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Bioengineering

फूट डालना तंत्रिका ऊतक के इंजीनियर 3 डी सिल्क कोलेजन आधारित मॉडल

Published: October 23, 2015 doi: 10.3791/52970
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Tufts University, 2Department of Pediatrics, University of Connecticut Health Center & Connecticut Children's Medical Center

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस), संरचनात्मक कार्यात्मक, संक्रामक या अपक्षयी नाड़ी से जुड़े विकारों की एक किस्म से प्रभावित हो सकते हैं। एक अनुमान के अनुसार 68 लाख लोग एक दुनिया भर में एक से बढ़ सामाजिक आर्थिक बोझ का प्रतिनिधित्व करता है जो मस्तिष्क संबंधी बीमारियों का एक परिणाम के रूप में हर साल मर जाते हैं। हालांकि, विकारों के केवल कुछ उपचार उपलब्ध है। इसलिए, मस्तिष्क संबंधी बीमारियों से पीड़ित रोगियों के लिए अभिनव चिकित्सकीय रणनीति के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। दुर्भाग्य से, कई सीएनएस-लक्षित चिकित्सा विज्ञान की वजह से physiologically प्रासंगिक कार्यात्मक readouts के साथ तीव्र और जीर्ण प्रभावों के मूल्यांकन की अनुमति नहीं है, जो अपर्याप्त पूर्व नैदानिक ​​अनुसंधान मॉडल, का उपयोग करने के लिए भाग में, क्लिनिकल परीक्षण के दौरान विफल हो।

पिछले दशकों में महत्वपूर्ण अनुसंधान के प्रयासों के बावजूद, सीएनएस की संरचना और समारोह के बारे में अज्ञात एक विशाल राशि है। अधिक ज्ञान प्राप्त करने के लिए, पशु मॉडल अक्सर हम कर रहे हैंएड विशेष रूप से पूर्व नैदानिक ​​अध्ययन में, इस तरह के घाव मस्तिष्क चोट (TBI) या पागलपन के रूप में रोग राज्यों, मॉडल करने के लिए। हालांकि, जानवरों से मनुष्यों में दोनों सीएनएस की शारीरिक रचना में, साथ ही समारोह, जीन अभिव्यक्ति और चयापचय 2-4 में काफी भिन्न होते हैं। दूसरी ओर, 2 डी में इन विट्रो संस्कृतियों कोशिका जीव विज्ञान की जांच करने के लिए आम तरीका कर रहे हैं और नियमित रूप से दवाओं की खोज के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, 2 डी सेल संस्कृतियों जटिलता और मानव मस्तिष्क 5-7 की तुलना में शारीरिक प्रासंगिकता की कमी है। कम लागत और सादगी 2 डी सेल संस्कृति के अध्ययन की या पशु मॉडल द्वारा प्रदान की जटिलता के लिए कोई विकल्प नहीं है, वहीं 3 डी ऊतक इंजीनियरिंग विट्रो और इन विवो दृष्टिकोण में 2 डी के बीच मौजूद है कि अंतर को बंद करने के लिए सुधार अनुसंधान मॉडल उत्पन्न कर सकता है। 3 डी ऊतक इंजीनियरिंग 3 डी सेल सेल बातचीत और biomaterial मचानों द्वारा प्रदान की बाह्य संकेतों द्वारा हासिल की और physiologically प्रासंगिक प्रयोगात्मक शर्तों प्रदान करता है। सैर3 डी संस्कृतियों के मूल्य के पीछे महत्वपूर्ण सबूत ite, वहाँ इस तरह के स्टेम सेल व्युत्पन्न organoid संस्कृतियों 8-10 के रूप में केवल कुछ ही 3 डी सीएनएस ऊतक मॉडल, 11 neurospheroids वर्तमान में कर रहे हैं और हाइड्रोजेल संस्कृतियों 12,13 छितरी हुई है। बहुपरत लिथोग्राफी 14, और 3 डी प्रिंटिंग 15 सहित उन्नत तकनीकी विधियों फेफड़े, जिगर और गुर्दे ऊतक के अध्ययन के लिए उपयोग किया गया है। हालांकि, इस तरह cortical वास्तुकला और जीव विज्ञान की नकल उतार रूप में बंटे न्यूरोनल विकास के लिए अनुमति है कि 3 डी सीएनएस मॉडल, की कमी नहीं है। Neuronal सेल निकायों से neurites के अलग विकास पहले से अक्षतंतु पथ ट्रेसिंग, कैल्शियम बाढ़, नेटवर्क वास्तुकला और गतिविधियों के अध्ययन की अनुमति microfabrication 16,17 का उपयोग करके 2 डी संस्कृतियों में प्रदर्शन किया गया है। यह विचार सेल निकायों और axonal इलाकों मस्तिष्क 18 की स्तरीय वास्तुकला नकल उतार अलग डिब्बों में स्थित हैं, जहां एक 3 डी ध्रुवीकृत तंत्रिका ऊतक विकसित करने के लिए हमें प्रेरित

Protocol

मस्तिष्क के ऊतकों अलगाव प्रोटोकॉल टफ्ट्स विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी है और देखभाल और उपयोग प्रयोगशाला पशु की (संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति B2011-45) के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के साथ अनुपालन किया गया था।

1. सिल्क पाड़ तैयारी

  1. बॉम्बिक्स मोरी कोकून से रेशम समाधान की तैयारी पहले से 19,20 वर्णित है।
    1. कैंची का उपयोग 8 बराबर टुकड़ों में प्रत्येक कोकून कट। खंडित कोकून की 5 ग्राम के लिए लगभग 11 कोकून का प्रयोग करें। (15 मिनट)
    2. 0.02 एम ना 2 3 सीओ समाधान के 2 एल तैयार है और एक गर्म प्लेट का उपयोग फोड़ा करने के लिए इसे लाने के लिए। (15 मिनट)
    3. खंडित कोकून के 5 ग्राम वजन और 30 मिनट के लिए ना 2 3 सीओ समाधान में उन्हें फोड़ा। एक रंग के साथ उबलते रेशम हर कुछ मिनट तक हिलाओ। यह भी डे-Gumming नामक यह कदम, हाइड्रोफिलिक प्रोटीन, sericins से रेशम फ़ाइब्राइन शुद्ध। (30 मिनट)
    4. एक पेट्री डिश पर गीला फ़ाइब्राइन रखें और प्रवाह हुड हे / एन में फ़ाइब्राइन निकालने सूखी।
    5. अगले दिन सूखा फ़ाइब्राइन बड़े पैमाने पर तौलना और एक गिलास बीकर में फ़ाइब्राइन जगह है। (15 मिनट)
    6. 4. द्वारा सूखा फ़ाइब्राइन के द्रव्यमान से गुणा करके LiBr की 9.3 एम LiBr समाधान, (एमएल) में आवश्यक मात्रा की गणना में फ़ाइब्राइन भंग करने के लिए धीरे धीरे रेशम फ़ाइब्राइन खत्म LiBr समाधान डालना और रंग का उपयोग कर सभी फ़ाइब्राइन फाइबर विसर्जित कर दिया। वाष्पीकरण को रोकने और तंतुओं को भंग करने की अनुमति देने के लिए 4 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर यह जगह करने बीकर कवर। (15 मिनट)
    7. सिरिंज का प्रयोग, बीकर से फ़ाइब्राइन समाधान इकट्ठा करने और MWCO 3,500 डायलिसिस कैसेट में लोड। 48 घंटे के लिए आसुत जल के खिलाफ डायलिसिस प्रदर्शन करते हैं। पानी हर दो घंटे के लिए परिवर्तित करें।
    8. सिरिंज का प्रयोग, से फ़ाइब्राइन समाधान इकट्ठा20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 9000 आरपीएम (~ 12,700 XG) में दो बार 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में कैसेट। प्रत्येक centrifugation कदम के बाद एक ताजा ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला डालो और गोली त्यागें। (40 मिनट)
    9. सूखी वजन का आकलन करके फ़ाइब्राइन की एकाग्रता उपाय। एक तौलना नाव में रेशम समाधान के 1 मिलीलीटर डालो। 2 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में नमूना सूखी। सूखी रेशम फ़ाइब्राइन वजन और 100 से रेशम समाधान की उम्मीद है और एकाग्रता प्राप्त वजन गुणा करके रेशम फ़ाइब्राइन समाधान की एकाग्रता की गणना 6-9% है (w / v)।
    10. आसुत जल में यह गिराए द्वारा (v / डब्ल्यू) 6% करने के लिए रेशम एकाग्रता को समायोजित करें।
      रोक बिंदु: तरल रेशम फ़ाइब्राइन एक बंद कंटेनर में अप करने के लिए एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. रेशम समाधान से झरझरा मचानों की तैयारी।
    1. कणिकाओं बाद के चरणों में इस्तेमाल किया जाएगा जो 500-600 माइक्रोन आकार अलग करने के लिए दानेदार सोडियम क्लोराइड छान लें। दाना त्यागें500 माइक्रोन से नीचे और 600 माइक्रोन से ऊपर आकार। (15 मिनट)
    2. Polytetrafluoroethylene (PTFE) मोल्ड (चित्रा 1) में 6% रेशम समाधान के 30 मिलीलीटर डालो। धीरे रेशम से अधिक sieved सोडियम क्लोराइड की 60 ग्राम तितर बितर। नमक की एक समान परत प्राप्त करने के लिए कंटेनर टैप करें। रेशम भाजन के लिए आरटी पर 48 घंटा सेते हैं।
    3. बहुलकीकरण को अंतिम रूप देने और किसी भी शेष तरल लुप्त हो जाना 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में पाड़ युक्त PTFE मोल्ड रखें।
    4. नमक बाहर नमकीन पानी के लिए 48 घंटे के लिए आसुत जल के 2 एल युक्त एक बीकर में PTFE मोल्ड की सामग्री रखें। पानी प्रति दिन 2-3 बार बदलें। । नमक पूरी तरह से बात रोकना बाहर leached है जब नए नए साँचे से स्पंज मचानों निकालें: स्पंज निर्जलीकरण से मचानों को रोकने के लिए एक बंद कंटेनर में 4 डिग्री सेल्सियस पर पानी में डूब संग्रहित किया जा सकता है।
    5. जब तैयार है, 5 मिमी व्यास बायोप्सी पंच के साथ मचानों बाहर काट दिया। ऊंचाई में लगभग 2 मिमी तक पहुँचने के लिए मचानों पूर्व में कटौती। पु2 मिमी व्यास बायोप्सी पंच (2A चित्रा) के साथ पाड़ के केंद्र से बाहर एनसीएच। (1 घंटा)
    6. । बिंदु रोकना (गीला चक्र 121 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट) उन्हें बाँझ पानी में डूब मचानों आटोक्लेव: स्पंज निर्जलीकरण से मचानों को रोकने के लिए एक बंद कंटेनर में 4 डिग्री सेल्सियस पर पानी में डूब संग्रहित किया जा सकता है।
    7. योजना बनाई सेल बोने से पहले, बाँझ 0.1 मिलीग्राम / एमएल पाली डी lysine (पीडीएल) समाधान में मचानों विसर्जित कर दिया। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    8. मचानों गैर बाध्य पीडीएल दूर करने के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ 3x धो लें। (30 मिनट)

चूहे cortical न्यूरॉन्स की 2. अलगाव

  1. अनुमोदित जानवरों प्रोटोकॉल प्राप्त होने के बाद पहले से Pacifici और Peruzzi 27 द्वारा वर्णित के रूप में भ्रूण दिन से 18 (E18) Sprague-Dawley चूहों cortices काटना। (2 घंटा)
  2. 3 से 20 मिनट के लिए (गोजातीय अग्न्याशय से) 0.3% DNase मैं के साथ 0.25% trypsin के 5 मिलीलीटर में 10 cortices सेते7 डिग्री सेल्सियस।
  3. 1 मिलीग्राम / एमएल सोयाबीन प्रोटीन की बराबर मात्रा जोड़कर trypsin निष्क्रिय।
  4. एक एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न होता है जब तक ऊपर pipetting द्वारा 10 मिलीलीटर पाश्चर विंदुक का उपयोग cortices और नीचे 20 बार Triturate। कोमल हो और हवा बुलबुला गठन से बचें। (दस मिनट)
  5. 5 मिनट के लिए 127 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
  6. पुनः निलंबित संस्कृति के माध्यम से 10 मिलीलीटर में सेल गोली (Neurobasal मध्यम, 1x B27 पूरक, 1x Glutamax, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन)। कोशिकाओं की गणना। उम्मीद सेल एकाग्रता के बारे में 2x10 7 / मिलीलीटर है। (बीस मिनट)

3. विधानसभा और संस्कृति का निर्माण

  1. कोशिकाओं के साथ पाड़ बोने।
    1. एक सेल संस्कृति हुड के अंदर बाँझ मचानों और सभी आवश्यक बर्तन ले जाएँ। का प्रयोग बाँझ संदंश एक 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में मचानों अच्छी तरह से प्रति एक पाड़ आवंटन जगह है। (दस मिनट)
    2. उन्हें पूर्व के बीज सेल को संतुलित करने के लिए सेल संस्कृति माध्यम में मचानों विसर्जितआईएनजी। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। (दस मिनट)
    3. मचानों से मध्यम से अधिक Aspirate।
    4. सेल निलंबन / पाड़ के 100 μl लागू करें। (दस मिनट)
    5. पाड़ के लिए सेल लगाव के लिए अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सीओ / एन में कोशिकाओं को सेते हैं।
    6. अगली सुबह गैर जुड़ी कोशिकाओं महाप्राण और 200 μl / अच्छी तरह से ताजा संस्कृति के माध्यम से लागू होते हैं। (दस मिनट)
  2. कोलेजन मैट्रिक्स के साथ embedding पाड़। (2 घंटा)
    1. मैं बर्फ पर कोलेजन 10x पीबीएस, पानी, 1 एन NaOH और चूहे की पूंछ रखें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोलेजन का काम कर समाधान तैयार है। सेल वरीयता प्राप्त निर्माणों (1 घंटा तक) के लिए तैयार हैं जब तक बर्फ पर बनाए रखें।
    2. इनक्यूबेटर से सेल वरीयता प्राप्त रेशम निर्माणों निकालें और मध्यम से अधिक महाप्राण।
    3. का प्रयोग बाँझ संदंश अच्छी तरह से थाली पर खाली कुओं को मचानों हस्तांतरण और 3 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन समाधान के 100 μl में प्रत्येक पाड़ विसर्जित कर दिया। वापस टिशू कल्चर प्लेट रखेंइनक्यूबेटर में 30 मिनट के कोलेजन के polymerization की अनुमति देने के लिए।
    4. अच्छी तरह से / पूर्व गर्म सेल संस्कृति माध्यम के 100 μl लागू करें। संस्कृति एक सप्ताह के माध्यम की केवल आधी मात्रा की जगह से हर दिन मध्यम बदलने के लिए निर्माणों।

4. माइक्रोस्कोपी विश्लेषण

  1. लाइव / मृत धुंधला (1 घंटा)
    1. Propidium आयोडाइड (पीआई) आसुत जल में 1 मिलीग्राम / एमएल (1.5 मिमी) के शेयर समाधान तैयार है।
    2. एसीटोन में fluorescein diacetate (एफडीए) 2 मिलीग्राम / एमएल के शेयर समाधान तैयार है।
    3. पीबीएस में पतला 10 माइक्रोन पीआई और 0.15 माइक्रोन एफडीए युक्त काम कर समाधान तैयार है। नहाने के पानी में 37 डिग्री सेल्सियस का हल पूर्व गर्म।
    4. सीरम esterases दूर करने के लिए पूर्व गर्म पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। पीबीएस Aspirate।
    5. 2 मिनट के लिए कोशिकाओं पर पूर्व गर्म काम कर समाधान लागू करें और पीबीएस के साथ इसे धो लो।
    6. एफडीए पूर्व λ = 490 एन; छवि के लिए epifluorescent माइक्रोस्कोप का उपयोग कोशिकाओं (पीआई पूर्व λ = 490 एनएम, उन्हें λ 570 एनएम =मीटर, उन्हें λ) 514 एनएम =। दाग 40 मिनट से अधिक स्थिर बनी हुई है। लंबे समय तक धुंधला पीआई कोशिकाओं से तेज और कोशिकाओं में गड़बड़ी / एफडीए के सह स्थानीयकरण से उत्पन्न unspecific धुंधला में परिणाम हो सकता है।
  2. Immunostaining
    1. संस्कृति के वांछित समय बिंदु पर आरटी पर 30 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक। कारण पीएफए ​​की विषाक्तता के फिक्सिंग कदम रासायनिक धूआं हुड में किया जाना चाहिए धुएं।
    2. । 3x पीबीएस रोक बिंदु के साथ मचानों धो: पीएफए ​​तय निर्माणों आगे कदम के साथ आगे बढ़ने से पहले कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में संग्रहित किया जा सकता है।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी हे / एन युक्त पीबीएस में 0.2% ट्राइटन, 0.25% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) में मचानों सेते हैं।
    4. अगले दिन धुंधला समाधान त्यागने और अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी को दूर करने के लिए पीबीएस के साथ मचानों 3 एक्स 30 मिनट धो लें।
    5. 2 के लिए पीबीएस में ट्राइटन 0.2% में पतला एंटीबॉडी, 0.25% BSA के साथ नमूने सेतेआरटी पर घंटा।
    6. धुंधला समाधान निकालें और अनबाउंड माध्यमिक एंटीबॉडी को दूर करने के लिए पीबीएस के साथ मचानों 3 एक्स 30 मिनट धो लें।
    7. छवि 1 माइक्रोन कदम के साथ नमूने के 100 माइक्रोन Z-वर्गों लेने के द्वारा 20X उद्देश्य के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग मचानों। छवि संकल्प न्यूनतम 1024 x 1024 पिक्सल की होनी चाहिए पतली neurites कल्पना करने के लिए।
  3. शाही सेना, डीएनए और प्रोटीन अलगाव
    नोट: शाही सेना, डीएनए और प्रोटीन अलगाव निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक AllPrep डीएनए / आरएनए / प्रोटीन मिनी किट का उपयोग किया जाता है।
    1. का प्रयोग बाँझ संदंश एक 2 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब संस्कृति की थाली से बाहर मचानों हस्तांतरण। ट्यूब प्रति एक पाड़ रखें।
    2. प्रत्येक ट्यूब RLT बफर के 200 μl जोड़ें।
    3. बाँझ microscissors के साथ यह fragmenting द्वारा निर्माण बाधित।
    4. बाधित ऊतक homogenize करने के लिए, स्पिन स्तंभ के लिए ट्यूब की सामग्री के हस्तांतरण। एक microcentrifuge में पूरी रफ्तार से 2 मिनट के लिए स्पिन।यह स्पिन स्तंभ के माध्यम से गुजरता के रूप में lysate homogenized है।
    5. के माध्यम से प्रवाह लीजिए और आरएनए, निर्माता प्रोटोकॉल के बाद डीएनए और प्रोटीन को अलग-थलग करने के लिए इसे तुरंत का उपयोग करें।
    6. न्यूक्लिक एसिड की उपज किसी अन्य संगत विधि (जैसे, NanoDrop) यों।
    7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार बीसीए प्रोटीन परख का उपयोग प्रोटीन उपज यों। तरंग दैर्ध्य 562 एनएम पर microplate रीडर का उपयोग परख के परिणाम उपाय।
      नोट: न्यूक्लिक एसिड और सेल घनत्व के संबंध में निर्माण प्रति प्रोटीन की उम्मीद की उपज 4 चित्र में दिखाया गया है।

Representative Results

डोनट आकार के लिए ठोस रेशम स्पंज precut तंत्रिका ऊतक (2A चित्रा) जैसी एक बंटे वास्तुकला प्राप्त करने के लिए एक अद्वितीय और सरल विचार प्रतिनिधित्व करते हैं। एक छोटी मात्रा के भीतर बोने और उच्च घनत्व सेल के विकास की अनुमति के असाधारण उच्च सतह क्षेत्र में लगभग 500 माइक्रोन परिणामों के छेद के आकार के साथ पाड़ की अत्यधिक झरझरा संरचना (2x10 7 / एमएल) (चित्रा 2 बी)। इसके अतिरिक्त, पाड़ के उच्च porosity बढ़ाया समय तख्ते पर घने सेल संस्कृतियों के बेहतर व्यवहार्यता में जिसके परिणामस्वरूप पोषक तत्वों और कचरे के अप्रतिबंधित प्रसार के लिए अनुमति देता है। न्यूरॉन्स बोने पर तेजी से और समान पाड़ छिद्रों की सतह के लिए देते हैं।

सेल लगाव पूरा हो गया है और कोशिकाओं रेशम सब्सट्रेट पर equilibrated हैं, के बाद स्पंज पाड़ axonal नेटवर्क के गठन (चित्रा 3 के लिए एक 3 डी वातावरण प्रदान करने के लिए मुलायम कोलेजन मैट्रिक्स से भर जाता है (चित्रा 3 बी) के साथ मिल गया के रूप में मिश्रित नेटवर्क में जिसके परिणामस्वरूप छिद्रों की सतह पर एक्सटेंशन के रूप में विकसित कोलेजन मैट्रिक्स के अभाव में एक्सोन और सेल शरीर के compartmentalization संभव नहीं है। इसके विपरीत, कोलेजन जेल neuronal सेल निकायों रेशम पाड़ (चित्रा 3 सी) में जुड़े रहते हैं, जबकि 3 डी में व्यापक axonal परिणाम का समर्थन करता है जो एक meshwork प्रदान करता है। इस विकास पैटर्न सेल निकायों और शुद्ध axonal नेटवर्क मस्तिष्क में कॉर्टेक्स के ग्रे और सफेद पदार्थ जो जैसा दिखता है (चित्रा 3 डी), के compartmentalization की ओर जाता है।

इसके अलावा माइक्रोस्कोपी से, निर्माणों प्रयोग के पीछे के सवाल पर निर्भर करता है, अन्य तरीकों 18 की एक किस्म के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, निर्माणों से डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के अलगाव आसानी से हो वाणिज्यिक किट (चित्रा 4) का उपयोग किया जा सकता है। न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन पे की उपजआर निर्माण शुरू में रेशम मचानों पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करता है। अधिक कोशिकाओं वरीयता प्राप्त डीएनए, आरएनए और प्रोटीन की उपज अधिक है।

चित्र 1
रेशम स्पंज पाड़ तैयारी के लिए इस्तेमाल चित्रा 1. PTFE मोल्ड आयाम:।। 10 सेमी व्यास, 2 सेमी ऊंचाई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. 3 डी मस्तिष्क की तरह ऊतक मॉडल। (ए) झरझरा रेशम स्पंज पाड़। इससे पहले कोलेजन (हरा-जीवित कोशिकाओं, लाल मृत कोशिकाओं) embedding रेशम पाड़ पर बोने पर 1 दिन में न्यूरॉन्स की (बी) लाइव / मृत धुंधला हो जाना। सही पक्ष पर पैनल मा दिखानेलाल फ्रेम में कब्जा क्षेत्र के gnification। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Neuronal 3D मस्तिष्क की तरह ऊतक मॉडल में बंटे परिणाम (ए) पाड़ डिब्बों:। लाल सेल शरीर डिब्बे, ब्लू-axonal डिब्बे। (बी) कोलेजन एम्बेडिंग से पहले बोने पर 1 दिन में neuronal विकास पैटर्न। (सी)। सेल शरीर के डिब्बे में बोने पर दिन 7 में neuronal परिणाम। (डी) axonal डिब्बे में बोने पर दिन 7 में neuronal परिणाम। ग्रीन -। ΒIIITubulin इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा।

चित्रा 4
(ए) आरएनए और डीएनए, और पाड़ प्रति वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की राशि के संबंध में निर्माण प्रति (बी) प्रोटीन की चित्रा 4. उम्मीद उपज (एसडी ± n = 5)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Disclosures

इस वीडियो लेख के प्रकाशन कॉर्निंग द्वारा प्रायोजित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Na2CO3 Sigma-Aldrich 223530
LiBr Sigma-Aldrich 213225
MWCO 3500 dialysis cassettes  Thermo Fisher 66110
Heating plate Fisher Scientific Isotemp
Centrifuge 5804 R Eppendorf
Sieve Fisher Scientific No. 270, No. 35, No. 30
PTFE mold made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height
NaCl Sigma-Aldrich 71382
Biopsy Punch 5 mm World Precision Instrument 501909
Biopsy Punch 2 mm World Precision Instrument 501908
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-5MG final concentration 10 μg/ml, dissolved in water
PBS Sigma-Aldrich D1283-500ML
Trypsin Sigma-Aldrich T4049-500ML
DNase Roche 10104159001 final concentration 0.3%
Soybean protein Sigma-Aldrich T6522-100MG final concentration 1 mg/ml
Neurobasal medium Gibco 21103049 warm up to 37 °C before use
B27 supplement 50x Gibco 17504-044
Glutamax Gibco 35050-061
Penicilin Streptomycin Corning 30-002-CI
Collagen I, rat tail, 100 mg Corning 354236 final concentration 3 mg/ml
NaOH Sigma-Aldrich S2770 corrosive
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4170-10MG toxic
Fluorescein Diacetate Sigma-Aldrich F7378-5G
Olympus MVX10 Olympus
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 toxic, final concentration 4%
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-10G
anti-βIIITubulin antibody  Sigma-Aldrich T2200 rabbit 1:500
anti-rabbit Alexa-546 Molecular Probes A11010 goat 1:250
goat serum Sigma-Aldrich G9023-5ML
Leica SP2 confocal microscope Leica objective 20X
QIAshredder Qiagen 79654
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit Qiagen 80004
Ethyl alcohol, Pure Sigma-Aldrich E7023 
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich 63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific
BCA protein assay Thermo Scientific 23225
Plate reader Spectramax M2 Molecular Devices absorbance 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-type TedPella 1346

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Chwalek, K., Sood, D., Cantley, W. L., White, J. D., Tang-Schomer, M., Kaplan, D. L. Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue. J. Vis. Exp. (104), e52970, doi:10.3791/52970 (2015).

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