极化神经组织工程三维蚕丝胶原蛋白为基础的模式

Introduction

中枢神经系统（CNS）可受到各种涉及血管，结构，功能，感染或变性病症。估计有680万人，每年死于神经障碍的结果，它代表全世界日益社会经济负担^1。然而，只有少数的病症有可用的治疗。因此，存在对用于从患者的神经系统疾病的患者的创新的治疗策略迫切需要。不幸的是，许多中枢神经系统靶向治疗在临床试验中由于不充分的临床前研究模型，不允许与生理有关职能读数急性和慢性影响评价的利用率失败，部分原因。

尽管在过去几十年显著的研究工作，还有大量未知的有关中枢神经系统的结构和功能。为了获得更多的知识，动物模型往往我们编模型的病理状态，例如创伤性脑损伤（TBI）或痴呆，特别是在临床前研究。然而，动物从人都在中枢神经系统的解剖结构，以及在功能上，基因表达和代谢^2-4显著不同。另一方面，2D 体外培养物来研究细胞生物学的常规方法和常规用于药物发现。然而，二维细胞培养物缺乏的复杂性和生理相关性相比，人类的大脑^5-7。虽然没有替代品的成本二维细胞培养研究低和简单或动物模型所提供的复杂性，3D组织工程可能会产生更好的研究模型关闭了2D之间存在体外和体内的方法的差距。三维组织工程提供了通过三维细胞 - 细胞相互作用和由生物材料支架提供胞外线索实现多种生理相关的实验条件。 DESP伊特3D背后的文化价值的显著的证据，目前只有少数的3D中枢神经系统组织模型，比如干细胞衍生的类器官培养^{8-10，neurospheroids 11}和分散的水凝胶文化^12,13。先进的技术方法，包括多层光刻^14，和3D打印¹⁵已被用于研究肺，肝，肾和组织。然而，缺乏中枢神经系统的3D模型，允许条块分割的神经元生长，如模仿皮质结构和生物学。轴突从神经元细胞体中分离生长先前已经在2D培养通过使用微加工^16,17允许轴突道追踪，钙内流，网络体系结构和活动的研究证实。这个想法激发了我们能够开发出3D偏光神经组织，是细胞体和轴突束分布在不同的车厢模仿大脑¹⁸的分层体系结构

Protocol

脑组织分离方案经塔夫茨大学机构动物护理和使用委员会，并符合卫生指南实验动物的护理和使用（机构动物护理和使用委员会B2011-45）全国学院。

1.丝绸脚手架准备

1. 如先前^19,20描述了从家蚕蚕茧丝绸溶液的制备。
   1. 横切茧成用剪刀8等份。使用约11茧为5克支离破碎的蚕茧。 （15分钟）
   2. 准备2升的0.02M _的 Na 2 CO ₃溶液，并把它用热板煮沸。 （15分钟）
   3. 称取5克零散蚕茧和煮沸中_的 Na 2 CO ₃溶液中30分钟。搅拌煮沸丝每隔几分钟用锅铲。这一步，​​也被称为脱胶，净化丝素蛋白由亲水性蛋白质，sericins。 （30分钟）
   4. 将湿纤蛋白上的培养皿中，并干燥，在流罩O / N的丝心蛋白提取物。
   5. 第二天称量干纤蛋白质量和放置丝心蛋白在玻璃烧杯中。 （15分钟）
   6. 为了通过4乘以干素蛋白的质量溶于9.3中号溴化锂溴化锂溶液，计算所需体积（毫升）的素慢慢倒入溴化锂溶液中的丝素蛋白，用抹刀沉浸所有的丝素纤维。覆盖烧杯以防止蒸发，并将其放置在60℃下4小时，以使纤维溶解。 （15分钟）
   7. 使用注射器，收集烧杯丝心蛋白溶液和其装载到截留分子量3500的透析盒。执行透析蒸馏水48小时。换水每隔几个小时。
   8. 使用注射器，收集丝心蛋白溶液卡匣到50ml锥形管中并离心两次以9,000rpm（〜12700×g离心）在4℃下20分钟。倾上清液到新的管中的每个离心步骤后，弃去沉淀。 （40分）
   9. 通过估计干重测量丝心蛋白的浓度。倒入1毫升丝溶液成权衡船。干燥在烤箱的样品在60℃下2小时。称量干燥丝纤蛋白和由100的丝溶液的预期浓度所获得的权重乘法计算的丝纤蛋白溶液的浓度为6-9％（重量/体积）。
   10. 通过将其在蒸馏水稀释调整丝浓度至6％（重量/体积）。
       停止点：液体丝纤蛋白可存放于4℃最多一个月在密闭容器中。
2. 制取丝溶液多孔支架。
   1. 筛粒状的NaCl以分离颗粒尺寸500-600微米，这将在后面的步骤中使用。丢弃颗粒小号尺寸低于500微米以上600微米。 （15分钟）
   2. 倾的30ml 6％丝溶液到聚四氟乙烯（PTFE）的模具（ 图1）。轻轻地撒60克过筛氯化钠过的丝绸。敲击容器以获得盐的均匀层。孵育48小时，在室温聚合丝。
   3. 将含有支架的PTFE模具在烘箱在60℃下1小时以完成聚合和蒸发任何剩余的液体。
   4. 放置的PTFE模具的含量在含有2升蒸馏水48小时浸出的盐的烧杯中。换水，每天2-3次。除去从模具海绵支架时盐完全浸出停止点 ：该海绵可以存储浸没在水中，在4℃的密闭容器中，以防止支架从脱水。
   5. 准备就绪后，切出直径5毫米的穿刺打孔的支架。预切支架达到约2mm的高度。浦NCH ​​脱离与2毫米直径活检穿孔（图2A）的支架的中心。 （1小时）
   6. 高压釜浸入水中支架消毒他们（湿循环，121℃，20分钟）停止点 ：该海绵可以存储浸没在水中，在4℃的密闭容器中，以防止支架从脱水。
   7. 计划细胞接种之前，浸泡在无菌0.1毫克/毫升聚D-赖氨酸（PDL）溶液支架。孵育1小时，在37℃。
   8. 洗支架用磷酸盐缓冲盐水（PBS）3倍以除去未结合的PDL。 （30分钟）

2.隔离大鼠皮层神经元

1. 解剖皮层从胚胎第18天（E18）Sprague-Dawley大鼠通过Pacifici和佩鲁齐²⁷获得批准动物协议之后如前所述。 （2小时）
2. 为20分钟，在3孵育10皮层在5毫升的0.25％胰蛋白酶的0.3％DNA酶I（来自牛胰腺）7℃。
3. 通过加入1mg / ml的大豆蛋白质的等体积灭活胰蛋白酶。
4. 磨碎移液器向上用10ml巴斯德吸管将皮质和向下20次，直到产生单细胞悬浮液。要轻柔，避免气泡形成。 （10分钟）
5. 离心细胞悬浮液在127×g离心5分钟。
6. 重悬在10ml培养基的细胞沉淀（Neurobasal培养基，1×B27添加剂，1×Glutamax的，1％青霉素/链霉素）。计数细胞。预期的细胞浓度是约2×10 ^{7 /}毫升。 （20分钟）

3.建设大会与文化

1. 支架接种用的细胞。
   1. 将无菌支架和所有必要的用具的细胞培养罩内。使用无菌镊子放置在96孔细胞培养板中的支架分配每孔1的支架。 （10分钟）
   2. 沉浸在细胞培养基中的支架以平衡它们之前细胞种子ING。孵育1小时，在37℃。 （10分钟）
   3. 吸出多余的支架介质。
   4. 适用于100微升细胞悬浮液/支架。 （10分钟）
   5. 孵育细胞在37℃CO / N，以使细胞附着到所述支架。
   6. 第二天上午吸出非附着的细胞，并应用200μl/孔的新鲜培养基。 （10分钟）
2. 脚手架胶原基质中嵌入。 （2小时）
   1. 放置10×PBS中，水，1N NaOH和大鼠尾I型胶原在冰上。制备胶原的工作溶液按照制造商的说明。保持在冰上，直至细胞接种构建体准备（高达1小时）。
   2. 从培养箱中取出细胞接种丝构建体和吸出多余的培养基。
   3. 使用无菌镊子支架转交到空孔的孔板和浸入每个支架在100μl的3毫克/毫升的胶原溶液。放置组织培养板背面在孵化30分钟，以允许胶原的聚合。
   4. 申请将100μl预热的细胞培养基/孔。培养所述构建体一周每天改变介质通过更换培养基的一半的体积。

4.显微镜分析

1. 活/死染色（1小时）
   1. 制备碘化丙啶（PI）为1mg / ml（1.5毫摩尔）的蒸馏水的贮液。
   2. 制备的荧光素二乙酸酯（FDA）的2毫克/毫升的丙酮储备液。
   3. 制备含有10μM的PI和0.15μM的FDA的在PBS中稀释的工作溶液。预温水浴中的溶液至37℃。
   4. 用预热的PBS洗涤细胞以除去血清酯酶。吸出PBS。
   5. 应用细胞上的预热工作溶液2分钟，用PBS洗涤。
   6. 使用啶显微镜图像细胞（PI前λ= 490纳米，EMλ= 570纳米; FDA前λ= 490ñ男，EMλ= 514纳米）。污渍保持稳定40分钟。延长染色会导致从由细胞PI摄取和细胞内共定位的PI / FDA的所得非特异性染色。
2. 免疫染色
   1. 在培养所需的时间点固定细胞，用4％多聚甲醛（PFA），用于在室温30分钟。由于煤灰的毒性油烟定影步骤应在通风橱中进行。
   2. 洗支架与3×PBS 停止点 ：该PFA固定构建体可以在进行进一步的步骤之前被存储在PBS在4℃下数天。
   3. 孵育在PBS含第一抗体的O / N的0.2％的Triton，0.25％牛血清白蛋白（BSA）的支架在4℃。
   4. 翌日丢弃染色液并用PBS洗支架3×30分钟，以除去未结合的第一抗体。
   5. 孵育样品与0.2％的Triton稀释二级抗体，0.25％BSA的PBS进行2小时，在室温。
   6. 除去染色液并用PBS洗支架3×30分钟，以除去未结合的次级抗体。
   7. 图像使用共聚焦显微镜20X物镜通过取样品为100μm的z切片用1微米步骤支架。以可视化的薄突起图像的分辨率应该是最低1,024×1,024像素。
3. RNA，DNA和蛋白质分离
   注意：RNA，DNA和蛋白质的分离使用根据制造商的说明书一商业AllPrep的DNA / RNA /蛋白质Mini试剂盒进行。
   1. 使用无菌镊子转移支架出培养板的一个2毫升无菌试管中。将每管1支架。
   2. 加入200μl的RLT缓冲液到每个管中。
   3. 用无菌microscissors分段来扰乱结构。
   4. 以均化破碎的组织，该管的内容传送到离心柱。在离心旋转2分钟全速。将裂解物均化，因为它通过旋转柱。
   5. 收集通过流动，并立即用它来分离RNA，DNA和蛋白质，按照制造商的协议。
   6. 量化的核酸的产量的任何其他兼容方法（例如，的NanoDrop）。
   7. 量化，根据制造商的说明书用BCA蛋白质测定蛋白质产率。使用酶标仪在波长562nm处测量试验的结果。
      注意：核酸和相对于细胞密度每构建体蛋白的预期产量示于图4。

Representative Results

固体丝海绵预切成甜甜圈形状代表一个独特的和简单的想法实现条块架构类似的神经组织（图2A）。具有大约500微米的结果特别高的表面积，允许一个小体积内的接种和高细胞密度生长的孔径高度多孔支架的结构（2×10 ⁷ / ml）的（图2B）。此外，该支架的高孔隙率允许营养物和废物产生稠密的细胞培养物在扩展的时间帧优越生存能力无限制扩散。在播种神经元迅速而均匀地附着到所述支架的孔的表面上。

后细胞附着完成并将细胞平衡的蚕丝基板上，海绵支架填充有柔软的胶原基质，以便提供3D环境轴突网络形成（图3 图3B）中发现的孔的表面生长的扩展。与此相反，在胶原凝胶提供支持在三维广泛轴突生长，而神经元细胞体保持附着在蚕丝支架（图3C）一个小梁。这种增长模式导致的细胞体和纯轴突网络（ 图3D），这类似于在脑皮层的灰质和白质的条块分割。

除了 ​​显微镜，所述构建体可以用各种其他方法¹⁸来评估，根据实验背后的问题。例如，DNA，RNA和蛋白质从构建的隔离可以容易地使用商业试剂盒（图4）执行的。核酸和蛋白质的pe屈服ř构建取决于细胞初始接种于丝支架的数量。越细胞接种的DNA，RNA和蛋白质的产率越高。

用于丝绸海绵支架制备图1. PTFE模具的尺寸：10厘米直径的2厘米高，请点击此处查看该图的放大版本。

图2. 3D脑状组织模式。（A）多孔丝海绵支架。 （ 二）现场/死亡的神经元，在1天播种后染色丝绸支架前胶原嵌入（绿活细胞，红死细胞）。右侧面板显示的马红色帧拍摄区gnification。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3.神经元在大脑的三维状组织模式条块分割的产物（A）脚手架车厢：红细胞体室，蓝轴突间室。 （ 二）在胶原蛋白嵌入1日前日向接种神经元的生长方式。 （C）。在接种在细胞体内室神经元向外生长7天。 （ 四）播种后神经生长在第7天，在轴突间室。绿色- βIIITubulin 请点击此处查看这是一个更大的版本数字。

（一）RNA和DNA，和（B）与细胞每支架播种量每结构蛋白图4.预期收益率（±SD，N = 5）。 请点击此处查看该图的放大版本。 。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223530
LiBr	Sigma-Aldrich	213225
MWCO 3500 dialysis cassettes	Thermo Fisher	66110
Heating plate	Fisher Scientific	Isotemp
Centrifuge 5804 R	Eppendorf
Sieve	Fisher Scientific		No. 270, No. 35, No. 30
PTFE mold			made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height
NaCl	Sigma-Aldrich	71382
Biopsy Punch 5 mm	World Precision Instrument	501909
Biopsy Punch 2 mm	World Precision Instrument	501908
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407-5MG	final concentration 10 μg/ml, dissolved in water
PBS	Sigma-Aldrich	D1283-500ML
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
DNase	Roche	10104159001	final concentration 0.3%
Soybean protein	Sigma-Aldrich	T6522-100MG	final concentration 1 mg/ml
Neurobasal medium	Gibco	21103049	warm up to 37 °C before use
B27 supplement 50x	Gibco	17504-044
Glutamax	Gibco	35050-061
Penicilin Streptomycin	Corning	30-002-CI
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	final concentration 3 mg/ml
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770	corrosive
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170-10MG	toxic
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378-5G
Olympus MVX10	Olympus
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	toxic, final concentration 4%
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G
anti-βIIITubulin antibody	Sigma-Aldrich	T2200	rabbit 1:500
anti-rabbit Alexa-546	Molecular Probes	A11010	goat 1:250
goat serum	Sigma-Aldrich	G9023-5ML
Leica SP2 confocal microscope	Leica		objective 20X
QIAshredder	Qiagen	79654
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit	Qiagen	80004
Ethyl alcohol, Pure	Sigma-Aldrich	E7023
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific
BCA protein assay	Thermo Scientific	23225
Plate reader Spectramax M2	Molecular Devices		absorbance 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	TedPella	1346