Introduction
Впервые представленная в 2006 году, ДНК-оригами использует самоорганизации природа ДНК-олигонуклеотидов для получения DESIGNABLE и высоко упорядоченные наноструктуры. 1 множество структур сообщалось, начиная от смайликов в запертом 3-мерные ящики. 2 ДНК-оригами можно функционализирован с различными биомолекул и наноструктур, что приводит к научно-исследовательских приложений в наноэлектронике, медицины и квантовых вычислений. 3 Тем не менее, анализ и многие будущие приложения не зависит только от структурного дизайна, но и на адгезии оригами ДНК наноструктур на поверхности. Методы, описанные в этой рукописи относятся к подготовке образцов ДНК оригами на двух типах субстратов: слюды и функционализованного оксида кремния.
Слюда является субстратом выбора для исследований ДНК-оригами, потому что это атомарно плоской, с высоты слоя 0,37 нм ± 0,02 нм. 4 Также EASIly очистить, делая пробоподготовки и атомно-силовой микроскопии (АСМ) исследования проста. Мусковита содержит высокую плотность калия в каждой плоскости спайности, но эти ионы диффундируют от поверхности слюды, когда в воде. Для посредником связывание ДНК-оригами в подложке из слюды, Mg 2+ используется для обратного отрицательный заряд слюды и электростатическим связать фосфат ДНК костяк подложки (рис 1А). 5 Смеси отожженной ДНК в присутствии большой эксцессы основных нитей дать высокий охват и хорошие изображения на слюду, потому что сцепление ДНК-оригами, чтобы 2+ -завершённый поверхности Mg гораздо сильнее, чем адгезия одноцепочечных олигонуклеотидов (штапельные прядей). Другие положительно заряженные ионы, в том числе Ni 2+ и Со 2+ может быть использован для управления адгезию ДНК на слюде. 6,7 Изменение концентрации одновалентных и двухвалентных катионов в растворе может опосредовать адгезивСион и поверхностной диффузии ставки оригами ДНК. 8 Однако, протокол для подготовки подложки из слюды и хранение и промывка оригами часто явно не описанные в опубликованных рукописей. 9 Без четкого протокола, воспроизводимые результаты могут быть трудно получить.
Слюда является диэлектриком, поэтому она не подходит в качестве субстрата для некоторых применений в наноэлектроники. Кремний пассивируются тонким родной оксида имеет желательные электронные свойства, в том числе совместимость с предварительного бесплатный полупроводниковый металл-оксид (CMOS) обработки, чтобы создать входных / выходных структур и топографические характеристики. Кремниевые пластины, хранящиеся в воздухе пассивируются либо с толщиной термического оксида или тонкой оксидной пленки родной, относительно грязный, с увеличенным количеством частиц. Оксид кремния имеет значительно меньшую плотность поверхностного заряда, чем слюды, и плотность заряда сильно зависит от подготовки оксида и истории. В концентрации ионов магния о воспитанииве 150 мм, хорошие покрытия (до 4 / мкм 2) прямоугольной оригами ДНК может быть достигнуто на кислорода в плазме лечение кремниевых подложках; Однако, эта концентрация и охват может изменяться в зависимости от размера и конструкции наноструктур используется. 10 альтернативный протокол для настройки поверхностный заряд, чтобы прикрепить катионный, собранного монослой 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES) (Фигура 1В) в оксид. Первичный амин на APTES можно протонированные при значениях рН ниже 9, изменяя заряд и гидрофобность субстрата. 11 Для полного монослоя APTES быть успешно хранение, кремний должен быть соответствующим образом очищен с помощью Радио корпорейшн оф Америка (RCA) протоколы , Эти протоколы включают процедуры в гидроксида аммония и растворы пероксида водорода (RCA1) для удаления органических остатков и примесей частиц. Короче травления в водном растворе плавиковой кислоты удаляет родной слой оксида вместе слюбые ионных примесей, которые прилипают к оксиду. Наконец, образцы подвергают воздействию соляной кислоты и раствора перекиси водорода (RCA2), чтобы удалить металл и ионных примесей и образуют тонкий однородный слой оксида. 12 Большинство чистых помещений обозначили капюшоны для протоколов очистки CMOS, со строгими правилами о том, что может быть использовано в этих областях. Общая проблема приходит в форме ионов, таких как натрий, которые могут нарушить электронные свойства КМОП структур путем создания midbandgap ловушки. 13 Ионы широко используется в ДНК-оригами подготовки и нанесения буферов может загрязнить ванны CMOS и вызвать проблемы для других исследователей, использующих чистый номер. По этой причине, наша группа использует «грязные» КМОП уборка скамейки расположены специально для малых выборок, используемых для ДНК-оригами исследований. Этот процесс является хорошей альтернативой традиционному чистых помещений установки и могут быть пригодны для лабораторий, которые не имеют доступа к чистой комнате CMOS скамейке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Эксперимент Планирование и подготовка материала
- Определить конструкцию, концентрацию и функциональность оригами ДНК, который будет использован в экспериментах. 14-16 Здесь мы используем конструкцию ДНК Origami прямоугольник, полученного в 1x TAE / Mg 2+ раствор (40 мМ Трис-основание, 20 мМ уксусной кислоты, 2 мМ ЭДТА и 12 мМ ацетат магния, рН 8,0). 17
- Автоклав все советы, трубки и контейнеров, которые будут использоваться. Эти материалы должны быть все автоклав совместимы.
- Подготовьте запас стерильной воды для полоскания. Заполните стерильной банку около 500 мл 18 МОм х см воды, место на плите, кипятить в течение 5 мин с шапку, и взять банку с конфорки и дайте остыть под крышкой на таре, но не затягивается , Хранить в холодильнике и готовить новое предложение каждый месяц или по мере необходимости.
2. Подготовка слюде
- Cut субстратов соответствующего размера (1 см х 1 см квадраты) с ножницами. Слюда является тонким и хрупким. Кроме того, покупка слюду в форме диска, который не требует резки.
- Клив слюды, используя двухсторонний скотч. Слюда состоит из слоев, разделенных минералов интеркалирования ионов, каждый слой может быть снята, когда придерживались двухсторонней ленты. 18
- Поместите слюды квадратов на двухсторонней ленты еще в ленте диспенсер, убедившись, что он придерживался твердо на ленту. Осторожно сдвиньте пинцет между слюды и ленты, самый верхний слой, будут удалены и остаются на ленте. Сразу после удаления, слюда квадрат будет иметь свой чистый стороной вниз. Убедитесь, чтобы перевернуть слюду пред хранения в контейнере.
- Повторите это три-четыре раза, чтобы обеспечить полное удаление верхнего слоя наиболее адекватным и очистки.
- В качестве альтернативы, придерживаться слюду в контейнер или столешницей с куском двухсторонней ленты и использовать вторую часть в ейотметьте, чтобы и снимите верхний слой слюды наиболее. Слюды будет надлежащим образом очищены в обоих случаях, хотя альтернативный метод делает хранение ДНК и промывки и сушки образца затруднено из-за второй адгезии к подложке.
3. Внесение ДНК оригами на Mica
- Вкратце, смешать пузырёк оригами ДНК с использованием вихревого смесителя, чтобы гарантировать даже разгон наноструктур в растворе.
- Внесите 4 мкл раствора на слюду, гарантируя, что наконечник пипетки не касался подложки. Оставьте оригами ДНК на слюду течение 10 мин для обеспечения адекватного охвата. Время осаждения будет варьироваться в зависимости от концентрации ДНК-оригами, используемой, а также желаемого покрытия (фиг.2 и 3).
- Промыть ДНК-оригами решение выключить слюды подложки с использованием 100 мкл стерильной воды над раковиной или другой жидкости емкость. Возьмите слюду пинцетом. Внесите воды наПодложка, с потоком капли в направлении кончика пинцета. Встряхнуть слюду с острыми вниз движения, чтобы удалить лишнюю воду. Держите в вертикальном положении пинцет, чтобы вода будет течь в сторону пинцетом, чтобы избежать загрязнения образца.
- Высушите подложку с непрерывным потоком азота (N 2) в течение 1 мин. Убедитесь, что любой избыток воды удаляется. Повторите промыть дополнительных 100 мкл стерильной воды. Сушат подложки с N 2 еще в течение 3 мин. Полностью сухой субстрат необходимо для успешного атомно-силовой микроскопии (АСМ) анализ (рисунок 4).
- Анализ субстрата, используя AFM или магазин в закрытом контейнере.
4. КМОП / Silicon Набор для чистки планом
- ВНИМАНИЕ: При использовании CMOS настройки, используйте средства индивидуальной защиты на все времена. Реагенты включают сильные кислоты, сильные основания, плавиковой кислоты (HF), и сильные окислительные агенты, которые чап реагируют с растворителями отходов, если реагенты не правильно утилизировать. Придерживайтесь следующих мер предосторожности:
- Дом КМОП скамейке в химической капот с каких-либо других процессов или наборах.
- Носите нитриловые перчатки, лабораторный халат, защитные очки, крупные промышленные нитриловые перчатки, фартук разлива, и лицо защитный во все времена, когда с помощью CMOS скамейки.
- Используйте пластиковые ванны как вторичного сдерживания, когда растворы готовят.
- Использование инертного фторированного полимера мерный стакан для обработки концентрированной HF.
- Сделайте кальция глюконат мазь доступны как первой помощи для любого воздействия на кожу.
- Только позвольте правильно обученный персонал для выполнения процесса.
- Всегда проверяйте другой член лаборатории присутствует в случае чрезвычайной ситуации.
- Держите информацию MSDS для всех химических веществ, в районе капота.
- Будьте знакомы с учреждением или химического воздействия разливов и политики компании.
Примечание: ВЧ легко проникает кожуи поглотитель кальция, влияя кости и повреждения нервов, если происходит воздействие. Кожные экспозиции до нескольких миллилитров концентрированной плавиковой кислоты может быть опасным и даже смертельным. Установите необходимые меры предосторожности для обеспечения воздействия не происходит.
- Выполните RCA1 и RCA2 в отдельных 250 мл стеклянные стаканы на отдельных плитой. Каждый стакан должен содержать мешалку. Контролировать температуру раствора с использованием термометров зажатые так мешалку не ударить в шарик. Обложка стаканы, используя часового стекла, чтобы уменьшить последствия испарения.
- RCA1 Подготовка
- Поместите 50 мл 18 МОм х см воды в назначенный RCA1 стакан с использованием мерный стакан.
- Добавить 15 мл концентрированного гидроксида аммония (NH 4 OH) в химическом стакане. Промыть мерный стакан с 25 мл воды и добавить промывочной воды в химическом стакане RCA1.
- Включите тепла и мешалкой на плитке и принести RCA1 ванну 70 ° C. Добавьте 15 мл 30% перекиси водорода (H 2 O 2) в RCA1 стакан. Используйте RCA1 решение в течение 1 ч после H 2 O 2 была добавлена. Ванна может быть использован несколько раз в течение трех дней, если 15 мл перекиси добавляют в ванну каждый раз.
- Промойте мерный стакан тщательно промыть водой и выбросить полоскание в соответствующем бутылки RCA1 отходов.
- RCA2 Подготовка
- Добавить 70 мл 18 МОм х см воды в назначенный RCA2 стакан с использованием тщательно промыть мерного стаканчика.
- Добавить 15 мл концентрированной соляной кислоты (HCl). Промойте измерительную мензурку с 20 мл воды и добавить его в RCA2 стакан.
- Увеличьте огонь и перемешать скорость конфорки, пока раствор не достигнет 70 ° C.
- Добавьте 15 мл 30% -ной H 2 O 2. Как RCA1 ванной, использовать это решение в течение 1 ч с момента, когда Н 2 О 2 добавляют; Кроме того, в ваннеможет быть повторно несколько раз в течение промежутка трех дней, если 15 мл H 2 O 2 добавляют перед каждым использованием.
- ВЧ Подготовка Решение
- Поместите 50 мл воды, в инертном фторсодержащего полимера стакан.
- Мера 4 мл концентрированной фтористоводородной кислоты (49%) в пластиковом мерный стакан и добавить его в инертной фторированной полимерной стакан.
- Промыть пластика мерного стаканчика в общей сложности 50 мл воды, добавлением промывочной воды в химическом стакане HF. Промойте мерный стакан тщательно промыть водой и выбросить стирок в назначенный контейнер ВЧ отходов.
5. Подготовка и очистка кремниевой подложке
- Резка кремниевых пластин на чипы
- Определить перпендикулярно и параллельно направлений решетки на плоской полированной поверхности кремниевой пластины. Эти направления используются, чтобы помочь сделать расщепляющие квадратов легче. Следующие инструкции относятся к cleavING кремний <110> и не могут быть пригодны для других кристаллических ориентаций.
- Поместите кремниевая пластина полированный стороной вверх на мягкой поверхности, например, салфеткой. Использование алмазных писец ручку, осторожно ник в нижней части пластины вдоль основной плоской грани. Поместите небольшое провод, например, скрепки, ниже ника и мягко надавливать на пластины, поместив пальцы или пинцетом по обе стороны от ника и толкает вниз. Делать это отделить пластины на две половины вдоль линии кристаллической решетки в естественном направлении скола.
- С другой салфеткой, с карандашом и линейкой, отмерить нужную ширину квадратов путем маркировки точек на верхней и нижней части прокладки. Соедините эти точки прямыми линиями. Это будет служить в качестве ориентира для еще квадратные формы.
- Поместите один из пластины половины краем вперед между измеренных линий на салфетке покраснел против линии и повторить в шаге 5.1.2 недавно нарушена перпендикулярно PiecТеперь ES должно быть ширина расщепленных квадратов. Поверните пластину горизонтально на салфетке. Поместите его между перпендикулярными линиями и повторить процесс на этапе 5.1.2.
- Храните Свежесколотая вафельные чипсы в чистом флаконе, заполненной дистиллированной водой, чтобы предотвратить царапины. Кремниевые чипы могут быть сохранены на неопределенный срок, но должны быть очищены перед началом экспериментов.
- КМОП очистки кремния
- Когда RCA1 решение достигла нужной температуры, погрузить восьми до десяти 1 см х 1 см кремниевых чипов в растворе с использованием инертного фторированного полимера корзины с диаметром 2 ". Пузырьки кислорода образуют на чипах и стакане стен. Если нет пузырьков происходит, H 2 O 2 разлагается. Оставьте фишки в растворе 10 до 20 мин, перемешивая корзину вверх и вниз каждые несколько минут, чтобы держать чипы от слипания.
- Поднимите корзину, содержащую кремниевых чипов и отстойник. Перемещение корзины над ТО стакан отходов и тщательно промыть 18 МОм х см воды. Погрузитесь в промывной стакан и покачиваться вверх и вниз в течение 20 сек. Слейте корзину и тщательно промыть водой в течение стакан отходов. Слейте стакан отходов в назначенном RCA1 бутылки отходов и залейте водой.
- После очистки RCA1 завершения, поместите корзину в 1:50 HF стакан от 10 до 20 сек. Используйте нежный движение вверх и вниз, чтобы смешать фишки и HF. Поднимите замочить ведро, чтобы позволить ВЧ полностью стечь прочь.
Примечание: Поверхности чип должен быть гидрофобным; вода не смачивает чип, но вместо этого образуют капельки с большими углами контакта. Это указывает на то, что оксид кремния был вытравливают и ключ будет прекращено Si-H связей. - Поместите стирки стакан и промыть стакан в пластиковой тубе, переместите корзинку на полоскания стакан и промыть 18 МОм х см воды. Погрузите корзину в промывной стакан и перемешивать в течение 20 сек.
- Заполните вторую утечку и Rinsе цикл с 18 МОм х см воды. Вывести воды для стирки в химический стакан и полоскания пополнить стирки стакан с водой. Залить все отходы в назначенный пластиковой бутылки ВЧ отходов.
- Когда RCA2 решение достигла нужной температуры, погрузить фишки кремния в растворах с использованием корзины. Оставить в растворе в течение 10 до 20 мин. Чип теперь будет гидрофильным за счет роста тонкой (1-2 нм) оксидной пленки.
- Удалить после соответствующего периода времени, и выполните те же полоскания процедуры, как для RCA1. Утилизировать отходы в соответствующий контейнер RCA2 отходов. Удалите каждую микросхему из корзины с пластиковых пинцеты, промыть водой и высушите азотом.
- Чипы хранить в пластиковой коробке или пластин в флакон 18 МОм х см воды. Кремния останется чистой при хранении в воде в течение приблизительно трех дней после очистки. Убедитесь, что рабочая зона правильно чистить и внешний вид перчаток CMOS были вымыты. Оставьте CMOS перчатки в капот, чтобы высохнуть.
6. Внесение ДНК оригами на APTES-функционализованного кремния
- Самоорганизующихся монослоя Формирование на кремнии
- Теплые APTES в РТ до открытия. Если бутылка слишком холодно, может образоваться конденсат, в результате чего гидролиз APTES во время хранения. Добавить 1980 мкл 18 МОм х см воды и 20 мкл APTES в чистом сцинтилляционный флакон и водоворот перемешать. Использовать немедленно это решение.
- Поставьте очистить кремниевый чип отражающий стороной вверх в сцинтилляционный флакон, крышка его, и оставьте на 20 мин. Удалить чип пинцетом и промыть 200 мкл воды и сухой в течение 1 мин с потоком N 2.
- Внесение ДНК-оригами на APTES функционализированных кремния
Примечание: Шаги для нанесения ДНК-оригами на функционализированного силикона аналогичны для нанесения на слюду.- Кратко перемешать ДНК-оригами флакона и пипетки 4 мкл растворана кремниевой подложке. При необходимости увеличить объем ДНК-оригами раствора, используемого, чтобы покрыть всю подложку, как функционализирован кремния является более гидрофобным, чем подложке из слюды. Используйте покровным стеклом нажать решение осаждения вниз и предотвратить испарение во время длительных отложений.
- Пусть решение стоять на сумму времени, необходимого для используемой концентрации и освещения желаемого (см 2 и 3 эффекта времени и концентрации на поверхности покрытия). Промыть субстрата 100 мкл стерильной 18 МОм х см воды и насухо N 2 в течение 1 мин.
- Повторите промыванием дополнительными 100 мкл стерильной воды и высушить подложку с N 2 в течение 3 мин.
- Храните образец в чистую емкость до дальнейшие эксперименты или изображений не может быть выполнена. Образцы начинают показывать накопление частиц примерно через одну-две недели хранения в зависимости от того муч они обрабатываются.
7. АСМ изображений и анализа изображений ДНК оригами образцов
- Используйте AFM в режим Нажатие на воздухе для целей визуализации. Нажатие режим обеспечивает минимальное усилие будет применяться к хрупким наноструктур, по сравнению с контактном режиме.
Примечание: Параметры обработки изображений будут зависеть от инструмента. Все изображения, представленные были получены с помощью многомодового Наноскоп IIIa. - Выберите зонды АСМ для бесконтактного / режима в воздухе разговоров, с золотым отражающим покрытием, резонансная частота (номинальная) из ~ 300 кГц, заставить постоянная 40 радиуса Н / м, а вершины <10 нм.
- Обработка и анализ АСМ изображения, используя программное обеспечение для анализа Наноскоп. Выполнение вычислений с помощью покрытия ImageJ. 19
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Две переменные диктовать покрытие оригами ДНК на подложке: концентрация раствора и время облучения. Адсорбционные характеристики оригами ДНК на слюде и APTES функционализированный оксид кремния были ранее. 13 Соотношение между концентрацией оригами ДНК в растворе для осаждения и конечных покрытий на слюде суммированы в таблице 1 и на рисунке 2, показывающий возрастающие концентрации результаты к увеличению охвата. Зависимость от времени связываться видно на рисунке 3. Покрытия поверхности ранее учился в количественном связывания поведение оригами ДНК на слюду и модифицированные поверхности оксида кремния. ДНК-оригами в 12 мМ магния в 1x TAE буфер имеет 83,3% ± 3,1% охват на слюду после времени поглощения 30 мин на поверхности. Максимальный охват оксида кремния, модифицированный APTES ЗРК наблюдается через 60 мин, что меньше, чем максимальное покрытие на слюде.необходимо больше времени осаждения, если высокий охват поверхности требуется на APTES функционализованных оксид кремния.
Есть несколько переменных, которые могут вызвать плохую подготовку образца. Самый трудный недостаточно полоскание и сушку. Если буферный раствор не ополаскивают образом, крупные агрегаты образуют на подложке (фиг.4А). наблюдаются "ДНК оригами острова», когда наноструктуры придерживаться пятнами солей магния на поверхности (рис 4В). Наконец, с образцами высокой покрытия, можно иметь избыточные компоненты буферных перемычек между индивидуальной ДНК-оригами (рис 4C), что делает его трудно отличить наноструктур с помощью АСМ. Эти результаты можно избежать, после тщательного промывания и сушки протокол для обоих слюды и кремниевых подложках.
Формирование APTES фильмов на подложках оксида кремния может представлять проблемы. Кремниевые пластины имеютШероховатый слой оксида кремния, которые должны быть удалены и гладкой, тонкий слой оксида кремния реформировать, прежде чем он может быть функционализированы. Надлежащим образом очищены кремниевая подложка показано на фиг.5А. Во время очистки из кремниевой пластины, важно, чтобы убедиться, что количество кремниевых чипов не слишком высока, насколько это возможно для двух чипов, чтобы застревать друг с другом, блокируя воздействие реагентов (фиг.5В). Если очистить кремния был сохранен в 18 МОм х см воды в течение более чем одной недели, загрязняющее слой реформировать и recleaning необходимо. Питания APTES также может вызвать проблемы с пробоподготовки. APTES легко полимеризуется в результате гидролиза, который является основой для формирования монослоя. 20 Степень этой полимеризации зависит от концентрации воды, что APTES подвергается. Со временем и в процессе использования, это возможно для воды конденсируются внутри бутылки APTES и загрязнятьпоставка. В результате полимеризации образуются большие агрегаты, которые прилипают к субстрату (5С). Увеличилась шероховатости и наличие агрегатов делает идентификации наноструктур ДНК с помощью АСМ трудно. Это хорошая практика, чтобы хранить бутылку APTES в полиэтиленовом пакете в холодильнике, и пусть APTES бутылка нагреться до комнатной температуры перед открытием, чтобы избежать конденсации.
Рисунок 1. Схематическое сравнение связывания механизм оригами ДНК по (A) слюды и (В) APTES функционализированный диоксид кремния (не в масштабе). Связывание с слюды опосредуется присутствии двухвалентных катионов, как правило, Mg 2+. Монослой протонированной концевыми аминогруппами 3-аминопропилтриэтоксисилан используется для улучшения адгезии на подложку из оксида кремния.
<IMG Alt = "Рисунок 2" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 52972 / 52972fig2highres.jpg" ширина = "700" />
Рисунок 2. АСМ изображения, иллюстрирующие переменной покрытие через 10 мин отложений (а) 2 нМ, (б) 4 нМ, и (С) 6 нМ на слюде. Шкала высоты для всех изображений 5 нм.
Рисунок 3. Тенденции в охвате поверхности в течение 2 нМ ДНК-оригами в 1x TAE буфер, 12 мМ Mg 2+. MICA = фиолетовый линии и круг маркеры, APTES = желтые линии и треугольника маркеры. N = 3 в определении стандартной ошибки.
Рисунок 4. Плохо полоскание и сушка может вызвать (A) агрегацию решение на подложке, (б) ДНК-оригами острова, и (С) моста наноструктур наОбразцы с высоким уровнем охвата в присутствии избыточных буферных солей. шкала высот для всех изображений 5 нм.
Рисунок 5. () Чистый кремний должен RMS шероховатости менее 0,5 Å в течение 1 квадратный микрон. Полная APTES SAM осаждается на хорошем родном оксида должны иметь шероховатость RMS менее 1 Å в течение 1 квадратный микрон. (Б) APTES пленку, сформированную на полностью очищенную оксида кремния с RMS шероховатости 2,29 нм в течение 1 квадратный микрон. . Обратите внимание на пробелы и шероховатости пленки APTES (С) APTES поверхность, образованную из образца APTES загрязненных со сгущенным отходов; гидролиз в APTES бутылок форм крупные частицы. Шкала высот для всех изображений 5 нм.
Таблица 1. Измерения покрытия процентов за подложки из слюды с varyinг ДНК концентрации оригами решение. Часовой пояс осаждения 10 мин.
| ДНК оригами Решение | Покрытие на% слюде |
| 2 нМ | 8,49 ± 2,67 (n = 5) |
| 4 нМ | 55.89 ± 5,65 (n = 3) |
| 6 нМ | 77.44 ± 1,89 (n = 4) |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько шагов, которые должны быть подчеркнул достичь последовательных и идеальные результаты. Для образцов слюды, следующих строгий и тщательный промывание и сушка режим, как в шагах 3.3 и 3.4, будет гарантировать, что высокое качество изображения индивидуальной ДНК-оригами могут быть достигнуты с помощью АСМ без различных проблем, изложенных в разделе Результаты представитель. Первостепенное значение для образцов кремния является чистота подложки. После процедуры очистки, описанные в шаге 5.2 тщательно и скрупулезно будет гарантировать, что необходимо тщательно очистить поверхность оксида кремния будет достигнута. Кроме того, контроль качества и эффективности химических веществ, таких как перекись водорода, плавиковой кислоты, и APTES, будет гарантировать, что процедура проходит гладко.
Методы, описанные здесь, не ограничены только водных растворов APTES. Смешанный монослой APTES и хлорида trimethylaminopropyltrimethoxysilyl (ТЦМВ) может быть намиред настроиться кремния поверхностный заряд и способствуют адгезии переменной ДНК-оригами. 11 ТМАС содержит постоянно заряженный терминала четвертичный амин -N (СН 3) 3 +, по сравнению с рН зависимым заряда на APTES. Потому что окружающая среда решение не влияет на состояние протонирования или заряд TMAC, варьируя концентрацию раствора в ТЦМВ можете настроить поверхностного заряда смешанного монослоя и влиять на взаимодействие между подложкой и оригами ДНК. Оптимальное Origami ДНК-связывающий наблюдалось монослоев, имеющих поверхностный заряд 0,75-1,5 зарядов / нм 2, что соответствует ЗРК содержащий 100% до 40% концентрации ТМАС. Это оптимальное поверхностный заряд предложено ДНК-оригами покрытий примерно 110 мкм / оригами 2 на APTES МПС и 120 оригами / мкм 2 на ТЦМВ ЗРК.
Одним из преимуществ кремния является его совместимость с литографических процессов формирования паттерна. Высокая магнияконцентрации могут быть использованы при обработке плазмы оксидов кремния способствовать селективному связыванию ДНК-оригами с кремнием. Необходимо соблюдать осторожность при удалении образца из раствора для осаждения, чтобы избежать промывки ионы магния и от деформации ДНК-оригами. 21,22 процессе формы APTES ковалентно присоединенные катионы на поверхности оксида кремния, так стирки или полоскания с буфером или водой делает не повредить прилагаемый ДНК-оригами. Метод "Молекулярная взлет" является еще одним возможным путем для кремниевых подложек рисунка и продвижения оригами ДНК адгезии. Кремниевая подложка с рисунком с помощью электронно-лучевой литографии и APTES осаждается на обнаженной подложки. После старта фоторезиста, Origami ДНК может быть нанесен на поверхность узорного, преимущественно связывания с APTES. 23
Взаимодействие ДНК-оригами с подложкой изменяется его стабильность, открывая новые возможности для исследований и применений. Origam ДНКя придерживался слюды может быть нагрета до 150 ° C без видимого изменения размеров наноструктурных и минимальных химических изменений. 24 Это резко контрастирует с хрупкостью оригами ДНК в растворе, где наноструктуры являются полными dehybridized выше 70 ° C. 25, 26 Эта стабильность сохраняется на нагретые субстраты оксида кремния. 27 Даже в различных системах растворителей, таких как гексан, толуол и этанол, формы и охватом наноструктур поддерживаются. Удивительно устойчивость оригами ДНК показывает, что приложения, которые ранее считались несовместимыми, такие как плазменно осаждения из паровой фазы, использование общих фоторезистов и растворителей, и уникальных условиях химического осаждения, может быть использован в сочетании с ДНК-оригами. Однако, будь ДНК-оригами сохранить их функциональность до сих пор неизвестно и может ограничить возможные области применения.
Хотя стабильность оригами ДНК при повышенной температурех и в ограниченное число систем растворителей была определена, долгосрочная стабильность ДНК-оригами на подложках по-прежнему неизвестно. Использование стерильных техник необходимо, чтобы избежать возможного загрязнения, но это не может быть предотвращено после осаждения на поверхности. Изображений и анализ проб должны быть завершены почти сразу же после приготовления образца; если образец хранится слишком долго (более недели) различные примеры деградации образца часто идентифицируются, в том числе накопления частиц и наноструктур сломанных ДНК. Возможные направления исследований в наноэлектроники, биодатчиков и других субстратов на основе оригами приложений ДНК может быть ограничено нестационарной дестабилизации ДНК. Определение ограничения этих методов для применений, требующих стабильность в течение более длительных периодов времени, требует дальнейшего исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μl | VWR International, LLC | 22491733 | 10 reload tray of 96 tips |
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR International, LLC | 87003-290 | 0.65 ml, natural |
| Research Plus Pippete - Single Channel - 20-200 μl | A. Daigger & Company, Inc. | EF8960F-3120000054 EACH | Adjustable Volume |
| Research Plus Pippete - Single Channel - 2-20 μl | A. Daigger & Company, Inc. | EF8960D-3120000038 EACH | Adjustable Volume |
| Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape | Office Depot, Inc. | 602710 | 3/4" x 300", Pack of 2 |
| Vortex Mixer | Thermo Scientific | M37610-33Q | |
| Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm | Electron Microscopy Sciences | 64917-2 | 6 per pack |
| 6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat | Nova Electronic Materials, Ltd. | GC49266 | |
| Powder-Free Nitrile Examination Gloves | VWR International, LLC | 82062-428 | Catalog number is for size large |
| High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating | K-Tek Nanotechnology, Inc. | HA_NC/15 | |
| Autoclave Pan | A. Daigger & Company, Inc. | NAL692-5000 EF25341C | |
| Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch - 1 dz | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | 106-15055 | Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves. |
| Tweezers PTFE 200 mm Square | Dynalon Corp. | 316504-0002 | |
| Muscovite Mica Sheets V-5 Quality | Electron Microscopy Sciences | 71850-01 | 10 per pack |
| Mica Disc, 10 mm | Ted Pella, Inc | 50 | Mica discs are optional |
| Scriber Diamon Pen for Glassware | VWR International, LLC | 52865-005 | |
| Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap - 20 ml | VWR International, LLC | 66022-060 | Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner |
| 4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz | Dot Scientific, Inc. | 6759-200 | |
| Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth | VWR International, LLC | 89043-554 | Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached |
| Standar-Grade Glass Beaker, 250 ml Capacity | VWR International, LLC | 173506 | |
| Beakers, PTFE | VWR International, LLC | 89026-022 | For use with HF |
| Shallow form watch glass, 3" | VWR International, LLC | 66112-107 | Case of 12 |
| Plastic Storage Container | VWR International, LLC | 470195-354 | For secondary container |
| General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers | VWR International, LLC | 89095-564 | |
| High precision and ultra fine tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78310-0 | |
| Polycarbonate Faceshield | Fisher Scientific, Inc. | 18-999-4542 | |
| Neoprene Apron | Fisher Scientific, Inc. | 19-810-609 | |
| Calcium Gluconate, Calgonate | W.W Grainger, Inc. | 13W861 | Tube, 25 g |
| Hydrogen Peroxide 30% CR ACS 500 ml | Fisher Scientific, Inc. | H325 500 | HARMFUL, TOXIC |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | Gelest Inc. | SIA0610.0-25GM | Let warm to room temperature before use. |
| Ammonium hydroxide, 2.5 L | Fisher Scientific, Inc. | A669-212 | HARMFUL, TOXIC |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific, Inc. | A144-212 | HARMFUL, TOXIC |
| Hydrofluoric acid | Fisher Scientific, Inc. | A147-1LB | HARMFUL, TOXIC |
| MultiMode Nanoscope IIIa | Veeco Instruments, Inc. | Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis | |
| Dunk basket | Made in lab | Made in lab | The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws. |
References
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
- Anderson, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459, 73-77 (2009).
- Wang, Z., Ding, B. Engineering DNA Self-Assemblies as Templates for Functional Nanostructures. Acc. Chem. Res. 47, 1654-1662 (2014).
- Xu, K., et al. Graphene Visualizes the First Water Adlayers on Mica at Ambient Conditions. Science. 329, 1188-1191 (2010).
- Bustamante, C., et al. Circular DNA-molecules imaged in air by scanning force microscopy. Biochemistry. 31, 22-26 (1992).
- Hsueh, C., et al. Localized Nanoscopic Surface Measurements of Nickel-Modified Mica for Single-Molecule DNA Sequence Sampling. ACS Appl Mater. Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Pastre, D., et al. Anionic polyelectrolyte adsorption on mica mediated by multivalent cations: A solution to DNA imaging by atomic force microscopy under high ionic strengths. Langmuir. 22, 6651-6660 (2006).
- Woo, S., et al. Self-assembly of two-dimensional DNA origami lattices using cation-controlled surface diffusion. Nature Communications. 5, 4889 (2014).
- Vesenka, J., et al. Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope. Ultramicroscopy. 42-44, 1243-1249 (1992).
- Adsorption studies of DNA origami on silicon dioxide. Albrechts, B., et al. 21st Micromechanics and Micro Systems Europe Workshop 2010, , (2010).
- Sarveswaran, K., et al. Adhesion of DNA Nanostructures and DNA Origami to lithographically patterned self-assembled monolayers in Si[100]. Proc. of SPIE-Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M-1 (2010).
- Kern, W., Puotien, D. A. Cleaning solutions based on hydrogen peroxide for use in silicon semiconductor technology. RCA Rev. 31, 187-206 (1970).
- Pillers, M., Goss, V., Lieberman, M. Electron-Beam Lithography and Molecular Liftoff for Directed Attachment of DNA Nanostructures on Silicon: Top-down Meets Bottom-up. Acc. Chem. Res. 47, 1759-1767 (2014).
- Saccá, B., Niemery, C. M. DNA Origami: The Art of Folding DNA. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 58-66 (2012).
- Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37, 5001-5006 (2009).
- Ben-Ishay, E., et al. Designing a Bio-responsive Robot from DNA. Origami. J. Vis. Exp. (77), e50268 (2013).
- Woo, S., et al. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nature Chemistry. 3, 620-627 (2011).
- Schlegel, M. L., et al. Cation sorption on the muscovite (001) surface in chloride solutions using high-resolution X-ray reflectivity. Geochim. Cosmochim. Acta. 70, 3549-3565 (2006).
- Rasband, W. S., Howarter, J. A., et al. National Institutes of Health. Langmuir. 22, Bethesda, Maryland, USA. 11142-11147 (2006).
- Kershner, R. J., et al. Placement and orientation of individual DNA shapes on lithographically patterned surfaces. Nature Nanotechnology. 4, 557-561 (2009).
- Hung, A. M., et al. Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed by lithographically confined DNA origami. Nature Nanotechnology. 5, 121-126 (2010).
- Sarveswaran, K., et al. et al.Adhesion of DNA nanostructure and DNA origami to lithographically patterned self-assembled monolayers on Si[100. Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M (2010).
- Pillers, M. A., Lieberman, M. Thermal stability of DNA origami on mica. J. Vac. Sci. Technol. B. 32, 040602 (2014).
- Song, J., et al. Direct Visualization of Transient Thermal Response of a DNA. Origami. J. Am. Chem. Soc. 134, 9844 (2012).
- Wei, X., et al. Mapping the thermal behavior of DNA origami nanostructures. J. Am. Chem. Soc. 135 (16), 6165-6176 (2013).
- Hyojeong Kim,, et al. Stability of DNA Origami Nanostructures under Diverse Chemical Environments. Chem. Mater. 26, 5265-5273 (2014).
