Engineered 3D Silk-Kollagen-basierten Modell von polarisiertem Neural Tissue

Introduction

Das Zentralnervensystem (ZNS) kann durch eine Vielzahl von Erkrankungen mit vaskulärer, strukturellen, funktionellen, infektiösen oder degenerativen berührt. Schätzungsweise 6,8 Millionen Menschen sterben jedes Jahr als Folge von neurologischen Erkrankungen, die eine wachsende sozioökonomische Belastung weltweit darstellt ^1. Nur einige der Erkrankungen haben jedoch verfügbaren Behandlungen. Daher gibt es einen kritischen Bedarf an innovativen therapeutischen Strategien für Patienten mit neurologischen Störungen. Leider scheitern viele ZNS-Therapeutika gezielt in klinischen Studien, zum Teil auf der Nutzung der unzureichenden präklinischen Forschung Modelle, die nicht die Beurteilung der akuten und chronischen Auswirkungen mit physiologisch-relevanten Funktionsanzeigen zulassen.

Trotz erheblicher Forschungsanstrengungen in den letzten Jahrzehnten, gibt es eine große Menge nicht bekannt über die Struktur und Funktion des ZNS. Um mehr Wissen zu erlangen, sind Tiermodelle häufig unsed zu modellieren pathologischen Zuständen, wie traumatische Hirnverletzungen (TBI) oder Demenz, vor allem in präklinischen Studien. Unterscheiden sich jedoch deutlich von Tieren Menschen sowohl in der Anatomie des ZNS sowie in der Funktion, die Genexpression und Stoffwechsel ^2-4. Auf der anderen Seite, sind 2D-in-vitro-Kulturen die gemeinsame Methode zur Zellbiologie untersuchen und werden routinemäßig für die Wirkstoffforschung eingesetzt. Jedoch 2D Zellkulturen fehlt die Komplexität und die physiologische Bedeutung im Vergleich zu menschlichen Gehirns ^5-7. Zwar gibt es keinen Ersatz für die niedrigen Kosten und die Einfachheit der 2D-Zellkulturstudien oder die Komplexität von Tiermodellen zur Verfügung gestellt, könnte 3D-Tissue Engineering verbesserte Forschungsmodelle zu generieren, um die Lücke, die in vitro und in vivo Ansätze zwischen der 2D besteht zu schließen. 3D-Tissue Engineering bietet mehrere physiologisch relevanten durch 3D-Zell-Zell-Interaktionen und extrazelluläre Signale von den Biomaterial Gerüsten versehen ist experimentellen Bedingungen. Despite die deutlichen Anzeichen dafür, hinter dem Wert von 3D-Kulturen, gibt es derzeit nur wenige 3D-ZNS-Gewebe-Modelle wie Stammzellen abgeleiteten organoiden Kulturen ^8-10, neurospheroids ^{11 und} verteilt Hydrogel Kulturen ^12,13. Erweiterte technische Methoden, einschließlich Mehrschichtlithographie ^{14 und} 3D-Druck ¹⁵ wurden für die Untersuchung der Lunge, Leber und Nierengewebe verwendet worden. Jedoch gibt es fehlende 3D CNS Modell für compartmentalized neuronale Wachstum zu ermöglichen, wie beispielsweise Nachahmen des kortikalen Architektur und Biologie. Getrennt Wachstum von Neuriten von neuronalen Zellkörpern zuvor in 2D-Kulturen unter Verwendung von Mikrofabrikations ^16,17, die die Untersuchung der Axon-Trakt Tracing Calciumeinstrom, Netzarchitektur und Aktivitäten gezeigt. Diese Idee hat uns inspiriert, um einen 3D-polarisierte Nervengewebe in dem Zellkörper und axonalen Bahnen sind in verschiedenen Fächern imitiert die Schichtenarchitektur des Gehirns ¹⁸ befindet entwickeln

Protocol

Das Hirngewebe Isolation Protokoll wurde von der Tufts University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt und entspricht den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Institutional Animal Care und Verwenden Committee B2011-45).

1. Silk Scaffold Vorbereitung

1. Herstellung von Seidenlösung von Bombyx mori Kokons wie zuvor ^19,20 beschrieben.
   1. Schneiden Sie die einzelnen Kokon in 8 gleiche Teile mit einer Schere. Verwenden Sie ca. 11 abhaspelbare 5 g fragmentierten Kokons. (15 min)
   2. Bereiten 2 l 0,02 M Na _{2 CO 3 -Lösung} und bringen es zum Kochen unter Verwendung einer Heizplatte. (15 min)
   3. Man wiegt 5 g fragmentierten Kokons und kochen Sie sie in _Na 2 CO 3 Lösung für 30 min. Rühren Sie das kochende Seiden alle paar Minuten mit einem Spachtel. Dieser Schritt, auch als de-Gummierung, reinigt Seidenfibroin von hydrophilen Proteinen, sericins. (30 min)
   4. Setzen Sie den nassen Fibroin auf eine Petrischale und trocknen Sie das Fibroin-Extrakt in der Flow-Haube O / N.
   5. Am nächsten Tag wiegen die Trockenmasse Fibroin und legen Sie das Fibroin in einem Becherglas. (15 min)
   6. Um das Fibroin in 9,3 M LiBr-Lösung, berechnen die erforderliche Volumen (in ml) LiBr durch Multiplikation der Masse des trockenen Fibroin von 4. Gießen Sie langsam auflösen LiBr-Lösung über die Seidenfibroin und tauchen alle Fibroinfasern mit Spachtel. Decke den Becher, um Verdunstung zu vermeiden und ihn bei 60 ° C für 4 Stunden, damit die Fasern sich aufzulösen. (15 min)
   7. Mit der Spritze, sammeln die Fibroinlösung aus dem Becherglas und laden Sie es in die MWCO 3.500 Dialyse-Kassetten. Zuführen Dialyse gegen destilliertes Wasser für 48 Stunden. Wechseln Sie das Wasser alle paar Stunden.
   8. Mit der Spritze, sammeln die Fibroinlösung ausdie Kassetten in 50 ml konischen Röhrchen und zentrifugiert zweimal bei 9000 UpM (~ 12.700 xg) bei 4 ° C für 20 min. Gießen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen nach jedem Zentrifugationsschritt und entsorgen Sie das Pellet. (40 min)
   9. Messung der Konzentration des Fibroin durch Abschätzen der Trockenmasse. Gießen Sie 1 ml Seidenlösung in einen wiegen Boot. Trocknen der Probe im Ofen bei 60 ° C für 2 Std. Das trockene Seidenfibroin und berechnet die Konzentration des Seidenfibroinlösung durch Multiplikation des Gewichts durch 100. Der erwartete Konzentration Seide Lösung 6-9% (w / v).
   10. Stellen Sie die Seiden Konzentration auf 6% (w / v), indem sie in destilliertem Wasser verdünnt.
       Haltepunkt: Die Flüssigkeit Seidenfibroin kann bei 4 ° C für bis zu einem Monat in einem geschlossenen Behälter gelagert werden.
2. Herstellung von porösen Gerüsten aus Seide Lösung.
   1. Sieb des körnigen NaCl zur Trennung der Granulate bemessen 500-600 & mgr; m, die in späteren Schritten verwendet werden sollen. Entsorgen Sie das Granulats bemessen unterhalb 500 um und oberhalb von 600 & mgr; m. (15 min)
   2. Pour 30 ml 6% Seide Lösung in das Polytetrafluorethylen (PTFE) Form (Abbildung 1). Streuen Sie vorsichtig 60 g gesiebten NaCl über die Seide. Tippen Sie auf den Container, um eine gleichmäßige Schicht von Salz zu erhalten. Man inkubiert 48 Stunden bei Raumtemperatur, um die Seide zu polymerisieren.
   3. Legen Sie das Gerüst haltigen PTFE-Form im Ofen bei 60 ° C für 1 Stunde, um die Polymerisation abzuschließen und zu verdampfen restliche Flüssigkeit.
   4. Platzieren des Inhalts des PTFE-Form in ein Becherglas mit 2 l destilliertem Wasser für 48 Stunden zum Auslaugen des Salzes. Wechseln Sie das Wasser 2-3 mal pro Tag. Entfernen Sie die Schwamm Gerüste aus den Formen, wenn das Salz vollständig ausgelaugt Haltepunkt:. Die Schwämme können gespeichert unter Wasser bei 4 ° C in einem geschlossenen Behälter, um die Gerüste vor dem Austrocknen zu verhindern.
   5. Wenn Sie fertig sind, schneiden Sie die Gerüste mit 5 mm Durchmesser Biopsie Punsch. Vorgeschnitten die Gerüste auf etwa 2 mm in der Höhe zu erreichen. PuNch die Mitte des Gerüstes mit 2 mm Durchmesser Biopsie Stempel (2A). (1 h)
   6. Autoklaven werden die Gerüste in Wasser eingetaucht, um sie zu sterilisieren (Nasszyklus, 121 ° C, 20 min) Haltepunkt:. Die Schwämme können gespeichert unter Wasser bei 4 ° C in einem geschlossenen Behälter, um die Gerüste vor dem Austrocknen zu verhindern.
   7. Vor dem geplanten Zellaussaat, tauchen die Gerüste in sterile 0,1 mg / ml Poly-D-Lysin (PDL) Lösung. Inkubation für 1 h bei 37 ° C.
   8. Waschen Sie die Gerüste 3x mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), um nicht gebundene PDL zu entfernen. (30 min)

2. Isolierung kortikale Neuronen der Ratte

1. Sezieren Rinden vom embryonalen Tag 18 (E18) Sprague-Dawley-Ratten, wie vorher durch Pacifici und Peruzzis ²⁷ beschrieben nach bestätigten Tier-Protokoll erhalten wird. (2 h)
2. Für 20 min bei 10 inkubieren 3 cortices in 5 ml 0,25% Trypsin mit 0,3% DNase I (aus Rinderpankreas)7 ° C.
3. Inaktivierung des Trypsins durch Zugabe von gleichen Volumen von 1 mg / ml Sojabohnen-Protein.
4. Man reibt den Kortex mit 10 ml Pasteurpipette durch Auf- und Abpipettieren 20 Mal, bis eine Einzelzellsuspension erzeugt wird. Seien Sie sanft und Luftblasenbildung zu vermeiden. (10 min)
5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 127 xg für 5 min.
6. Re-suspend das Zellpellet in 10 ml Kulturmedium (Neurobasalmedium, 1x B27 ergänzen, 1x Glutamax, 1% Penicillin / Streptomycin). Zählen Sie die Zellen. Die erwartete Zellkonzentration etwa 2x10 ⁷ / ml. (20 min)

3. Konstruieren Montage und Kultur

1. Scaffold Impfen mit Zellen.
   1. Verschieben Sie die sterile Gerüsten und alle notwendigen Utensilien in einer Zellkultur Kapuze. Mit einer sterilen Pinzette legen die Gerüste in einer 96-Well-Zellkulturplatte Zuweisung eines Gerüst pro Vertiefung. (10 min)
   2. Tauchen die Gerüste in Zellkulturmedium equilibriert diese vor der Saatgutzelleing. Inkubation für 1 h bei 37 ° C. (10 min)
   3. Saugt den Überschuß des Mediums von den Gerüsten.
   4. Apply 100 ul Zellsuspension / Schafott. (10 min)
   5. Inkubieren der Zellen bei 37 ° CO / N, um die Zellanheftung zu dem Gerüst zu ermöglichen.
   6. Am folgenden Morgen saugen die fraktionslosen Zellen und gelten 200 ul / Vertiefung frisches Kulturmedium. (10 min)
2. Gerüst Einbettung mit Kollagenmatrix. (2 h)
   1. Zeigen 10x PBS, Wasser, 1 N NaOH und Rattenschwanz-I-Kollagen auf Eis. Bereiten Sie eine Arbeitslösung von Kollagen nach den Anweisungen des Herstellers. Pflegen Sie auf Eis, bis die Zellen ausgesät Konstrukte sind bereit (bis 1 h).
   2. Entfernen Sie die Zelle ausgesät Seidenkonstrukte aus dem Inkubator und saugen Sie den Überschuß von Medium.
   3. Mit einer sterilen Pinzette übertragen Sie die Gerüste zu den leeren Brunnen auf dem Well-Platte und tauchen jedes Gerüst in 100 ul 3 mg / ml Kollagenlösung. Setzen Sie den Gewebekulturplatte zurückim Brutschrank für 30 Minuten, um die Polymerisation des Kollagens zu erlauben.
   4. Apply 100 ul vorgewärmten Zellkulturmedium / well. Kultur die Konstrukte für eine Woche Wechsel des Mediums jeden Tag durch den Austausch nur die Hälfte des Volumens des Mediums.

4. Mikroskopie Analyse

1. Live / Dead-Färbung (1 Stunde)
   1. Bereiten Stammlösung von Propidiumiodid (PI) 1 mg / ml (1,5 mm) in destilliertem Wasser.
   2. Bereiten Stammlösung von Fluoresceindiacetat (FDA) 2 mg / ml in Aceton.
   3. Bereiten Sie Arbeitslösung, die 10 & mgr; M PI und 0,15 uM FDA in PBS verdünnt. Vorwärmen die Lösung auf 37 ° C in einem Wasserbad.
   4. Waschen Sie die Zellen mit vorgewärmten PBS, um die Serum-Esterasen zu entfernen. Saugen Sie das PBS.
   5. Tragen Sie die vorgewärmte Arbeitslösung auf die Zellen für 2 Minuten und waschen Sie es mit PBS.
   6. Verwenden Epifluoreszenzmikroskop für Bild in die Zellen (PI ex λ = 490 nm, λ em = 570 nm; FDA ex λ = 490 nm, λ em = 514 nm). Der Fleck bleibt über 40 Minuten stabil. Längerer Färbung kann in unspezifische Anfärbung von PI-Aufnahme durch die Zellen und Co-Lokalisation von PI / FDA in Zellen, was zur Folge haben.
2. Immunfärbung
   1. Bei dem gewünschten Zeitpunkt der Kultur zu fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bei RT. Aufgrund der Toxizität des PFA Rauch Der Fixierschritt sollte im Abzug durchgeführt werden.
   2. Waschen Sie Gerüste mit 3x PBS Haltepunkt:. Die PFA-Fest Konstrukte können in PBS bei 4 ° C für mehrere Tage, bevor mit weiteren Schritten fortfahren gespeichert werden.
   3. Die Gerüste in 0,2% Triton, 0,25% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS mit Primärantikörper O / N Inkubieren bei 4 ° C.
   4. Am folgenden Tag entsorgen Sie die Farblösung und waschen Sie die Gerüste 3 x 30 min mit PBS, um den ungebundenen primären Antikörper zu entfernen.
   5. Der Proben mit einem sekundären Antikörper in 0,2% verdünnt Triton, 0,25% BSA in PBS für 2 inkubierenh bei RT.
   6. Entfernen Sie die Farblösung und waschen Sie die Gerüste 3 x 30 min mit PBS, um den ungebundenen sekundären Antikörper zu entfernen.
   7. Bild die Gerüste mit einem konfokalen Mikroskop mit 20x-Objektiv, indem 100 & mgr; z-Abschnitte der Probe mit 1 & mgr; m Schritt. Um die dünne Neuriten die Bildauflösung sollte mindestens 1024 x 1024 Pixel groß sein zu visualisieren.
3. RNA, DNA und Proteinisolierung
   Hinweis: RNA, DNA und Proteinisolierung wird mit einem handelsüblichen AllPrep DNA / RNA / Protein Mini Kit nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
   1. Mit einer sterilen Pinzette übertragen Sie die Gerüste aus der Kulturplatte in ein 2 ml sterilen Röhrchen. Legen Sie ein Gerüst pro Röhrchen.
   2. Gib 200 ul RLT-Puffer zu jedem Röhrchen.
   3. Stören das Konstrukt durch Fragmentierung mit sterilen Mikroschere.
   4. Um das Gewebe zu homogenisieren gestört, übertragen den Inhalt des Rohrs, um die Spin-Säule. Spin für 2 min bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge.Das Lysat wird homogenisiert, während es durch die Spinsäule passiert.
   5. Sammeln Sie die Strömung durch und verwenden Sie es sofort an RNA, DNA und Protein nach dem Hersteller-Protokoll zu isolieren.
   6. Quantifizierung der Ausbeute an Nukleinsäuren andere kompatible Methode (zB Nanodrop).
   7. Quantifizierung der Proteinausbeute mit BCA-Protein-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers. Messen Sie die Ergebnisse der Test unter Verwendung von Mikroplatten-Reader bei einer Wellenlänge von 562 nm.
      Anmerkung: Die erwartete Ausbeute an Nukleinsäuren und Protein pro Konstrukt in Bezug auf die Zelldichte ist in Figur 4 dargestellt ist.

Representative Results

Solide Seiden Schwämmen vorgeschnitten in die Donut-Form stellen eine einzigartige und einfache Idee, eine unterteilte Architektur ähnelt Nervengewebe (2A) zu erreichen. Das hochporöse Struktur des Gerüsts mit einer Porengröße von etwa 500 um entstehen außerordentlich großer Oberfläche ermöglicht die Aussaat und das Wachstum der hohen Zelldichte in einem kleinen Volumen (2x10 ^{7 /} ml) (2B). Zusätzlich wird die hohe Porosität des Trägermaterials ermöglicht die uneingeschränkte Diffusion von Nährstoffen und Abfallstoffen, was zu überlegenen Lebensfähigkeit dichten Zellkulturen über längere Zeiträume. Nach der Aussaat der Neuronen schnell und gleichmäßig zu befestigen, um die Oberfläche der Gerüstporen.

Nach Zellanheftung abgeschlossen ist und die Zellen werden auf der Seide Substrat äquilibriert wird der Schwamm-Gerüst mit dem weichen Kollagenmatrix, um eine 3D-Umgebung für axonale Netzwerkbildung (Figur 3 bereitzustellen gefüllten (3B) gefunden. Im Gegensatz dazu liefert das Kollagengel eine Maschenwerk, die umfangreiche axonalen Wachstums in 3D unterstützt, während neuronalen Zellkörpern bleiben mit dem Seiden Gerüst (3C) befestigt sind. Dieses Wachstumsverhalten führt zu Kompartimentierung der Zellkörper und reinem axonalen Netze (Figur 3D), die die grauen und weißen Substanz des Kortex im Gehirn ähnelt.

Abgesehen von Mikroskopie kann die Konstrukte mit einer Vielzahl von anderen Methoden ¹⁸ ausgewertet werden, abhängig von der Frage, hinter dem Experiment. Zum Beispiel kann die Isolierung von DNA, RNA und Protein aus den Konstrukten leicht unter Verwendung kommerzieller Kits (Abbildung 4). Die Ausbeute an Nukleinsäuren und Protein per Konstrukt, hängt von der Anzahl der Zellen, der ursprünglich auf die Seide Gerüste geimpft. Je mehr Zellen ausgesät desto höher ist die Ausbeute an DNA, RNA und Protein.

Abbildung 1. PTFE-Form für Seide Schwamm Gerüstherstellung verwendet Die Abmessungen:.. 10 cm Durchmesser, 2 cm Höhe Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. 3D-Gehirn-ähnliche Gewebemodell. (A) Poröse Seiden Schwamm Schafott. (B) lebend / tot-Färbung von Neuronen am Tag 1 nach der Aussaat auf Seide Gerüst vor dem Kollagen (grün-lebende Zellen, red-dead-Zellen) die Einbettung. Panels auf der rechten Seite zeigen die magnification der Bereich im roten Rahmen eingefangen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Neuronale compartmentalized Auswuchs in der 3D-Gehirn-ähnliche Gewebemodell (A) Scaffold Fächer:. Red-Zellkörper Fach, Blau-axonalen Fach. (B) Die neuronale Wachstumsmuster am Tag 1 nach der Aussaat vor Kollagen Einbettung. (C). Neuronale Auswachsen am Tag 7 nach der Aussaat in den Zellkörper Fach. (D) Neuronale Auswuchs am 7. Tag nach der Aussaat im axonalen Kompartiment. Grün -. ΒIIITubulin Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehenAbbildung.

Abbildung 4. Erwartete Rendite aus (A) RNA und DNA, und (B) Protein pro Konstrukt in Bezug auf die Menge an Zellen ausgesät pro Gerüst (± SD, n = 5). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223530
LiBr	Sigma-Aldrich	213225
MWCO 3500 dialysis cassettes	Thermo Fisher	66110
Heating plate	Fisher Scientific	Isotemp
Centrifuge 5804 R	Eppendorf
Sieve	Fisher Scientific		No. 270, No. 35, No. 30
PTFE mold			made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height
NaCl	Sigma-Aldrich	71382
Biopsy Punch 5 mm	World Precision Instrument	501909
Biopsy Punch 2 mm	World Precision Instrument	501908
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407-5MG	final concentration 10 μg/ml, dissolved in water
PBS	Sigma-Aldrich	D1283-500ML
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
DNase	Roche	10104159001	final concentration 0.3%
Soybean protein	Sigma-Aldrich	T6522-100MG	final concentration 1 mg/ml
Neurobasal medium	Gibco	21103049	warm up to 37 °C before use
B27 supplement 50x	Gibco	17504-044
Glutamax	Gibco	35050-061
Penicilin Streptomycin	Corning	30-002-CI
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	final concentration 3 mg/ml
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770	corrosive
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170-10MG	toxic
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378-5G
Olympus MVX10	Olympus
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	toxic, final concentration 4%
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G
anti-βIIITubulin antibody	Sigma-Aldrich	T2200	rabbit 1:500
anti-rabbit Alexa-546	Molecular Probes	A11010	goat 1:250
goat serum	Sigma-Aldrich	G9023-5ML
Leica SP2 confocal microscope	Leica		objective 20X
QIAshredder	Qiagen	79654
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit	Qiagen	80004
Ethyl alcohol, Pure	Sigma-Aldrich	E7023
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific
BCA protein assay	Thermo Scientific	23225
Plate reader Spectramax M2	Molecular Devices		absorbance 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	TedPella	1346