Engineered 3D Silk-kollagen-basert modell av polarisert Neural Tissue

Introduction

Sentralnervesystemet (CNS) kan påvirkes av en rekke lidelser som involverer vaskulære, strukturelle og funksjonelle, infeksiøs eller degenerative. Anslagsvis 6,8 millioner mennesker dør hvert år som følge av nevrologiske lidelser, noe som representerer en økende sosioøkonomisk byrde på verdensbasis ^en. Men bare noen få av de lidelser har tilgjengelige behandlinger. Det er derfor et kritisk behov for innovative terapeutiske strategier for pasienter som lider av neurologiske forstyrrelser. Dessverre er mange CNS-rettet terapi mislykkes i kliniske studier, delvis på grunn av utnyttelse av utilstrekkelige pre-kliniske forskningsmodeller, som ikke tillater vurdering av akutte og kroniske virkninger med fysiologisk-relevante funksjonelle leselig.

Til tross for betydelige forskningsinnsats de siste tiårene, er det en enorm mengde ukjent om struktur og funksjon av CNS. For å få mer kunnskap, dyremodeller er ofte ossed å modellere patologiske tilstander, slik som traumatisk hjerneskade (TBI) eller demens, spesielt i pre-kliniske studier. Imidlertid dyr signifikant forskjellig fra mennesker både i anatomi av CNS, så vel som i funksjon, genekspresjon og metabolisme ^2-4. På den annen side, 2D in vitro kulturer er den vanlige metoden for å undersøke cellebiologi og blir rutinemessig anvendt for medikamentoppdagelse. Imidlertid 2D cellekulturer mangler kompleksiteten og fysiologiske relevans i forhold til human hjerne ^5-7. Mens det er ingen erstatning for den lave kostnaden og enkelhet i 2D cellekulturstudier eller kompleksiteten levert av dyremodeller, kan 3D tissue engineering generere forbedrede forskningsmodeller for å lukke gapet som eksisterer mellom 2D in vitro og in vivo tilnærminger. 3D tissue engineering gir mer fysiologisk relevante forsøksbetingelser oppnås ved 3D-celle-celle interaksjoner og ekstracellulære signaler gitt av biomateriale stillasene. Despite den betydelige bevis bak verdien av 3D kulturer, er det i dag bare noen få 3D CNS vevsmodeller eksempel stamcelle-avledet organoid kulturer ^8-10, neurospheroids ^{11 og} spredt hydrogel kulturer ^12,13. Avanserte tekniske metoder inkludert flerlags litografi ^14, og 3D-trykking ¹⁵ er blitt benyttet for å studere lunge, lever, nyre og vev. Det er imidlertid mangel på CNS-3D-modeller som gjør det mulig for romoppdelt neuronal vekst, slik som å etterligne kortikale arkitektur og biologi. Separert veksten av neurites fra nervecellelegemer har tidligere blitt vist i 2D kulturer ved hjelp microfabrication ^16,17 slik at studiet av axon kanalen tracing, kalsium tilstrømningen, nettverksarkitektur og aktiviteter. Denne ideen inspirert oss til å utvikle en 3D polarisert nevrale vev der cellelegemer og aksonale traktater er plassert i ulike avdelinger ligne lagdelt arkitektur av hjernen ¹⁸

Protocol

Hjernevevet isolasjon protokollen ble godkjent av Tufts University Institutional Animal Care og bruk Committee og er i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (Institutional Animal Care og bruk komité B2011-45).

1. Silk Stillas Forberedelse

1. Utarbeidelse av silke løsning fra silkeorm kokonger som beskrevet tidligere ^19,20.
   1. Skjær hver kokong i 8 like stykker med saks. Bruk ca 11 kokonger for 5 g fragmenterte kokonger. (15 min)
   2. Forbered to L 0,02 M Na _{2 CO 3} løsning og bringe det til å koke ved hjelp av en kokeplate. (15 min)
   3. Vei 5 g av fragmenterte kokong og koke dem i Na ₂ CO _3-løsning i 30 minutter. Rør kokende silke hvert par minutter med en slikkepott. Dette trinnet, også kalt de-gumming, renser silke fibroin fra hydrofile proteiner, sericins. (30 min)
   4. Plasser den våte fibroin på en petriskål og tørke fibroin ekstrakt i strømningshette O / N.
   5. Neste dag veie den tørre fibroin masse og plasser fibroin i et begerglass. (15 min)
   6. For å oppløse fibroin i 9,3 M LiBr oppløsning, beregne det nødvendige volum (i ml) av LiBr ved å multiplisere massen av tørr fibroin ved 4. Hell sakte LiBr oppløsning over silke fibroin og dyppe alle fibroin fibrene ved hjelp av spatel. Dekk begerglasset for å forhindre fordamping og plassere den ved 60 ° C i 4 timer for å tillate fibrene å oppløse. (15 min)
   7. Ved hjelp av sprøyten, samle fibroin løsning fra begeret og legger det inn i MWCO 3500 dialyse kassetter. Utføre dialyse mot destillert vann i 48 timer. Endre vann hver par timer.
   8. Ved hjelp av sprøyte, samle fibroin løsningen frakassettene i 50 ml koniske rør og sentrifugeres to ganger ved 9000 rpm (~ 12 700 xg) ved 4 ° C i 20 min. Hell av supernatanten til et nytt rør etter hvert sentrifugeringstrinn og kast pelleten. (40 min)
   9. Måle konsentrasjonen av fibroin ved å beregne tørrvekten. Hell 1 ml av silke oppløsning i en veie båt. Tørk prøven i ovnen ved 60 ° C i 2 timer. Vei den tørre silke fibroin og beregne konsentrasjonen av silke fibroin løsning ved å multiplisere vekten av det oppnådde 100. Den forventede konsentrasjon av silke oppløsning er 6-9% (w / v).
   10. Juster silke konsentrasjon til 6% (w / v) ved å fortynne den i destillert vann.
       Stoppunkt: Den flytende silke fibroin kan lagres ved 4 ° C i opptil en måned i en lukket beholder.
2. Utarbeidelse av porøse stillas fra silke løsning.
   1. Sil den granulære NaCl for å separere granulene størrelse på 500-600 um, som vil bli benyttet i senere trinn. Kast granulats størrelse under 500 mikrometer og over 600 mikrometer. (15 min)
   2. Hell 30 ml 6% silke løsning i polytetrafluoretylen (PTFE) form (figur 1). Forsiktig sprede 60 g siktet NaCl over silke. Tappe beholderen for å oppnå et ensartet lag av salt. Inkuber 48 timer ved romtemperatur for å polymerisere silke.
   3. Plasser stillas-holdige PTFE mugg i ovn ved 60 ° C i 1 time for å fullføre polymeriseringen, og fordampe eventuell gjenværende væske.
   4. Plassere innholdet av PTFE-formen i et begerglass som inneholdt 2 liter destillert vann i 48 timer til å lekke ut saltet. Endre vann 2-3 ganger per dag. Fjern de svamp stillasene fra formene når saltet er fullstendig utvasket stoppunktet. Svampene kan oppbevares nedsenket i vann ved 4 ° C i en lukket beholder for å hindre at stillasene fra dehydrering.
   5. Når du er klar, klippe ut stillasene med 5 mm diameter biopsi punch. Pre-cut stillasene for å nå ca 2 mm i høyden. PuNCH ​​ut midten av stillaset med 2 mm diameter biopsi stempel (figur 2A). (1 time)
   6. Autoklav stillasene nedsenket i vann for å sterilisere dem (våt syklus, 121 ° C, 20 min) stoppunktet. Svampene kan oppbevares nedsenket i vann ved 4 ° C i en lukket beholder for å hindre at stillasene fra dehydrering.
   7. Før den planlagte celle seeding, fordype stillasene i steril 0,1 mg / ml poly-D-lysin (PDL) løsning. Inkuber i 1 time ved 37 ° C.
   8. Vask stillasene 3 ganger med fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne ikke-bundet PDL. (30 min)

2. Isolering av Rat kortikale nevroner

1. Dissekere kortekser fra embryodag 18 (E18) Sprague-Dawley-rotter som tidligere beskrevet av Pacifici og Peruzzi ²⁷ etter at det oppnås godkjent dyr protokollen. (2 timer)
2. Inkuber 10 ekser i 5 ml av 0,25% trypsin med 0,3% DNase I (fra bovin pankreas) i 20 min ved 37 ° C.
3. Inaktivere trypsin ved å tilsette like stort volum av 1 mg / ml soyabønneprotein.
4. Triturer cortex ved hjelp av 10 ml Pasteur pipette ved å pipettere opp og ned 20 ganger til en enkelt cellesuspensjon blir generert. Vær forsiktig og unngå luftbobledannelse. (10 min)
5. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 127 xg i 5 minutter.
6. Re-suspendere cellepelleten i 10 ml kulturmedium (Neurobasal medium, 1x B27 supplement, 1x Glutamax, 1% penicillin / streptomycin). Telle celler. Den forventede cellekonsentrasjonen er ca. 2x10 ⁷ / ml. (20 min)

3. Konstruer Assembly and Culture

1. Stillaset seeding med celler.
   1. Flytt sterile stillaser og alle nødvendige redskaper inne i en cellekultur hette. Ved hjelp av sterile pins plassere stillas i en 96-brønners cellekulturplate allokere en stillas per brønn. (10 min)
   2. Fordype stillasene i celledyrkingsmedium for å stabilisere dem før til celle frøing. Inkuber i 1 time ved 37 ° C. (10 min)
   3. Aspirer overkant av mediet fra stillasene.
   4. Anvende 100 mL av cellesuspensjonen / stillaset. (10 min)
   5. Inkuber cellene ved 37 ° CO / N for at cellene skulle feste til stillaset.
   6. Den følgende morgen Aspirer de ikke-festede celler og anvende 200 ul / brønn av friskt kulturmedium. (10 min)
2. Stillas embedding med kollagen matrise. (2 timer)
   1. Plasser 10x PBS, vann, 1 N NaOH og rottehale I kollagen på is. Forbered en fungerende løsning av kollagen i henhold til produsentens instruksjoner. Oppretthold på is inntil celle-seeded konstruksjoner er klar (opp til 1 time).
   2. Fjern de celle-seeded silke konstruksjoner fra inkubatoren og aspirere overskuddet av mediet.
   3. Ved hjelp av sterile pins overføre stillasene til de tomme brønner på brønners platen og dyppe hvert stillas i 100 pl av 3 mg / ml kollagen løsning. Plasser vevskulturplaten ideni inkubatoren i 30 min for å tillate polymerisering av kollagen.
   4. Påfør 100 mL av forvarmet cellekultur middels / godt. Culture konstruksjonene for en uke endring av medium hver dag ved å erstatte bare halvparten av volumet av mediet.

4. Mikros Analyse

1. Levende / døde farging (1 time)
   1. Forbered stamløsning av propidiumjodid (PI) 1 mg / ml (1,5 mM) i destillert vann.
   2. Forbered stamløsning av fluorescein-diacetat (FDA) 2 mg / ml i aceton.
   3. Forberede arbeidsløsning inneholdende 10 pM PI og 0,15 pM FDA fortynnet i PBS. Forvarme oppløsningen til 37 ° C i et vannbad.
   4. Vask cellene med forvarmet PBS for å fjerne serumesterasene. Aspirer PBS.
   5. Påfør forvarmet arbeidsløsning på cellene i 2 minutter og vaskes med PBS.
   6. Bruk epifluorescent mikroskop til bilde cellene (PI ex λ = 490 nm, em λ = 570 nm; FDA ex λ = 490 nm, em λ = 514 nm). Flekken forblir stabil over 40 min. Langvarig flekker kan resultere i uspesifikk farging som skyldes PI opptak i cellene og ko-lokalisering av PI / FDA i celler.
2. Farging
   1. Ved ønsket tidspunkt av kulturen fiksere cellene med 4% paraformaldehyd (PFA) i 30 minutter ved RT. På grunn av giftigheten av den PFA damper fikseringstrinnet bør utføres i avtrekksskap.
   2. Vask stillasene med 3x PBS stoppunktet. De PFA-faste konstruksjoner kan lagres i PBS ved 4 ° C i flere dager før du fortsetter med ytterligere tiltak.
   3. Inkuber stillas i 0,2% Triton, 0,25% bovint serumalbumin (BSA) i PBS inneholdende primære antistoff O / N ved 4 ° C.
   4. Den følgende dag forkaste fargeløsning og vask stillasene 3 x 30 minutter med PBS for å fjerne ubundet primære antistoff.
   5. Inkuber prøvene med sekundært antistoff fortynnet i 0,2% Triton, 0,25% BSA i PBS i 2timer ved romtemperatur.
   6. Fjerne flekker løsningen og vask stillasene 3 x 30 minutter med PBS for å fjerne ubundet sekundært antistoff.
   7. Bilde stillasene ved hjelp av en konfokal mikroskop med 20x objektiv ved å ta 100 mikrometer z-seksjonene av prøven med en mikrometer trinn. For å visualisere de tynne neuritter bildeoppløsningen skal være på minimum 1024 x 1024 piksler.
3. RNA, DNA og protein isolasjon
   Merk: RNA, DNA og protein isolasjon utføres ved hjelp av en kommersiell AllPrep DNA / RNA / Protein Mini Kit i henhold til produsentens instruksjoner.
   1. Bruk steril pinsett overføre stillasene ut av kultur plate til en 2 ml sterilt rør. Plasser en stillas per rør.
   2. Tilsett 200 ul av RLT buffer til hvert rør.
   3. Forstyrre konstruere ved å fragmentere den med sterile microscissors.
   4. For å homogenisere påvirket vev, overføre innholdet av røret til spinnkolonne. Spinne i 2 min i full fart i en mikro.Lysatet homogeniseres når den passerer gjennom spinnkolonne.
   5. Samle strømmen gjennom og bruke den umiddelbart til å isolere RNA, DNA og protein følge produsentens protokoll.
   6. Kvantifisere utbyttet av nukleinsyrene hvilken som helst annen kompatibel metode (f.eks Nanodrop).
   7. Kvantifisere proteinutbytte ved hjelp av BCA Protein Assay i henhold til produsentens instruksjoner. Mål resultatet av analyse ved bruk av mikroplateavleser ved 562 nm bølgelengde.
      Merk: Det forventede utbyttet av nukleinsyrer og protein pr konstruksjon i forhold til celletettheten er vist i figur 4.

Representative Results

Solid silke svamper precut til smultring form representerer en unik og enkel idé for å oppnå en romoppdelt arkitektur ligner nervevev (Figur 2A). Den sterkt porøse strukturen av stillaset med størrelse på ca 500 um resulterer i usedvanlig høyt overflateareal som tillater såing og vekst av høy celletetthet i et lite volum porer (2x10 ⁷ / ml) (figur 2B). I tillegg er den høye porøsitet av stillaset tillater ubegrenset diffusjon av næringsstoffer og avfallsstoffer som resulterer i overlegen levedyktighet tette cellekulturer over lengre tidsperioder. Ved utsåing av neuroner hurtig og jevnt fester seg til overflaten av stillas porene.

Etter cellebinding er fullført, og cellene blir ekvilibrert på silke substratet, er svampen stillaset fylt med den myke kollagen matriks for å tilveiebringe en 3D-miljø for aksonal nettverkdannelse (Figur 3 (figur 3B). I motsetning til dette, gir den kollagen-gel en nettvare som understøtter omfattende aksonal utvekst i 3D, mens nervecellelegemer forbli festet til silke stillaset (figur 3C). Denne vekstmønster fører til compartmentalization av cellelegemer og rene aksonal nettverk (figur 3D), som ligner på grå og hvit substans i cortex i hjernen.

Bortsett fra mikroskopi, kan konstruksjonene evalueres med en rekke andre fremgangsmåter ^{for 18,} avhengig av spørsmålet bak forsøket. For eksempel, kan isoleringen av DNA, RNA og protein fra konstruksjonene være lett utført ved anvendelse av kommersielle sett (figur 4). Utbyttet av nukleinsyrer og protein per konstruksjon avhenger av antall celler som opprinnelig sådd på silke stillaser. Jo flere celler sådd ut i høyere utbytte av DNA, RNA og protein.

Figur 1. PTFE mold brukes for silke svamp stillaset forberedelse Dimensjonene:.. 10 cm diameter, 2 cm høyde Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. 3D hjerne-lignende vev modell. (A) Porøs silke svamp stillaset. (B) Levende / dead farging av nevroner på dag 1 ved poding på silke stillaset før kollagen embedding (grønn-live celler, røde døde celler). Paneler på høyre side viser magnification av området fanget i røde rammer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Neuronal romoppdelt utvekst i 3D-hjerne-lignende vev modell (A) Stillas avdelinger:. Red-cellen kroppen kupé, Blå-aksonal kupé. (B) Neuronal vekstmønster på dag 1 på seeding før kollagen embedding. (C). Nevronale utvekst på dag 7 på seeding i cellekroppen rommet. (D) Neuronal utvekst på dag 7 på seeding i aksonal rommet. Green -. ΒIIITubulin Klikk her for å se en større versjon av dennefigur.

Figur 4. Forventet avkastning av (A) RNA og DNA, og (B) protein per konstruksjon i forhold til mengden av celler sådd per stillas (± SD, n = 5). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223530
LiBr	Sigma-Aldrich	213225
MWCO 3500 dialysis cassettes	Thermo Fisher	66110
Heating plate	Fisher Scientific	Isotemp
Centrifuge 5804 R	Eppendorf
Sieve	Fisher Scientific		No. 270, No. 35, No. 30
PTFE mold			made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height
NaCl	Sigma-Aldrich	71382
Biopsy Punch 5 mm	World Precision Instrument	501909
Biopsy Punch 2 mm	World Precision Instrument	501908
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407-5MG	final concentration 10 μg/ml, dissolved in water
PBS	Sigma-Aldrich	D1283-500ML
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
DNase	Roche	10104159001	final concentration 0.3%
Soybean protein	Sigma-Aldrich	T6522-100MG	final concentration 1 mg/ml
Neurobasal medium	Gibco	21103049	warm up to 37 °C before use
B27 supplement 50x	Gibco	17504-044
Glutamax	Gibco	35050-061
Penicilin Streptomycin	Corning	30-002-CI
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	final concentration 3 mg/ml
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770	corrosive
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170-10MG	toxic
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378-5G
Olympus MVX10	Olympus
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	toxic, final concentration 4%
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G
anti-βIIITubulin antibody	Sigma-Aldrich	T2200	rabbit 1:500
anti-rabbit Alexa-546	Molecular Probes	A11010	goat 1:250
goat serum	Sigma-Aldrich	G9023-5ML
Leica SP2 confocal microscope	Leica		objective 20X
QIAshredder	Qiagen	79654
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit	Qiagen	80004
Ethyl alcohol, Pure	Sigma-Aldrich	E7023
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific
BCA protein assay	Thermo Scientific	23225
Plate reader Spectramax M2	Molecular Devices		absorbance 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	TedPella	1346