Introduction
Центральная нервная система (ЦНС) могут быть затронуты различными нарушениями, связанных с сосудистой, структурные, функциональные, инфекционный или дегенеративный. По оценкам 6,8 млн человек ежегодно умирают в результате неврологических расстройств, что представляет собой растущую социально-экономическое бремя во всем мире 1. Тем не менее, лишь немногие из нарушений есть доступные процедуры. Таким образом, существует острая необходимость в инновационных терапевтических стратегий для пациентов, страдающих от неврологических расстройств. К сожалению, многие ЦНС целевые терапевтические неудачу в ходе клинических испытаний, в частности, из-за использования неадекватных доклинических исследований моделей, которые не позволяют оценить острых и хронических воздействий с физиологически соответствующих функциональных показаний.
Несмотря на значительные усилия исследования в течение последних десятилетий, есть огромное количество неизвестно о структуре и функции ЦНС. Для того, чтобы получить больше знаний, модели животных часто намред модели патологических состояний, таких как травмы головного мозга травматического (TBI) или слабоумия, особенно в доклинических исследованиях. Тем не менее, животные существенно отличаются от людей как в анатомии ЦНС, а также в функции, экспрессии генов и метаболизма 2-4. С другой стороны, 2D культур в пробирке являются распространенным методом для исследования клеточной биологии и которые обычно используются для открытия новых лекарств. Однако культуры клеток 2D хватает сложность и физиологическое значение по сравнению с человеческим мозгом 5-7. Хотя не является заменой для низкой стоимости и простоты 2D исследований на клеточных культурах или сложности, предоставленной на животных моделях, 3D тканевой инженерии может генерировать усовершенствованные исследовательские модели, чтобы закрыть разрыв, который существует между 2D в пробирке и в естественных подходов. 3D тканевой инженерии обеспечивает более физиологически соответствующие экспериментальные условия, достигнутые 3D межклеточных взаимодействий и внеклеточных сигналов, предусмотренных биоматериала лесов. DespITE значительное доказательство за стоимости 3D культур, в настоящее время существует лишь несколько моделей ткани 3D ЦНС, таких как стволовые клетки получены Органоид культур 8-10, neurospheroids 11 и диспергируют гидрогеля культуры 12,13. Перспективные технические методы, включая многослойной литографии 14, и 3D-печати 15 были использованы для изучения легких, печени, почек и ткани. Тем не менее, есть отсутствие моделей 3D ЦНС, которые позволяют на секции роста нейронов, таких как имитируя корковой архитектуру и биологию. Отдельно рост нейритов из нейрональных клеток органов ранее продемонстрировано в 2D культур с помощью микрообработки 16,17 позволяя изучение трассировки аксонов тракта, притока кальция, сетевой архитектуры и деятельности. Эта идея вдохновила нас к разработке 3D поляризованного нервной ткани, где сотовые органы и аксонов массивы, расположенные в разных отсеках имитируя многоуровневую архитектуру мозга 18
Protocol
Протокол изоляции ткани мозга была одобрена Institutional Комитета по уходу и использованию животных Университета Тафтса по и соответствует Национальных Институтов Здоровья Руководства по уходу и использованию лабораторных животных (Institutional Animal Care и использования комитета B2011-45).
1. Подготовка Шелковый леса
- Подготовка раствора из шелка тутовый шелкопряд коконов, как описано ранее 19,20.
- Разрежьте каждый кокон на 8 равных частей с помощью ножниц. Используйте около 11 коконов в течение 5 г фрагментированных коконов. (15 мин)
- Подготовьте 2 л 0,02 М Na 2 CO 3 раствором и довести его до кипения, используя горячую плиту. (15 мин)
- Взвесьте 5 г фрагментированных коконов и варить их в Na 2 CO 3 раствором в течение 30 мин. Движение кипящей шелковые каждую пару минут с помощью шпателя. Этот шаг, называемый также де-гуммирование, очищает фиброин шелка из гидрофильных белков, sericins. (30 мин)
- Поместите влажный фиброин на чашку Петри и высушить экстракт фиброина в капот потока O / N.
- На следующий день взвешивают сухой массы фиброина и поместите фиброин в стеклянном стакане. (15 мин)
- Для того, чтобы растворить фиброин в 9,3 М растворе LiBr, рассчитать необходимый объем (в мл) LiBr путем умножения массы сухого фиброина на 4. Медленно залить LiBr раствора над шелковой фиброина и погружают все фиброина волокон с помощью шпателя. Накройте стакан для предотвращения испарения и поместить его при 60 ° С в течение 4 ч, чтобы позволить волокна, чтобы растворить. (15 мин)
- Использование шприца, собирать фиброина решение от стакана и загрузить его в MWCO 3500 диализных кассетах. Выполнение диализ против дистиллированной воды в течение 48 ч. Меняйте воду каждые два часа.
- Использование шприца, собирать фиброина решение откассеты в 50 мл конические пробирки и центрифугируют дважды при 9000 оборотах в минуту (~ 12700 х г) при 4 ° С в течение 20 мин. Налейте надосадочную жидкость в новую пробирку после каждого шага центрифугирования и отбросить гранул. (40 мин)
- Измерение концентрации фиброина путем оценки сухого веса. Залить 1 мл раствора шелка в весовой лодке. Сушат образца в печи при 60 ° С в течение 2 ч. Взвесить сухой фиброин шелка и расчета концентрации шелка фиброина раствора путем умножения полученного вес 100. ожидаемую концентрационную шелка раствора 6-9% (вес / объем).
- Регулировка концентрации шелка до 6% (вес / объем) разбавлением дистиллированной водой.
Остановка точка: жидкость шелк фиброина можно хранить при 4 ° С в течение одного месяца в закрытом контейнере.
- Подготовка пористых каркасов из шелка решения.
- Сито гранулированного NaCl, чтобы отделить гранулы размером 500-600 мкм, который будет использоваться на последующих этапах. Откажитесь от гранулс размером менее 500 мкм и выше 600 мкм. (15 мин)
- Налейте 30 мл 6% раствора шелка в политетрафторэтилена (ПТФЭ) формы (Рисунок 1). Аккуратно рассеивают 60 г просеянной NaCl над шелка. Нажмите контейнер, чтобы получить однородный слой соли. Инкубируют 48 ч при комнатной температуре для полимеризации шелк.
- Поместите строительных лесов, содержащего ПТФЭ форму в печи при 60 ° С в течение 1 часа, чтобы завершить полимеризацию и испарить оставшуюся жидкость.
- Поместите содержание ПТФЭ плесени в химический стакан, содержащий 2 л дистиллированной воды в течение 48 ч, чтобы выщелачивание соли. Менять воду 2-3 раза в день. Извлеките губку каркасов из форм, когда соль полностью вымывается точки остановки:. Губки могут быть сохранены погружают в воду при 4 ° С в закрытом контейнере, чтобы предотвратить каркасов от обезвоживания.
- Когда все будет готово, вырезать подмости с 5 мм диаметром биопсии удар. Нарезанные каркасов для достижения около 2 мм в высоту. ПуNCH из центра на эшафот с 2 мм биопсии удар диаметр (рис 2А). (1 час)
- Автоклав каркасов погружают в воду, чтобы стерилизовать их (мокрый цикл, 121 ° C, 20 минут) Остановка точку:. Губки могут быть сохранены погружают в воду при 4 ° С в закрытом контейнере, чтобы предотвратить каркасов от обезвоживания.
- Перед запланированной посева клеток, погружают каркасов в стерильной 0,1 мг / мл поли-D-лизином раствора (PDL). Инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С.
- Промыть 3 раза каркасы с фосфатным буферным раствором (PBS), чтобы удалить не связанный PDL. (30 мин)
2. Выделение Крыса корковых нейронов
- Проанализируйте кору из эмбриональных день 18 (E18) Спрэг Dawley крыс, как описано ранее Пачифичи и Перуцци 27 после утвержденного протокола животное получается. (2 ч)
- Инкубируют 10 кору в 5 мл 0,25% трипсина с 0,3% ДНКазы I (от поджелудочной железы быка) в течение 20 мин при 37 ° С.
- Инактивации трипсина, добавив равный объем 1 мг / мл соевого белка.
- Растирают кору, используя 10 мл пипетки Пастера от пипетки вверх и вниз 20 раз, пока один клеточной суспензии не генерируется. Будьте нежны и избежать образования пузырьков воздуха. (10 мин)
- Центрифуга клеточной суспензии в 127 мкг в течение 5 мин.
- Повторное приостановить осадок клеток в 10 мл культуральной среды (Neurobasal среднего, 1x B27 добавки, 1x Glutamax, 1% пенициллина / стрептомицина). Граф клеток. Ожидаемый концентрации клеток примерно 2х10 7 / мл. (20 мин)
3. Построить Ассамблею и культура
- Леса посев с клетками.
- Перемещение стерильные каркасов и все необходимые столовые приборы внутри капот культуре клеток. Использование стерильного пинцета поместить каркасы в клеточной культуре 96-луночного планшета выделении одного каркас на лунку. (10 мин)
- Погрузитесь каркасов в среде для культивирования клеток, чтобы уравновесить их до клеток семениIng. Инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С. (10 мин)
- Аспирируйте избыток среды от лесов.
- Применить 100 мкл клеточной суспензии / эшафот. (10 мин)
- Инкубируйте клетки при 37 ° CO / N, чтобы для прикрепления клеток к плахе.
- На следующее утро аспирации непривязанными клетки и применить 200 мкл / лунку свежую культуральную среду. (10 мин)
- Строительные леса встраивания с коллагеновой матрицы. (2 ч)
- Поместите 10x PBS, водой, 1 N NaOH и хвоста крысы коллагена на льду. Подготовка рабочего раствора коллагена в соответствии с инструкциями производителя. Поддержание на льду до конструкты клеток-затравку не готовы (до 1 ч).
- Удалить клеточные семенами шелковые конструкции из инкубатора и аспирата избыток среды.
- Использование стерильного пинцета передачи каркасов на пустые лунки на пластину погружают а каждый и каркас в 100 мкл 3 мг / мл раствора коллагена. Поместите планшета для культуры ткани обратнов инкубаторе в течение 30 мин, чтобы позволить полимеризации коллагена.
- Применить 100 мкл подогретого клеточной культуральной среды / лунку. Культура конструкты в течение одной недели замены среды ежедневно путем замены только половину объема среды.
4. Анализ микроскопии
- Live / мертвых окрашивания (1 час)
- Подготовка исходного раствора пропидийиодидом (PI) 1 мг / мл (1,5 мМ) в дистиллированной воде.
- Подготовка исходного раствора флуоресцеина диацетата (FDA) 2 мг / мл в ацетоне.
- Подготовить рабочий раствор, содержащий 10 мкМ PI и 0,15 мкМ FDA разбавленный в PBS. Предварительно нагреть раствор до 37 ° С на водяной бане.
- Вымойте клеток с подогретого PBS, чтобы удалить сывороточные эстеразы. Аспирируйте PBS.
- Нанесите подогретого рабочего раствора на клетки в течение 2 мин и промойте его PBS.
- Используйте эпифлуоресцентной микроскопа изображение клетки (ПИ экс λ = 490 нм, λ = EM 570 нм; FDA экс Л = 490 Нм, ет λ = 514 нм). Пятно остается стабильным в течение 40 мин. Длительное окрашивание может привести к неспецифической окрашивания в результате поглощения PI клетками и со-локализации ИП / FDA в клетках.
- Иммуноокрашивание
- В заданное время точки культуры фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида (PFA) в течение 30 мин при комнатной температуре. Из-за токсичности PFA дымит шаг крепления должны быть выполнены в химической вытяжкой.
- Промыть каркасов с 3x PBS точки остановки:. ПФА-фиксированные конструкции могут быть сохранены в PBS при 4 ° С в течение нескольких дней, прежде чем приступить дальнейших шагов.
- Инкубируйте каркасов в 0,2% Triton, 0,25% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS, содержащие первичное антитело O / N при 4 ° С.
- На следующий день отказаться от окрашивания раствор и промыть Леса 3 х 30 мин с PBS для удаления несвязанного первичного антитела.
- Инкубируйте образцы с вторичным антителом, разведенным в 0,2% Тритон, 0,25% BSA в PBS в течение 2ч при комнатной температуре.
- Удалить окрашивания раствор и промыть Леса 3 х 30 мин с PBS для удаления несвязанного вторичного антитела.
- Изображение каркасы, использующие конфокальной микроскопии с 20X цели, принимая 100 мкм Z-секции образца с 1 мкм шагом. Для визуализации тонких нейриты разрешение изображения должно быть минимальной 1,024 х 1,024 пикселей.
- РНК, ДНК и белка изоляция
Примечание: РНК, ДНК и выделение протеина, использу коммерческий AllPrep ДНК / РНК / белок Mini Kit в соответствии с инструкциями производителя.- Использование стерильного пинцета передачи каркасов из культурального планшета в 2 мл стерильной пробирке. Разместите один эшафот за трубку.
- Добавить 200 мкл буфера RLT в каждую пробирку.
- Лишить конструкцию фрагментируя его стерильными microscissors.
- Для гомогенизации нарушенную ткань, передавать содержимое тубы на ротационную колонку. Спин в течение 2 мин на полной скорости в микроцентрифуге.Лизат гомогенизируют, как она проходит через ротационную колонку.
- Собирают поток через и использовать его немедленно выделения РНК, ДНК и белка в соответствии с протоколом производителя.
- Количественно выход нуклеиновых кислот любой другой совместимый метод (например, NanoDrop).
- Количественная выход белка, используя BCA анализа белка в соответствии с инструкциями изготовителя. Измерьте результаты анализа с помощью планшетного на длине волны 562 нм.
Примечание: Ожидаемый выход нуклеиновых кислот и белка в конструкции по отношению к плотности клеток, показан на рисунке 4.
Representative Results
Твердые шелковые губки нарезанные по форме пончика, представляют собой уникальную и простую идею, чтобы достичь разобщенным архитектуру, напоминающую нервной ткани (рис 2а). Высоко пористая структура помост с размером пор 500 мкм приводит к исключительно высокой площадью поверхности, позволяющих посев и рост высокой плотности клеток в малом объеме (2x10 7 / мл) (2В). Кроме того, высокая пористость эшафот позволяет для неограниченного распространения питательных веществ и отходов, образующихся в превосходной жизнеспособности плотных клеточных культур в течение длительного времени кадров. После посева нейроны быстро и равномерно прикрепить к поверхности каркасных порах.
После прикрепления клеток является полным и клетки уравновешивали в шелковой подложке, губка каркас заполняется мягкой коллагеновой матрицы, чтобы обеспечить среду для 3D аксонов формирования сети (рис 3 (фигура 3В). В противоположность этому, коллагеновый гель обеспечивает сетчатую структуру, которая поддерживает обширный аксонный отросток в 3D, а нейронные клеточные тела остаются прикрепленными к шелковой помост (рис 3C). Эта модель роста приводит к разобщенности клеток органов и чистых аксонов сетей (рис 3D), который напоминает серого и белого вещества коры головного мозга.
Помимо микроскопии, конструкции могут быть оценены с различными другими методами 18, в зависимости от вопроса за эксперимента. Например, выделение ДНК, РНК и белка из конструкций может быть легко выполнена с использованием коммерческих наборов (рисунок 4). Выход нуклеиновых кислот и белков PEг конструкция зависит от количества клеток изначально посеянных на шелковых каркасов. Чем больше клеток высевали тем выше выход ДНК, РНК и белка.
Рисунок 1. ПТФЭ формы используются для приготовления шелк губка лесов Размеры:.. 10 см в диаметре, 2 см высота Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. 3D мозга, как модель ткани. (А) пористого шелк губка эшафот. (Б) Live / мертвых окрашивания нейронов в 1 день на посев на шелковой эшафот, прежде чем коллаген встраивания (зеленый-живых клеток, красных мертвые клетки). Панели на правой стороне показать маgnification площади захваченного в красных рамках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. нейронов разобщенным вырост в 3D-модели мозга, как ткани (A) Леса отсеков:. Кузовом купе красных клеток, Blue-купе аксонов. (Б) нейронов модель роста в 1-й день после посева до коллагена вложения. (С). Нейронов вырост на 7 день после посева в теле клетки отсека. (D) нейронов вырост на 7 день после посева в аксонов отсеке. Зеленый -. ΒIIITubulin Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этогофигура.
Рисунок 4. Ожидаемые выход (A) РНК и ДНК, и (б) белка в конструкции по отношению к количеству клеток, посеянных на эшафот (± SD, п = 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,
Disclosures
Публикация этого видео-статьи авторами Corning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223530 | |
| LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | |
| MWCO 3500 dialysis cassettes | Thermo Fisher | 66110 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | ||
| Sieve | Fisher Scientific | No. 270, No. 35, No. 30 | |
| PTFE mold | made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71382 | |
| Biopsy Punch 5 mm | World Precision Instrument | 501909 | |
| Biopsy Punch 2 mm | World Precision Instrument | 501908 | |
| poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | final concentration 10 μg/ml, dissolved in water |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1283-500ML | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| DNase | Roche | 10104159001 | final concentration 0.3% |
| Soybean protein | Sigma-Aldrich | T6522-100MG | final concentration 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | warm up to 37 °C before use |
| B27 supplement 50x | Gibco | 17504-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Penicilin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Collagen I, rat tail, 100 mg | Corning | 354236 | final concentration 3 mg/ml |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | corrosive |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170-10MG | toxic |
| Fluorescein Diacetate | Sigma-Aldrich | F7378-5G | |
| Olympus MVX10 | Olympus | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | toxic, final concentration 4% |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | |
| anti-βIIITubulin antibody | Sigma-Aldrich | T2200 | rabbit 1:500 |
| anti-rabbit Alexa-546 | Molecular Probes | A11010 | goat 1:250 |
| goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-5ML | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica | objective 20X | |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | |
| AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit | Qiagen | 80004 | |
| Ethyl alcohol, Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23225 | |
| Plate reader Spectramax M2 | Molecular Devices | absorbance 562 nm | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | TedPella | 1346 |
References
- Dua, T., Janca, A., Kale, R., Montero, F., Muscetta, A., Peden, M. Chapter 1, Public health principles and neurological disorders. Neurological Disorders. , World Health Organization. Geneva. (2005).
- Ohtsuki, S., Hirayama, M., Ito, S., Uchida, Y., Tachikawa, M., Teresaki, T. Quantitative targeted proteomics for understanding the blood-brain barrier: towards pharmacoproteomics. Expert. Rev. Proteomic. 11 (3), 303-313 (2014).
- Hyder, F., Rothman, D. L., Bennett, M. R. Cortical energy demands of signaling and nonsignaling components in brain are conserved across mammalian species and activity levels. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (9), 3549-3554 (2013).
- Wesseling, H., et al. A combined metabonomic and proteomic approach identifies frontal cortex changes in a chronic phencyclidine rat model in relation to human schizophrenia brain pathology. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2532-2544 (2013).
- Fawcett, J. W., Housden, E., Smith-Thomas, L., Meyer, R. L. The growth of axons in three-dimensional astrocyte cultures. Dev Biol. 135 (2), 449-458 (1989).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
- East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
- Dubois-Dauphin, M. L., Toni, N., Julien, S. D., Charvet, I., Sundstrom, L. E., Stoppini, L. The long-term survival of in vitro engineered nervous tissue derived from the specific neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (27), 7032-7042 (2010).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Hogberg, H. T., et al. Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions. Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S4 (2013).
- Kato-Negishi, M., Morimoto, Y., Onoe, H., Takeuchi, S. Millimeter-sized neural building blocks for 3D heterogeneous neural network assembly. Adv Healthc Mater. 2 (12), 1564-1570 (2013).
- Watanabe, K., Nakamura, M., Okano, H., Toyama, Y. Establishment of three-dimensional culture of neural stem/progenitor cells in collagen type-1 gel. Restor Neurol Neurosci. 25 (2), 109-117 (2007).
- Aurand, E. R., Wagner, J. L., Shandas, R., Bjugstad, K. B. Hydrogel formulation determines cell fate of fetal and adult neural progenitor cells. Stem Cell Res. 12 (1), 11-23 (2014).
- Gurkan, U. A., et al. et al..Simple precision creation of digitally specified, spatially heterogeneous, engineered tissue architectures. Adv Mater. 25 (8), 1192-1198 (2013).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21 (4), 157-161 (2003).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature. 2 (8), 599-605 (2005).
- Tang-Schomer, M. D., Davies, P., Graziano, D., Thurber, A. E., Kaplan, D. L. Neural circuits with long-distance axon tracts for determining functional connectivity. J Neurosci Methods. 222, 82-90 (2014).
- Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (38), 13811-13816 (2014).
- Rockwood, D. N., Preda, R. C., Yücel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat Protoc. 6, 1612-1631 (2011).
- Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M. D., Kaplan, D. L., Rosenblatt, M. I. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646 (2012).
- Maddah, M., Grimson, W. E., Warfield, S. K., Wells, W. M. A unified framework for clustering and quantitative analysis of white matter fiber tracts. Med Image Anal. 12 (2), 191-202 (2008).
- Vepari, C., Kaplan, D. L. Silk as a biomaterial. Prog Polym Sci. 32 (8-9), 8-9 (2007).
- Yao, D., et al. Salt-leached silk scaffolds with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13 (11), 3723-3729 (2012).
- Kim, U. J., Park, J., Kim, H. J., Wada, M., Kaplan, D. L. Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin. Biomaterials. 26 (15), 2775-2785 (2005).
- Gil, E. S., Mandal, B. B., Park, S. H., Marchant, J. K., Omentetto, F. G., Kaplan, D. L. Helicoidal multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue engineering. Biomaterials. 31 (34), 8953-8963 (2010).
- Hopkins, A. M., et al. Silk hydrogels as soft substrates for neural tissue engineering. Adv Funct Mater. 23 (41), 5140-5149 (2013).
- Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: A quick protocol. Vis. Exp. (63), e3965 (2012).
