfat, sulfid og COD forbruk.
- Etter en ukes inkubasjon ta en prøve på 5 til 7 ml av væsken til å utføre analysen for COD, sulfat og innhold sulfid og pH ved å følge standard fremgangsmåter for 11, 13.
- Analyser sulfid i det flytende spektrofotometrisk (ved en bølgelengde (λ) av 670 nm) ved å følge fremgangsmåten 13 metylenblått.
- Plassere 5 ml av en sink-acetat-oppløsning (2% vekt / vekt) i en 25 ml målekolbe, tilsett raskt 200 ul av prøven til sink-acetat-løsning.
- Legg 2,5 ml av en N, N-dimetyl-p-fenylendiamin oksalat (DMP) oppløsning (0,2% w / w i 20% H 2 SO 4) og 125 ul av jern (III) ammoniumsulfat-løsning (10% w / w i 2% H 2 SO 4) og utstyrt med destillert vann til 25 ml i målekolbe. Vente 30 min for reaksjonenskal finne sted, ved hvilket tidspunkt den blå farge er stabilisert. 13.
Merk: Vent minst 15 minutter, men ikke mer enn 60 min å teste prøvene i spektrofotometer. Gjennomføre avlesningen av blå endelige løsningen i spektrofotometeret.
- Analyser sulfat i henhold til standardmetoder 11. Her, kvantifisere sulfat som bariumsulfat ved hjelp av en turbidimetrisk metode.
- Plasser 5 ml av en kondisjoneringsløsning (saltsyre HCl 1: 1) i en volumetrisk kolbe på 25 ml, tilsett 1 ml av den tidligere sentrifugeres prøven (ved 11 320 x g), fullføre 25 ml av den volumetriske kolbe med destillert vann og tilsett 1 g bariumklorid.
- Bland løsningen i 1 min i en vortex. Vent i 4 min for å danne bariumsulfat og lese prøven i spektrofotometer ved en bølgelengde (λ) på 420 nm 11.
- Analyser COD i henhold til standardmetoder 11. Alternativt kan du bruke en COD bestemmelsesjon kit.
- Før bestemmelse COD, sentrifuger prøven grundig (ved 11 320 xg) for å fjerne det gjenværende sulfid som kan gripe inn i bestemmelsen. Om nødvendig, sentrifuger to ganger: første gang umiddelbart etter å ha tatt prøven og den andre gangen vente 6 eller 8 timer, og deretter gjennomføre COD analyse.
- Tilsett 2 ml av prøven til en reaksjon hetteglass av COD besluttsomhet kit, forsegle flasken og homogen blandingen ved forsiktig risting. Tilbered en blank ved tilsetning av 2 ml destillert vann til en annen reaksjonsglasset og homogenisere blandingen.
- Plasser hetteglassene i fordøyelsen reaktoren ved 150 ° C i 2 timer. Ta hetteglassene og la dem kjøle seg ned i mørket. Ta målinger av hetteglassene i spektrofotometer med en bølgelengde på 620 nm.
- Innhent gassvolumet fra gassfortrengnings kolonnen.
- Analyser sulfid i det flytende spektrofotometrisk (ved en bølgelengde (λ) av 670 nm) ved å følge fremgangsmåten 13 metylenblått.
- Vente i opptil en annen 5 til 7 dager før sulfat er fortært. Sulfat og COD må forbrukes i enpproximately 85% til 90% før en ny matet satsvis startes.
- Når sulfat (og COD) er fortært, helt gjenta trinn 2.4. Levere fersk medium og nye næringsstoffer for hvert parti.
- Gjenta trinn 3.1 og 3.2. På dette punktet hvert parti skal vare mellom 7 og 10 dager.
- Når tre til fire grupper har blitt fullført, gjentar trinn 2,4, men økning av COD konsentrasjon til 4 g / l.
- Gjenta trinn 3,1 og trinn 3.2.
- Gjenta trinn 3,3, men økning av COD konsentrasjon til 6 g / l.
- Gjenta 3.6 og 3.6.1 gradvis økende COD-konsentrasjon til den er 10 g / l.
Merk: Kontroller grafen som presenterer sulfate konsentrasjon (mg / L) versus tid (d).
- Når sulfatforbruket er over 80% i løpet av mindre enn 24 timer, og dette forekommer i mer enn en uke, flytte driften av reaktoren i kontinuerlig modus. For den kontinuerlige modus setter hydraulisk retensjonstid (HRT) ved 24 timer og opprettsulfatkonsentrasjon på 4 g / l og CODpå 10 g / l.
Merk: Over tid sulfat forbruk bør være raskere.
4. sulfatreduserende aktivitet Test
- Forut for denne testen være sikker på at bioreaktoren under kontinuerlig regime presenterer mindre enn 10% variasjon i sulfatkonsentrasjonen værende.
- På en gitt dag, stoppe reaktoren etter en HRT syklus og oppførsel trinn 2.4. For trinn 2.4.3 bruker en COD konsentrasjon på 10 g / L.
- Når bioreaktoren er matet, ta 5 til 7 ml prøver av væsken og utføre analyse for COD, sulfat, sulfid (trinn 3.1) og pH hver time. Spill gassen produsert volum.
- Beregn sulfatreduserende aktivitet i henhold til litteraturen 14.
SRA = sulfatreduserende aktivitet (mg COD-H 2 S) / gVSS * d
m H to 2 S
VSS = flyktig suspendert tørrstoff konsentrasjon
t = tid (d eller hr)
- Foreta de tilsvarende diagrammer som viser prosentandelen av sulfatforbruket versus sulfidkonsentrasjonen over tid i mg / l. Gjør grafene som viser prosentandelen av COD forbruk over tid. Gjør grafene som viser pH variasjon over tid.
5. Trichloroethylene (TCE) Reduction Test
- Forut for denne testen være sikker på at bioreaktoren er i bruk under kontinuerlig regime og viser mindre enn 10% variasjon i sulfatkonsentrasjonen værende. Ikke start denne testen hvis sulfat reduksjon i bioreaktor er mindre enn 90%.
- Tilbered en stamløsning av trikloretylen (TCE) tar hensyn til at sluttkonsentrasjonen av denne forbindelse i den flytende fase av bioreaktoren må være 300 pM. Tenk partitioning av forbindelsen til topprommet ved hjelp av Henry sin Law dimensjonsløs konstant (H') for TCE ved 34 ° C. H'at 34 ° C for TCE er 0,4722.
Forsiktig: Forbered denne løsningen i en fumehood og bruke hansker og vernebriller.- For eksempel, for en 5000 pM stamløsning, beregne på følgende måte:
TCE gassfasekonsentrasjon = (0,4722) (5,000) = 2,139 uM. Omfatter denne konsentrasjonen ved fremstilling av stamløsningen siden denne mengde TCE vil være i topprommet.
Deretter i væske (vann) av stamløsningen, vil den faktiske TCE-konsentrasjon være: 5,000 + 2,139 = 7,139 uM. TCE densitet = 1,43 g / ml. Konverter 7139 pM til mg og deretter ved hjelp av tettheten av TCE beregne volumet av TCE for stamløsningen.
Merk: Konsentrasjonen av TCE stamløsningen may være lavere enn 5000 um, dvs. 3000 eller 1000 pM, dette avhenger av hvor mye volumet av denne løsningen kan leveres til bioreaktoren i henhold til dens væskefasevolum.
- For eksempel, for en 5000 pM stamløsning, beregne på følgende måte:
- Lage standardkurver i gasskromatografen for TCE, cis-1,2-dikloretylen, trans-1,2-dikloretylen, vinylklorid og eten. Fremstille cis-1,2-dikloretylen og trans-1,2-dikloretylen standardkurver fra en stamløsning av disse forbindelser ved å følge den samme fremgangsmåte som er beskrevet i 5.2 for TCE stamløsning. Forbered standardkurver for vinylklorid og eten ved å fortynne konsentrasjonen av hver gass fra standardene (gassflasker).
- Forbered standardkurver av disse forbindelser i et område fra 20 til 300 uM. Bruke metoden rapportert av Guerrero-Barajas et al. (2011) 15 for analyse av disse forbindelsene i gasskromatografen.
Forsiktig: Forbered disse ståard løsninger i en fumehood og bruke hansker og vernebriller.
- Forbered standardkurver av disse forbindelser i et område fra 20 til 300 uM. Bruke metoden rapportert av Guerrero-Barajas et al. (2011) 15 for analyse av disse forbindelsene i gasskromatografen.
- På en gitt dag, stoppe reaktoren etter en HRT syklus og oppførsel trinn 2.4. For trinn 2.4.3 bruker en COD konsentrasjon på 10 g / L.
- Når bioreaktoren er matet, tilsett TCE direkte til væsken i bioreaktoren fra forrådsoppløsning fremstilt i 5.2, må den endelige TCE-konsentrasjonen i den flytende fase av bioreaktoren være 300 pM. Sett HRT til 12 timer.
- Ved slutten av en syklus HRT ta prøver av væsken (500 til 1000 mL) og opptreden analyse for COD, sulfat og sulfid (trinn 3.1.1, 3.1.2 og 3.1.3). Ta prøver av den øvre delen (100 for å 250 ul), og å utføre analysen for TCE, cis-1,2-dikloretylen, trans-1,2-dikloretylen, vinylklorid og eten i gasskromatografen.
- Gjenta trinn 2.4. For trinn 2.4.3 bruker en COD konsentrasjon på 10 g / L.
- Ikke gjenta noen TCE reduksjon test før bioreaktor presenterer over 90% sulfatreduksjon og mindre på 10% variasjon i begge, sulfat reduksjon og sulfat er tilbake i bioreaktoren.
- Gjenta 5.4, 5.5 og 5.6 to eller tre ganger.
- Ta sedimentprøver (0,5 g) til å utføre identifikasjon av mikroorganismene like etter en TCE-reduksjonstesten er fullført. Gjør dette etter 2 eller 3 TCE reduksjon tester.
6. sulfatreduserende aktivitet Test etter TCE Reduksjon Experiment
- Gjenta trinn 4 helt.
7. Identifisering av mikroorganismene
- Ta prøver av slam på ca 0,5 g hver og gjennomføre RNA total utvinning i henhold til standard metode 12.
- Forsterke 16S rRNA-genet med revers transkripsjon og utføre polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) amplifisering ett trinn 12.
- Designe primere til å forsterke eller bruke som en første tilnærming de som er foreslått i litteratur 11. Følg forsterker;ication prosedyre foreslått i litteratur 12.
- Konstruer 16S rRNA-biblioteker. PCR-amplikoner kan klones ved hjelp av en klonings-kit 11. Vanligvis kan 10 kolonier fra hver plate (hver koloni representerer en PCR-produkt) bli klonet. Fremstille plasmid-DNA for sekvensering i henhold til fremgangsmåten foreslått i litteraturen 12.
- Gjennomføre sekvensering av fragmenter. Re-amplifisere omtrent 1400 bp av PCR eksterne produkter med protokollen for PCR-amplifikasjon tidligere beskrevet (trinn 7.4) og klon i henhold til fremgangsmåten foreslått i litteraturen 12. Isoler rekombinant plasmid fra E. coli-kolonier som foreslått i litteratur 12. Har gjennomføre delvis prosedyre for sekvensering med M13 universelle primere 12.
- Gjennomføre sekvenser analyse. Juster Nukleotidsekvensene ved hjelp av Clustal X og justere i teksteditoren manuelt. Utfør BLAST søk i NCBI database. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) 12.
- Skaff Nukleotidsekvensen deponeringsnummer. Innskudd nukleotidsekvensene til klonene identifisert i EMBL nukleotidsekvens database (Gen-Bank / EMBL / DDBJ) under de tilsvarende deponeringsnumrene (dvs. JQ713915eJQ713925 for sekvenser fra amplikonene) 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En typisk oppførsel av sulfat reduksjon i bioreaktoren er vist i figur 5. Det er viktig å legge merke til at i løpet av de første uker etter operasjonen sulfatreduksjon vil være langsom. Imidlertid langsom, forbruket av over 90% av sulfat over tid tyder på at inokulumet er å utvikle en mikrobiell fellesskap stand til å redusere sulfat og derfor anriket på sulfatreduserende bakterier. De ulike perioder i figuren viser at sulfat reduksjon ble øke sin rente over tid. I begynnelsen, det tok 20 dager for batch-sulfat å bli redusert (periode I), så dens reduksjonshastigheten ble økt, og det tok omtrent 10 dager for å redusere matet sulfat (periode II). Periode III presentert mindre variasjon i sulfatreduksjon og dette ble oppnådd i et gjennomsnitt på 10 dager som det er vist på figur 5. Etter denne perioden, reduksjon av sulfat tok et gjennomsnitt på 4 dager (periode IV) og i perioden V 4000 mg / L av sulfatble konsumert i løpet av mindre enn 24 timer. Forestillingen i bioreaktor ble satt under kontinuerlig modus etter 200 dager ved HRT av 24 timer.
Figur 5. sulfat (SO 4 2-) konsentrasjon over tid i løpet av sulfidogenic slamdannelse i bioreaktoren. Den heltrukne linjen viser til influent sulfat konsentrasjon. Firkanter refererer til sulfat-konsentrasjon i avløpsstrømmen. Dette tallet er hentet fra Guerrero-Barajas et al. (2014) 12 med tilsvarende copyright tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Representative gode resultater på sulfat reduksjon, sulfidkonsentrasjonen, COD forbruk og pH-variasjoner over tid er shhånd i figur 6A. Disse resultatene ble oppnådd i forsøk utført en gang bioreaktoren var under kontinuerlig regime nesten et år. På dette punktet den mikrobielle samfunnet ble utviklet i bioreaktoren og en svart slam ble dannet som det kan sees i figur 4B. I figur 6A kan det ses at sulfat ble redusert i 4 timer og sulfid nådde en maksimal konsentrasjon på 1200 ± 30 mg / l og 188 ± 50 mg COD-H to S / g VSS * d er den sulfatreduserende aktivitet. Det er verdt å nevne at konsentrasjonen av sulfid i bioreaktoren oppnådd anses høy og giftig for mikroorganismer, og i dette tilfellet bioreaktoren ikke opphøre sulfatreduserende aktivitet.
Figur 6. Utførelse av bioreaktoren før (A) og etter (B) TCE tilsetning. Sulfat (SO 4 2-) (◇), Sulfide(H2S) (•). Dataene presentert er gjennomsnittet og standardavvik for n = 3. Dette tallet er hentet fra Guerrero-Barajas et al. (2014) 12 med tilsvarende copyright tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For forsøket i hvilken slammet ble testet på evnen til å redusere TCE, er de oppnådde resultater er vist i tabell 1. Den sulfatreduserende aktivitet som ble oppnådd var noe lavere enn den oppnådd før TCE tilsetning og omtrent 80% av TCE ble redusert til eten (se tabell 1). Disse resultatene bør være forventet i henhold til den tiden der reaktoren hadde vært i drift under sulfatreduserende forhold. Det er usannsynlig at TCE reduksjon oppstår hvis slammet tas når reaktoren er i drift i periode I eller II (se figur 5
| Parameter | Verdi i løpet av TCE reduksjon test | ||
| Andel av SO 4 2- fjerning (%) | 98 (± 0,06) | ||
| Sulfid (H2S) konsentrasjon (mg / L) | 971 (± 72) | ||
| Andel av konvertering av SO 4 2- til H 2 S (%) | 68 (± 2) | ||
| Prosent av COD fjerning (%) | 93 (± 0,1) | ||
| pH-område | 07.01 til 07.07 | ||
| Gassproduksjonen (ml / d) | 200 (± 55) | ||
| Sulfatreduserende aktivitet (mg COD-H to S / g VSS * d) | 161 (± 7) | ||
| * TCE endelig konsentrasjon (mikrometer) | 77 (± 8) | Vinyl klorid konsentrasjon (mm) | 16 (± 0,3) |
| Eten konsentrasjon (mm) | 202 (± 81) | ||
| Prosent av TCE fjerning (%) | 74,3 (± 14) |
. Tabell 1. Resultater på resultatene av sulfidogenic slam under TCE bionedbrytning eksperimentet Denne tabellen har blitt forandret fra Guerrero-Barajas et al (2014) * TCE initial konsentrasjon:.. 300 mikrometer. Dataene presentert er gjennomsnitt og standardavvik for n = 3.
Etter TCE reduksjonstesten, er resultatene for reduksjon av sulfat, sulfid-konsentrasjonen, COD forbruk og pH-variasjoner over tid er vist i figur 6B. Disse resultatene viser at sulfat ble redusert i 5 timer og sulfidkonsentrasjonen nådde 1400 ± 35 mg / l, sammen med et sulfat reduserende aktivitet248 ± 22 mg COD-H to S / g VSS * d. Den noe høyere sulfatreduserende aktivitet - sammenlignet med 188 ± 50 mg COD-H to S / g VSS * d - indikerer at det mikrobielle samfunnet ikke ble hemmet av TCE.
Resultatene for de mikroorganismer som er identifisert i slammet som brukes i denne protokoll er presentert i tabell 2. Sulfatreduserende bakterier, fermen bakterier og dehalogenating bakterier ble identifisert i slammet er utviklet ved bruk av denne protokollen. Resultatene er ikke overraskende fordi bioreaktor var drift i løpet av ett år etter sulfatreduserende forhold og flere dager med TCE. Slekter av bakterier som Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfitobacterium, Clostridium, Dehalobacte r og Sulfurospirillum har vært knyttet til sulfat reduksjon og nedbrytning av klorerte forbindelser. Videre identifisering av disse mikroorganismene i slammetbekrefter at protokollen lyktes i å utvikle en sulfidogenic slam som kan brukes for samtidig fjerning av sulfat og trikloretylen, som er en av de mest giftige klorerte forbindelser.
| Bakterier rapporterte | Høy likheten | max ident |
| GI | 386685641 ukulturerte Desulfovibrio sp. | Desulfovibrio desulfuricans | 96% |
| GI | 386685640 ukulturerte Desulfomicrobium sp. | Desulfomicrobium Norvegicum | 99% |
| GI | 386685639 ukulturerte Desulfomicrobium sp. | Desulfomicrobium baculatum | 99% |
| GI | 386685638 ukulturerte Desulfomicrobium sp. | Desulfomicrobium hypogeium | 99% |
| GI | 386685637 ukulturerte Desulfotomaculum sp. | Desulfotomaculum acetoxidans | 99% |
| GI | 386685636 ukulturerte Clostridium sp. | Clostridium celerecrescens | 99% |
| GI | 386685635 ukulturerte Desulfovibrio sp. | Desulfovibrio halophilus | 98% |
| GI | 386685634 ukulturerte Dehalobacter sp. | Dehalobacter restrictus | 99% |
| GI | 386685633 ukulturerte Desulfitobacterium sp. | Desulfitobacterium hafniense | 99% |
| GI | 386685632 ukulturerte Sulfurospirillum sp. | Sulfurospirillum multivorans | 97% |
| GI | 386685631 ukulturerte Sulfurospirillum sp. | Sulfurospirillum halorespirans | 97% |
Tabell 2. Consortium identifisert i slammet av bioreaktoren og dets likhet til andre bakterier Max ident:. Maksimal identitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finnes flere programmer av sulfidogenesis i miljøbioteknologi, en av de mest brukte programmene av metabolismen av sulfatreduserende bakterier i konsortier med fermen bakterier er i avløpsrensing. UASB reaktorer er blant de viktigste konstruerte tilnærminger til industrielt avløpsvann med høye sulfatkonsentrasjoner. I dette arbeidet vil vi presentere en protokoll for å få sulfidogenic slam fra marine sedimenter i en UASB reaktor. De kritiske trinnene i protokollen for å oppnå en sulfidogenic slam fra marine sedimenter er: (1) å fremme homogeny av sedimentprøven som skal plasseres i reaktoren, (2) å mate den riktige konsentrasjon av sulfat og flyktige fettsyrer (COD / SO 4 2-) forhold, (3) analyse av sulfat, sulfid, COD og pH periodisk, (4) å oppdatere det basale medium, som inneholder spormetaller og vitaminer hver gang en batch startes. Det er viktig å tenke på at utviklingen av sludge avhenger mye av den mikrobielle samfunn av den opprinnelige prøven og på de riktige massebalanser (sulfat og COD). Selv om det tar tid for sulfatreduserende aktivitet for å utvikle, bioreaktoren krever kontinuerlig overvåking for å unngå lekkasjer, ulykker, eller time mangel på energi som kan slutte resirkuleringspumpen eller slå av temperaturkontroll. Spesiell oppmerksomhet må betales i utførelsen av analysen av sulfid, sulfat og COD.
Marine sedimenter generelt er en naturlig kilde til en lang rekke mikroorganismer; er det sannsynlig at slam kan dannes med marine sedimenter tatt fra forskjellige dybder. I denne protokollen ble det valgt å bruke hydrotermale marine sedimenter for to hovedgrunner: (1) disse grunne luftinntak er plassert i nærheten av kostnader og (2) denne typen nettsteder er mer rikelig i sulfider, som er en indikasjon på sulfat reduksjon og Derfor, av tilstedeværelsen av sulfatreduserende bakterier. Hvis noe, tar sediments fra noe annet sted i subsea etasje vil bare kreve mer tid for slammet å utvikle seg, selv om vi tror dette er svært usannsynlig.
Dessuten er det nødvendig å utføre flere TCE reduksjons tester for å fremme tilstedeværelsen av dehalogenating mikroorganismer i slammet som skal ytterligere identifisert ved å følge fremgangsmåten som foreslås i denne protokollen, eller enhver annen molekylær biologi teknikk. Det er viktig å vurdere at utvikling av dehalogenating mikroorganismer er også avhengig av kilden av slammet, selv om litteraturen refererer til nærværet av denne type mikroorganismer i flere sjøen sedimenter rundt om i verden 7. En sulfatreduserende aktivitetsanalyse anbefales etter eksponering av slammet til den toksiske forbindelsen for å vurdere levedyktigheten til sulfidogenic slammet etter en stresstilstand, for eksempel nærvær av TCE. Dersom aktiviteten til sulfatreduserende slammet synker vil det være nødvendig å opprettholde det several uker i en satsvis matet med sulfat og COD å fremme igjen økningen av sulfatreduserende aktivitet. Dette kan gjøres ved å følge fremgangsmåten som foreslås i protokollen for å fremme sulfidogenesis og vekst av mikroorganismene. Det er viktig å nevne at det ble forsøkt å oppnå en sulfidogenic-dehalogenating slam ved tilsetning av TCE sulfat og siden begynnelsen av dyrkingen av sedimentene, men ingen aktivitet (enten sulfatreduserende eller dehalogenating) ble aldri observert. Det ble antatt at lavt innhold av mikroorganismer som er tilstede i de tidlige stadier av kulturen ikke tolerere den TCE (selv ved 20 uM konsentrasjon), men tilsetningen av TCE siden begynnelsen av anrikningen kan alltid forsøkt med andre sedimenter.
Et godt resultat i dette tilfellet var reduksjonen av TCE til eten, men avhengig av de mikroorganismer som kan ha utviklet seg i slammet reduksjon av TCE kan gi hovedsakelig dichloroethenes og vinyl klorid (VC). I dette tilfellet er dataene oppnådd for TCE reduksjonen ble registrert etter hver syklus HRT i bioreaktoren i stedet for prøvetaking for TCE og dets mellomprodukter konstant under testen. Det ble gjort på den måten for å unngå fordampning av de klorerte forbindelser på grunn av hyppig prøvetaking. Derfor er det ingen grafer av TCE-konsentrasjon over tid for å vise, men konsentrasjonene ved slutten av hvert eksperiment. Det er viktig å unngå fordampning av de flyktige klorerte forbindelser for å rapportere nøyaktige konsentrasjoner av dem og for å skjelne om endringene kan tilbakeføres til det biologiske reduksjon i stedet for tap. Tilstedeværelsen av eten og fravær av vanlige mellomprodukter av TCE som cis-1,2-dikloretylen i sluttproduktene etter TCE reduksjonen er spesielt interessant. Det har alltid vært rapportert at hele TCE reduksjon til eten kan kun utføres av Dehalococcoides sp. og i dette tilfellet disse microorgamekanismer ble ikke oppdaget blant slektene identifisert i slammet. Vi tilskriver TCE reduksjon til cometabolism som kan ha oppstått i slammet mellom dehalorespiring, fermen og sulfatreduserende bakterier. En mangel ved dette konsortiet er at det fremmer den forbigående dannelse av VC, en forbindelse som mer giftige enn TCE, men det er til stede i relativt lave konsentrasjoner. Det kan være mulig å si ved dette punkt at en meget uvanlig cometabolic aktivitet ble utviklet av konsortiet, og at en ny TCE reduksjon pathway henhold sulfat reduserende betingelser kan bli ytterligere undersøkt i nærvær av mikroorganismer halorespiring identifisert i dette arbeidet. På den annen side, har det tidligere blitt rapportert at dehalogenating gener ofte detekteres i undergrunns marine sedimenter, men det finnes ingen rapporter om TCE bionedbrytning med undervannssedimenter kombinert med sulfat reduserende betingelser, dette er, ved hjelp av sulfat som en alternativ elektronakseptor.
En av begrensningene ved denne metoden er at strukturen av slammet er avhengig av de fysiske egenskapene til sedimentet anvendt og selv om det i denne fremgangsmåte slammet dannet tillates en god fluidisering av reaktoren og dannelse av biofilm på glasset, kan vi forutsi hvordan det ville faktisk fungerer ved hjelp av sedimenter fra ulike steder. Det kan være mulig å anvende mindre reaktorer for å kunne foreta foreløpige tester ogobservere om det er gjennomførbart. Hvis hensikten er å operere med slammet i en bioreaktor, anbefaler vi ikke starter med mikrokosmos. Forslaget er å sette reaktoren fra begynnelsen, men med et mindre volum for første forsøk.
Metoden som presenteres her er av betydning ved at det slam som dannes tåler høyere sulfidkonsentrasjoner enn andre sulfidogenic slam som er innhentet ved tilpasning av metanogenisk granulert slam til sulfidogenesis. Metoden fremmer dannelsen av et slam med et konsortium som inneholder sulfatreduserende bakterier og gjær bakterier og kan lett tilpasses til å brytes ned giftige forbindelser. I denne protokollen benyttet vi TCE som et eksempel på en toksisk forbindelse som bare har vært nedbrytes biologisk i henhold metanogenisk forhold i UASB-reaktorer. For eksempel, dersom formålet av reaktoren er å biotransform klorerte oppløsningsmidler kan det være nyttig å gradvis øke oppløsningsmidlet konsentrasjon, dvs. høyere TCE-konsentrasjonen i prøvene, for å samtidig redusere sulfatkonsentrasjonen stimulere dehalogenering løpet sulfat reduksjon. Selv om, i henhold til de resultater som ble oppnådd i dette arbeidet, men vi mener at sulfat ikke kan fjernes helt fra kulturen hvis sulfat reduserende betingelser, er ønskelig. Videre bør sulfat reduserende forhold opprettholdes siden noen dehalorespirers er også sulfat reduksjonsgir. Slammet som genereres under betingelsene beskrevet i denne protokollen kan eventuelt anvendes for å fjerne samtidig COD, sulfatet, klorerte toksiske forbindelser og tungmetaller. Tungmetaller kan utfelles med sulfid produsert av slam.
Endelig kan sulfidogenic slam som dannes testes for: (1) toleransen av høyere konsentrasjoner sulfid (for eksempel, for å felle ut tungmetaller), (2) den biologiske nedbrytning av andre organiske forurensninger, eller (3) forbruk av hydrokarboner som elektrondonorer i stedet for flyktige fettsyrer til further utforske sine applikasjoner i miljøbioteknologi. Det er viktig å vurdere at når slammet er dannet kan den brukes som frø slam for å inokulere andre reaktorer. I så fall vil sulfatreduksjonsprosessen skje umiddelbart, og dermed vil det ikke være nødvendig å vente et år for å fungere uten bioreaktoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trichloroethylene | sigma Aldrich | 251402 | |
| cis-1,2-dichlorotehylene | sigma Aldrich | ||
| trans-1,2-dichloroethylene | sigma Aldrich | D-62209 | |
| vinyl chloride scotty standard | supelco | 1,000 ppm v/v in nitrogen | |
| ethene scotty standard | supelco | 99% purity | |
| pump | Masterflex | Model 7553-75 | |
| spectrophotometer | any | ||
| microcentrifuge | any | ||
| gas tight syringes | any | 100 and 200 microliters | |
| UASB glass reactor | any | under design | |
| gas chromatograph | any | FID detector | |
| capillary column SPB-624 | supelco | ||
| pH meter | any | ||
| viton tubing | Masterflex | ||
| basal medium reagents | any | ||
| trace metals reagents | any | ||
| vitamins solution reagents | any | ||
| sodium sulfate | any | ||
| volatile fatty acids | any | ||
| COD determination kit | HACH | range 0-15,000 mg/L | |
| TOPO-TA cloning kit pCR®4.0 | Invitrogen, US | ||
| S.N.A.P. TM Miniprep Kit | Invitrogen, UK | ||
| Pure link TM Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen |
References
- Lens, P., Esposito, M. V. G., Zandvoort, M. Perspectives of sulfate reducing bioreactors in environmental biotechnology. ReViews Environmental Science and Biotechnology. 1 (4), 311-325 (2002).
- Omil, F., Lens, P., Hulshoff, P., Lettinga, G. Characterization of biomass from a sulfidogenic, volatile fatty acid-degrading granular sludge reactor. Enzyme and MicrobialTechnology. 20, 229-236 (1997).
- Lopes, S. I. C., Wang, X., Capela, M. I., Lens, P. N. L. Sulfate reduction during the acidification of sucrose at pH 5 under thermophilic (55 °C) conditions.II: Effect of sulfide and COD/SO4-2 ratio. Bioresource Technology. 101, 4278-4284 (2010).
- Alfonso, P., Prol-Ledesma, R. M., Canet, C., Melgarejo, J. C., Fallick, A. E. Sulfur isotope geochemistry of the submarine hydrothermal coastal vents of Punta Mita, Mexico. Journal of Geochemical Exploration. 78-79, 301-304 (2003).
- Valdemarsen, T., Kristensen, E. Degradation of dissolved organic monomers and short chain fatty acids in sandy marine sediment by fermentation and sulfate reduction. Geochimica et Cosmochimica Acta. 74, 1593-1605 (2010).
- Quistad, S. D., Valentine, D. L. Anaerobic propane oxidation in marine hydrocarbon seep sediments. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75, 2159-2169 (2011).
- Futagami, T., Morono, Y., Terada, T., Kaksonen, A. H., Inagaki, F. Dehalogenation activities and distribution of reductive dehalogenase homologous genes in marine subsurface sediments. Applied and Environmental Microbiology. 75 (21), 6905-6909 (2009).
- U.S. Environmental Protection Agency. List of priority pollutants. Clean Water Methods. , (2014).
- Ozdemir, C., Dursun, S., Karatas, M., Sen, N., Sahinkaya, S. Removal of trichloroethylene (TCE) in upFlow anaerobic sludge blanket reactors (UASB). Biotechnology and Biotechnological Equipment. 21 (1), 107-112 (2007).
- Zhang, Y., Wang, X., Hu, M., Li, P. Effect of hydraulic retention time (HRT) on the biodegradation of trichloroethylene wastewater and anaerobic bacterial community in the UASB reactor. Applied Microbiology and Biotechnology. 99, 1977-1987 (2015).
- Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. , 20th Edn., American Public Health Association. Washington, DC. (1998).
- Guerrero-Barajas, C., et al. Enhanced sulfate reduction and trichloroethylene (TCE) biodegradation in a UASB reactor operated with sludge developed from hydrothermal vents sediments: process and microbial ecology. International Biodeterioration and Biodegradation. 94, 182-191 (2014).
- Trüper, H. G., Schlegel, H. G. Sulphur metabolism in Thiorhodaceae I. Quantitative measurements on growing cells of Chromatium okenii. Antoine van Leeuwenhoek. 30, 225-238 (1964).
- Gallegos-García, M. G. Biological processes of sulfate reduction in biofilms for metals precipitation [Ph D thesis]. , Intituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica. San Luis potosí, Mexico. (2009).
- Guerrero-Barajas, C., Garibay-Orijel, C., Rosas-Rocha, L. E. Sulfate reduction and trichloroethylene biodegradation by a marine microbial community from hydrothermal vents sediments. International Biodeterioration and Biodegradation. 65, 116-123 (2011).
