Introduction
Først indført i 2006, DNA origami udnytter selvsamlende natur DNA-oligonukleotider til at producere designable og yderst ordnede nanostrukturer. 1 Et utal af strukturer er blevet rapporteret, lige fra smiley ansigter til klinke 3-dimensionelle bokse. 2 DNA origami kan funktionaliseres med forskellige biomolekyler og nanostrukturer, der giver anledning til forskningsansøgninger i nanoelektronik, medicin og kvantecomputere. 3 Men den analyse og mange fremtidige anvendelsesmuligheder er ikke kun afhængig af strukturelle design, men også af vedhæftning af DNA origami nanostrukturer til overflader. Beskrevet i dette manuskript metoder vedrører forberedelse af DNA origami prøver på to typer af underlag: glimmer og funktionaliserede siliciumoxid.
Glimmer er substratet af valg til DNA origami undersøgelser, fordi det er atomisk fladt, med et lag højde på 0,37 nm ± 0,02 nm. 4 Det er også easily renset, hvilket gør prøveforberedelse og atomic force mikroskopi (AFM) undersøgelser ligetil. Muskovit glimmer indeholder en høj densitet af kalium i hver spaltning plan, men disse ioner diffundere væk fra glimmeroverflade når i vand. At mediere binding af DNA origami til glimmer substratet, Mg2 + bruges til at vende den negative ladning af glimmer og binde elektrostatisk DNA phosphatrygraden til substratet (figur 1A). 5 Blandinger af udglødet DNA i nærvær af store overskud af korte tråde give høj dækning og gode billeder på glimmer fordi adhæsionen af DNA origami til Mg2 + -terminated overflade er meget stærkere end adhæsionen af enkeltstrengede oligonukleotider (korte strenge). Andre positivt ladede ioner, herunder Ni2 + og Co2 + kan anvendes til at styre vedhæftningen af DNA på glimmer. 6,7 Ændring af koncentrationen af monovalente og divalente kationer i opløsningen kan mediere adhesion og overflade diffusionshastigheder DNA origami. 8. Imidlertid protokollen for at forberede glimmer substrater og deponering og skylle origami ofte ikke eksplicit beskrevet i publicerede manuskripter. 9 Uden en klar protokol, kan reproducerbare resultater være vanskeligt at opnå.
Glimmer er en isolator, så det er ikke egnet som et substrat for visse applikationer i nanoelektronik. Silicium passiveret med en tynd indfødt oxid har ønskelige elektroniske egenskaber, herunder kompatibilitet med forudgående gratis metal-oxid halvleder (CMOS) behandling for at skabe input / output strukturer og topografiske funktioner. Siliciumskiver opbevaret i luft er passiveret med enten en tyk termisk oxid eller tynd nativt oxid film, der er relativt snavset, med en høj partikelformet tæller. Siliciumoxid har en meget lavere overflade ladningsdensitet end glimmer, og ladningstæthed er meget afhængig af forberedelse og historie oxid. Ved magnesium ionkoncentrationer Above 150 mM, gode dækningsområder (op til 4 / um 2), i rektangulær DNA origami kan opnås på oxygen plasma behandlet siliciumsubstrater; dog kan denne koncentration og dækning ændre sig afhængigt af størrelse og design af nanostrukturer, der anvendes. 10. En alternativ protokol til tuning overfladen afgift er at vedhæfte en kationisk selv-samlet monolag af 3-aminopropyltriethoxysilan (APTES) (figur 1B) til oxidet. Den primære amin på APTES kan protoneret ved pH-værdier under 9, modificere ladningen og hydrofobiciteten af substratet. 11 For en komplet monolag af APTES med held deponeres, skal silicium passende renses med Radio Corporation of America (RCA) protokoller . Disse protokoller omfatter behandlinger i ammoniumhydroxid og hydrogenperoxidopløsninger (RCA1) for at fjerne organiske rester og partikel forureninger. En kort etch i vandig flussyre opløsning fjerner det native oxidlaget sammen medeventuelle ioniske urenheder, der overholder oxid. Endelig prøver udsat for en saltsyre og hydrogenperoxidopløsning (rca2) for at fjerne metal og ioniske kontaminanter og danne en tynd, ensartet oxidlag. 12 De fleste renrum har udpeget hætter for CMOS rengøring protokoller, med strenge regler om, hvad der kan anvendes på disse områder. Et fælles problem kommer i form af ioner, såsom natrium, som kan forstyrre de elektroniske egenskaber af CMOS strukturer ved at skabe midbandgap fælder. 13 Ioner almindeligt anvendt i DNA origami forberedelse og deposition buffere kan forurene CMOS bade og forårsage problemer for andre forskere ved hjælp af den rene rum. Derfor vores gruppe anvender en "beskidt" CMOS rengøring bænk arrangeret specielt til de små prøver, der anvendes til DNA origami forskning. Denne proces er et godt alternativ til den traditionelle renrum opsætning og kan være egnet til laboratorier, der ikke har adgang til et renrum CMOS bænk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Eksperiment Planlægning og Klargøring
- Bestem design, koncentration og funktionalitet af DNA origami, der vil blive anvendt i eksperimenterne. 14-16 Her bruger vi en DNA origami rektangel design fremstillet i 1x TAE / Mg2 + opløsning (40 mM Tris-base, 20 mM eddikesyre, 2 mM EDTA og 12 mM magnesiumacetat, pH 8,0). 17
- Autoklavér alle tips, rør og beholdere, der skal anvendes. Disse materialer skal alle være autoklave kompatible.
- Forbered en levering af sterilt vand til skylning. Fyld en steril krukke med ca. 500 ml 18 MOhm x cm vand, sted på en kogeplade, koges i 5 min med hætten, og tage krukken ud af varmepladen og lad afkøle med låget placeret på beholderen, men ikke strammet . Opbevar i køleskabet og forberede en ny forsyning hver måned eller efter behov.
2. Forberedelse af Mica Substrat
- Cut substrater til passende størrelse (1 cm x 1 cm kvadrater) med en saks. Mica er tynd og skør. Alternativt, køb glimmer i disc form, som ikke kræver skæring.
- Spalte glimmer med dobbeltklæbende tape. Glimmer består af lag af mineraler adskilt af interkalerende ioner, kan hvert lag skrælles af, når klæbet til dobbeltsidede tape. 18
- Placer glimmer firkanter på dobbeltklæbende tape stadig i tape dispenser, og sørg for det er klæbet fast til båndet. Skub forsigtigt pincetten mellem glimmer og båndet, vil det øverste lag fjernes og forbliver på båndet. Umiddelbart efter fjernelse, vil glimmer firkantede have sin rene side vender nedad. Sørg for at vende glimmer over, før opbevaring i en beholder.
- Gentag dette tre til fire gange for at sikre fuldstændig fjernelse af den øverste lag og passende rensning.
- Alternativt klæbe glimmer på en beholder eller bord-top med et stykke dobbeltklæbende tape og bruge et andet stykke til skryds til og skrælle øverste glimmer lag. Glimmer vil blive ordentligt rengjort i begge tilfælde, selv om den alternative metode gør deponering DNA og skylning og tørring af prøven vanskelig på grund af den anden vedhæftning til underlaget.
3. Deponering DNA Origami på Mica
- Kort fortalt bland hætteglasset med DNA origami ved hjælp af en vortex mixer for at sikre endnu spredning af nanostrukturer i opløsning.
- Pipette 4 ul opløsningen på glimmer, der sikrer, at pipettespidsen ikke rører underlaget. Efterlad DNA origami på glimmer i ca. 10 minutter for at sikre tilstrækkelig dækning. Aflejring vil variere afhængig af koncentrationen af DNA origami anvendes, såvel som den ønskede dækning (figur 2 og 3).
- Skyl DNA origami opløsning ud af glimmer underlaget med 100 pi sterilt vand over en vask eller anden væske beholder. Afhente glimmer med en pincet. Pipettere vand påsubstrat, med strømmen af dråben mod spidsen af pincetten. Ryst glimmer med en skarp bevægelse nedad for at fjerne det overskydende vand. Hold pincetten lodret så vandet vil strømme mod pincet for at undgå forurening af prøven.
- Tør substratet med en stadig strøm af nitrogen (N2) i 1 min. Sørg for, at overskydende vand fjernes. Gentag skylning med yderligere 100 pi sterilt vand. Tør substratet med N2 i yderligere 3 min. En helt tørt substrat er nødvendig for en vellykket atomic force mikroskopi (AFM) analyse (Figur 4).
- Analyser underlaget med AFM eller opbevares i en lukket beholder.
4. CMOS / Silicon Cleaning Set-up
- ADVARSEL: Når du bruger CMOS set-up, bruge personlige værnemidler på alle tidspunkter. Reagenserne omfatter stærke syrer, stærke baser, flussyre (HF), og stærke oxidationsmidler, som can reagerer med affald opløsningsmidler, hvis reagenser ikke bortskaffes korrekt. Overholde følgende sikkerhedsforanstaltninger:
- Hus CMOS bænk i en kemisk hætte med ingen andre processer eller set-ups.
- Bær nitril, lab coat, sikkerhedsbriller, store industrielle nitril handsker, en spill forklæde, og et ansigt skjold på alle tidspunkter, når du bruger CMOS bænken.
- Bruge plastik bøtter som sekundær indeslutning, når løsninger er forberedt.
- Brug en inaktiv fluorerede polymer måling bæger til håndtering af koncentrerede HF.
- Lav calciumgluconat salve til rådighed som førstehjælp til enhver hud eksponering.
- Tillad kun ordentligt uddannet personale til at udføre processen.
- Sørg altid for, et andet medlem af laboratoriet er til stede i tilfælde af en nødsituation.
- Hold MSDS information for alle kemikalier nær hætten.
- Være bekendt med institutionens eller virksomhedens kemikalieudslip og eksponering politikker.
Bemærk: HF let gennemtrænger hudenog er en calcium ådselsæder, der påvirker knogler og skadelige nerver hvis eksponering forekommer. Dermal eksponering for nogle få ml koncentreret flussyre kan være farlig og endda dødelige. Etablere nødvendige forholdsregler for at sikre eksponeringen ikke forekommer.
- Udfør RCA1 og rca2 i en separat 250 ml glas bægerglas på separate kogeplader. Hvert bægerglas bør indeholde en omrører. Overvåge temperaturen af opløsningen under anvendelse af termometre fastspændt så omrører ikke bang i pæren. Dæk bægre bruger et urglas at mindske virkningerne af fordampning.
- RCA1 Forberedelse
- Placer 50 ml af 18 MOhm x cm vand i udpegede RCA1 bægerglas under anvendelse af et målebæger.
- Der tilsættes 15 ml koncentreret ammoniumhydroxid (NH 4 OH) til bægerglasset. Skyl målebægeret med 25 ml vand og tilsættes skyllevandet til RCA1 bægerglas.
- Tænd for varmen og omrører på varmepladen og bringe RCA1 badet til 70 ° C. Der tilsættes 15 ml 30% hydrogenperoxid (H 2 O 2) til RCA1 bægerglas. Brug RCA1 opløsning inden for 1 time efter H 2 O 2 er blevet tilføjet. Badet kan bruges flere gange inden for span på tre dage, hvis der tilsættes 15 ml af peroxid til badet hver gang.
- Skyl målebægeret grundigt med vand og kassér skylning i et passende RCA1 affald flaske.
- Rca2 Forberedelse
- Tilføj 70 ml 18 MOhm x cm vand til den udpegede rca2 bægerglas ved hjælp af den skylles grundigt målebæger.
- Der tilsættes 15 ml koncentreret saltsyre (HCI). Skyl målebægeret med 20 ml vand og tilsæt den til rca2 bægeret.
- Øg varmen og rør hastighed varmeplade indtil opløsningen når 70 ° C.
- Der tilsættes 15 ml 30% H 2 O 2. Ligesom RCA1 bad, bruge denne løsning inden for 1 time fra når H 2 O 2 tilføjes; derudover badetkan genbruges flere gange inden for span på tre dage, hvis der tilsættes 15 ml H 2 O 2 før hver brug.
- HF Fremstilling af opløsning
- Placer 50 ml vand i et inert fluorerede polymer bægerglas.
- Mål 4 ml koncentreret flussyre (49%) i plast målebægeret og føje den til den inerte fluorerede polymere bæger.
- Skyl plastik målebæger med i alt 50 ml vand, tilføjer skyllevandet til HF bægeret. Skyl målebægeret grundigt med vand og kassér vaskene i en udpeget HF affaldsbeholder.
5. Forberedelse og Rengøring af Silicon Substrat
- Skæring siliciumskiver i chips
- Identificer de vinkelrette og parallelle gittermaster retninger på den flade polerede overflade af silicium wafer. Disse retninger er vant til at hjælpe med at gøre spaltende kvadrater lettere. Følgende instruktioner vedrører cleaving silicium <110> og kan ikke være egnet til andre krystal orienteringer.
- Placer siliciumskiven poleret side opad på en blød overflade, såsom en serviet. Brug af diamantværktøj skriftklog pen, forsigtigt nick bunden af skiven langs den primære flade kant. Placer en lille ledning, såsom en papirclips, under nick og forsigtigt lægge pres på skiven ved at placere fingre eller pincet på begge sider af nick og trykke ned. Gøre dette vil adskille wafer i to halvdele langs krystalgitter linje i naturlige kløve retning.
- På en anden serviet, med en blyant og lineal, udmåle den ønskede bredde af kvadraterne ved at markere prikker på både toppen og bunden af bindet. Forbinde disse punkter med lige linjer. Dette vil tjene som en rettesnor for selv firkantede former.
- Placer en af wafer halverer kant først mellem de målte linier på servietten skylles mod linjen og gentag i trin 5.1.2 frisk brudt vinkelret pieces skulle nu være bredden af de spaltede firkanter. Vend skiven vandret på bindet. Placer den mellem de vinkelrette linjer og gentag processen i trin 5.1.2.
- Opbevar frisk spaltede wafer chips i en ren hætteglas fyldt med DI vand for at undgå ridser. Silicium-chips kan opbevares på ubestemt tid, men bør rengøres før start eksperimenter.
- CMOS Rensning af Silicon
- Når RCA1 opløsningen har nået den passende temperatur, nedsænkes otte til ti 1 cm x 1 cm silicium-chips i opløsning under anvendelse af en inert fluoreret polymer kurv med en 2 "diameter. Bobler af oxygen danner på chips og bægerglas vægge. Hvis der ikke boblende opstår, H 2 O 2 nedbrydes. Lad chips i opløsningen i 10 til 20 min, omrøring af kurven op og ned hvert par minutter for at holde chipsene klæber sammen.
- Løft kurven indeholder siliciumchips op og dræne godt. Flyt kurven over to affaldet bægeret og skyl grundigt med 18 MOhm x cm vand. Fordyb i vask bæger og jiggle op og ned i 20 sek. Tøm kurv og skyl grundigt med vand over det affald, bægeret. Tøm affald bægeret i en udpeget RCA1 affald flaske og fyld med vand.
- Efter RCA1 rengøring er færdig, skal du placere kurven i 01:50 HF bægeret for 10 til 20 sek. Brug en mild op- og nedadgående bevægelse for at blande chips og HF. Løft dunk spand til at tillade HF løbe helt væk.
Bemærk: Chippen flader skal være hydrofob; vand vil ikke befugte chippen, men i stedet danne dråber med høje kontaktvinkler. Dette indikerer, at siliciumoxid er blevet ætset væk og chippen er nu afsluttet ved Si-H-bindinger. - Placer vask bægeret og skyl bæger i en plastik badekar, flytte kurven over skylning bægeret og skyl med 18 MOhm x cm vand. Nedsænkes kurven ind i vask bægerglas og agitere for 20 sek.
- Gennemfør en anden afløb og Rinse-cyklus med 18 MOhm x cm vand. Dump vaskevandet ind i skylning bægerglasset og fyld vask bægerglasset med vand. Hæld alt affald i en udpeget plast HF affald flaske.
- Når rca2 opløsningen har nået den passende temperatur, nedsænkes silicium chips i opløsningerne ved hjælp af kurven. Efterlad i opløsningen i 10 til 20 min. Chippen vil nu være hydrofilt skyldes vækst af en tynd (1-2 nm) oxid film.
- Fjern efter passende mængde tid og følger de samme skylning procedurer som for RCA1. Bortskaffe affaldet i den passende rca2 affaldsbeholder. Fjern hver chip fra kurven med plastik pincet, skylles med vand, og blæs tør med nitrogen.
- Opbevar chips i en plastik wafer boks eller i et hætteglas med 18 MOhm x cm vand. Silicium vil forblive ren når de opbevares i vand i cirka tre dage efter rengøringen. Sørg for, at arbejdsområdet er renset ordentligt op og det ydre af CMOS handskerne er blevet vasket. Forlad CMOS handsker i hætten for at tørre.
6. Deponering DNA Origami på APTES-funktionaliseret Silicon
- Self-samlet monolagsformation på Silicon
- Varm APTES til RT før åbning. Hvis flasken er for koldt, kan der opstå kondens, der forårsager hydrolyse af APTES under opbevaring. Tilføj 1.980 pi 18 MOhm x cm vand og 20 pi APTES til en ren scintillationsglas og hvirvel blandes. Brug denne løsning med det samme.
- Placer en renset silicium chip reflekterende-side-up i scintillationshætteglas, kronen på værket, og lad sidde i 20 min. Fjerne chippen med en pincet og skyl med 200 pi vand og tør i 1 min med en strøm af N2.
- Deponering DNA origami på APTES funktionaliserede Silicon
Bemærk: De trin for deponering DNA origami på funktionaliserede silicium er analoge med dem til deponering på glimmer.- Kort fortalt blandes DNA origami hætteglasset og pipette 4 pi opløsningpå silicium substrat. Hvis det er nødvendigt, øge mængden af DNA origami opløsning, der anvendes til at dække hele substrat som den funktionaliserede silicium er mere hydrofob end glimmer substrat. Brug et glas dækglas til at trykke på deposition løsning ned og forhindre fordampning under lange nedlægninger.
- Lad opløsningen stå i den nødvendige tid for den anvendte koncentration og den ønskede dækning (se figur 2 og 3 for effekten af tid og koncentration på overfladedækning). Skyl substratet med 100 pi sterilt 18 MOhm x cm vand og tør med N2 i 1 min.
- Gentag skylning med yderligere 100 pi sterilt vand og tør substratet med N2 i 3 minutter.
- Prøven Opbevar i en ren beholder, indtil yderligere forsøg eller imaging kan udføres. Prøver begynder at vise partikel akkumulering efter ca. en til to uger opbevaring afhængigt af hvor much de håndteres.
7. AFM Imaging og billedanalyse af DNA Origami Prøver
- Brug AFM i Tapping mode i luft til billeddannelse formål. Tapping tilstand sikrer, at minimal kraft vil blive anvendt til de skrøbelige nanostrukturer, sammenlignet med kontakt mode.
Bemærk: De billeddannende parametre vil være afhængig af instrumentet. Alle billeder, der præsenteres blev taget med et MultiMode Nanoscope IIIa. - Vælg AFM prober til ikke-kontakt / aflytning tilstand i luft, med guld reflekterende coating, en resonansfrekvens (nominel) på ~ 300 kHz, tvinger konstant på 40 N / m og tip radius <10 nm.
- Proces og analysere AFM billeder ved hjælp Nanoscope Analysis Software. Udføre beregninger dækning hjælp ImageJ. 19
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
To variabler diktere dækningen af DNA origami på substratet: opløsningskoncentration og eksponeringstid. Adsorptions- karakteristika DNA origami på glimmer og APTES funktionaliseret siliciumoxid er tidligere blevet rapporteret. 13 Forholdet mellem koncentrationen af DNA origami i belægningsopløsning og de endelige dækninger på glimmer er opsummeret i tabel 1 og figur 2, der viser stigende koncentration resulterer i øget dækning. Tidsafhængigheden af binding ses i figur 3. Overfladedækning er tidligere blevet undersøgt for at kvantificere binding opførsel af DNA origami på glimmer og modificerede siliciumoxid overflader. DNA origami i 12 mM magnesium i 1 x TAE buffer har 83,3% ± 3,1% dækning på glimmer efter 30 min absorption tid på overfladen. Maksimal dækning på siliciumoxid modificeret med APTES SAMs observeres efter 60 minutter, hvilket er mindre end den maksimale dækning på glimmer. Enlængere deposition tid er nødvendig, hvis et stort overfladeareal dækning er påkrævet på APTES funktionaliserede siliciumoxid.
Der er flere variabler, der kan forårsage dårlig forberedelse prøve. Den mest besværlige er utilstrækkelig skylning og tørring. Hvis pufferopløsningen ikke skylles ordentligt, store aggregater dannes på substratet (figur 4A). 'DNA origami øer "overholdes, når nanostrukturer overholde pletter af magnesiumsalte på overfladen (figur 4B). Endelig med høj dækning prøver, er det muligt at have overskydende buffer komponenter danner bro mellem de enkelte DNA origami (figur 4C), hvilket gør det vanskeligt at skelne nanostrukturer ved hjælp AFM. Disse resultater kan undgås ved at følge en grundig skylning og tørring protokol for både glimmer og siliciumsubstrater.
Dannelse af APTES film på siliciumoxid substrater kan give problemer så godt. Silicium wafers har enru siliciumoxidlag, der skal fjernes, og en glattere, tyndere siliciumoxidlag reformeret før det kan funktionaliseres. En korrekt rengøres siliciumsubstrat er illustreret i figur 5A. Under rengøring af siliciumskiven, er det vigtigt at sørge for antallet af silicium-chips ikke er for høj, da det er muligt for to chips til at sidde fast til hinanden, blokering udsættelse for reagenserne (figur 5B). Hvis renset silicium har været opbevaret i 18 MOhm x cm vand i mere end en uge, vil det forurenende lag reformere og recleaning er nødvendig. Den APTES forsyningen kan også give problemer med prøveforberedelse. APTES let polymeriserer ved hydrolyse, som er grundlaget for monolagsformation. 20 Omfanget af denne polymerisation er afhængig af koncentrationen af vand, at APTES er udsat for. Over tid og ved gentagen brug, er det muligt for vand at kondensere inde i APTES flasken og forureneforsyning. Den resulterende polymerisation producerer store aggregater, der klæber til substratet (figur 5C). Den øgede ruhed og tilstedeværelse af aggregater gør identificere DNA nanostrukturer ved hjælp AFM vanskelig. Det er god praksis at gemme APTES flaske i en plastpose i køleskabet, og lad APTES flaske varm til RT, inden du åbner for at undgå kondens.
Figur 1. Et skematisk sammenligning af bindende mekanisme for DNA origami på (A) glimmer og (B) APTES funktionaliseret siliciumoxid (ikke målfast). Binding med glimmer medieres ved tilstedeværelsen af divalente kationer, sædvanligvis Mg2 +. En monolag af den protonerede amin-terminerede 3-aminopropyltriethoxysilan anvendes til at fremme adhæsion på siliciumoxid substrat.
<img alt = "Figur 2" src = "/ files / ftp_upload / 52972 / 52972fig2highres.jpg" width = "700" />
Figur 2. AFM billeder illustrerer variabel dækning efter 10 min nedlæggelser af (A) 2 nM, (B) 4 nM, og (C) 6 nM på glimmer. Højden skala for alle billeder er 5 nm.
Figur 3. Udviklingen i overfladen dækning for 2 nM DNA origami i 1x TAE buffer, 12 mM Mg2 +. MICA = lilla linje og cirkel markører, APTES = gule linjer og trekant markører. N = 3 i bestemmelsen af standardfejl.
Figur 4. Dårlig skylning og tørring kan forårsage (A) løsning sammenlægning på underlaget, (B) DNA origami øer, og (C) bro af nanostrukturer påhøj dækning prøver i nærvær af overskydende buffersalte. Højden skala for alle billeder er 5 nm.
Figur 5. (A) Rent silicium skal have RMS ruhed mindre end 0,5 Å over 1 kvadrat mikron. En komplet APTES SAM afsat på en god nativt oxid bør have en RMS ruhed mindre end 1 Å over 1 kvadrat mikron. (B) APTES film dannet på en ufuldstændigt rengøres siliciumoxid med RMS ruhed på 2,29 nm over 1 kvadrat mikron. . Bemærk huller og ruhed i APTES film (C) APTES overflade dannet af en stikprøve af APTES forurenet med kondenseret affald; hydrolyse i APTES flaske former store partikler. Højden skala for alle billeder er 5 nm.
Tabel 1. procent dækning målinger for glimmer substrater med varying DNA origami opløsningskoncentrationer. Alle deposition tidspunkter er 10 min.
| DNA Origami Solution | % Dækning på Mica Substrat |
| 2 nM | 8,49 ± 2,67 (n = 5) |
| 4 nM | 55.89 ± 5,65 (n = 3) |
| 6 nM | 77,44 ± 1,89 (n = 4) |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere trin, der skal fremhæves for at opnå konsistente og ideelle resultater. For glimmer prøver, efter en streng og grundig skylning og tørring regime, som i trin 3.3 og 3.4, vil sikre, at billeder af individuelle DNA origami høj kvalitet kan opnås ved hjælp af AFM uden de forskellige problemer, der er skitseret i repræsentative resultater sektionen. Af primær betydning for silicium prøver er renligheden af underlaget. Følge procedurerne rengøring skitseret i trin 5.2 grundigt og omhyggeligt vil sikre, at en passende rengjort siliciumoxid overflade vil blive nået. Derudover, overvågning af kvaliteten og effektiviteten af kemikalier, såsom hydrogenperoxid, flussyre, og APTES, vil sikre, at proceduren forløber glat.
De beskrevne teknikker er ikke begrænset til kun vandige opløsninger af APTES. En blandet monolag af APTES og trimethylaminopropyltrimethoxysilyl (TMAC) kan være osed at tune silicium overfladeladning og markedsføre variabel DNA origami adhæsion. 11 TMAC indeholder en permanent ladet terminal kvaternær amin -N (CH3) 3 +, sammenlignet med den pH-afhængige ladning på APTES. Fordi løsningen miljø ikke påvirker protonering staten eller ansvaret for TMAC, varierende koncentrationen af TMAC kan tune løsning overfladen ansvaret for den blandede monolag og påvirke samspillet mellem underlaget og DNA origami. Optimal DNA origami binding blev observeret for monolag med en overflade afgift på 0,75-1,5 afgifter / nm 2, hvilket svarer til SAM'er indeholdende 100% til 40% TMAC koncentration. Denne optimale overfladeladning bedt DNA origami dækningsområder på ca. 110 origami / um 2 om APTES SAMs og 120 origami / um 2 på TMAC SAM.
En fordel af silicium er dens forenelighed med litografiske mønsterdannende processer. Høj magnesiumkoncentrationer kan anvendes med plasma-behandlet siliciumoxider at fremme selektiv binding af DNA origami til silicium. Der skal udvises forsigtighed, når prøven fjernes fra deposition løsning til at undgå skylning magnesiumionerne væk og deformere DNA origami. 21,22 De APTES processen danner kovalent vedhæftede kationer på siliciumoxid overfladen, så vask eller skylning med buffer eller vand gør ikke skade den vedhæftede DNA origami. Den "molekylære liftoff 'metode er en anden mulig vej til mønstring siliciumsubstrater og fremme DNA origami vedhæftning. Siliciumsubstratet er mønstret ved anvendelse af elektronstrålelitografi og APTES afsættes på den blotlagte substrat. Efter liftoff af fotoresisten kan DNA origami afsættes på den mønstrede overflade, fortrinsvis binding til APTES. 23
Samspillet af DNA origami med et substrat ændrer dets stabilitet, åbner nye muligheder for forskning og applikationer. DNA origamJeg klæbet til glimmer kan opvarmes til 150 ° C uden synlig ændring af nanostruktur dimensioner og minimale kemiske ændringer. 24 Dette er i skarp kontrast til det skrøbelige DNA origami i opløsning, hvor nanostrukturer er komplette dehybridized over 70 ° C. 25, 26 Denne stabilitet opretholdes på opvarmede siliciumoxid substrater. 27 Selv i forskellige opløsningsmiddelsystemer, såsom hexan, toluen og ethanol, formen og dækning af nanostrukturer opretholdes. Den overraskende stabilitet af DNA origami indikerer, at programmer, der tidligere blev anset for uforenelige, såsom plasmaforstærket dampudfældning, brug af fælles fotoresist og opløsningsmidler, og unikke kemiske deposition miljøer, kan anvendes i forbindelse med DNA origami. Imidlertid, om DNA origami opretholde deres funktionalitet er stadig ukendt og kan begrænse de mulige anvendelser.
Skønt stabiliteten af DNA origami ved forhøjet temperaturs og i et begrænset antal opløsningsmiddelsystemer er blevet bestemt, stabiliteten af DNA origami langsigtet på substrater er stadig ukendt. Er nødvendig for at undgå mulig kontaminering Brugen af sterile teknikker, men det kan ikke undgås, når overfladen deposition. Billedbehandling og analyse prøve skal afsluttes næsten umiddelbart efter prøveforberedelse; hvis prøven opbevares for længe (mere end en uge) forskellige eksempler på nedbrydning af prøven identificeres ofte, herunder akkumulering partikler og brudte DNA-nanostrukturer. Mulige forskningsområder i nanoelektronik, biosensorer og andre substrat baseret DNA origami programmer kan være begrænset af tidsafhængig destabilisering af DNA. Identificering begrænsninger disse teknikker for applikationer, der kræver stabilitet i længere tid kræver yderligere undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μl | VWR International, LLC | 22491733 | 10 reload tray of 96 tips |
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR International, LLC | 87003-290 | 0.65 ml, natural |
| Research Plus Pippete - Single Channel - 20-200 μl | A. Daigger & Company, Inc. | EF8960F-3120000054 EACH | Adjustable Volume |
| Research Plus Pippete - Single Channel - 2-20 μl | A. Daigger & Company, Inc. | EF8960D-3120000038 EACH | Adjustable Volume |
| Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape | Office Depot, Inc. | 602710 | 3/4" x 300", Pack of 2 |
| Vortex Mixer | Thermo Scientific | M37610-33Q | |
| Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm | Electron Microscopy Sciences | 64917-2 | 6 per pack |
| 6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat | Nova Electronic Materials, Ltd. | GC49266 | |
| Powder-Free Nitrile Examination Gloves | VWR International, LLC | 82062-428 | Catalog number is for size large |
| High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating | K-Tek Nanotechnology, Inc. | HA_NC/15 | |
| Autoclave Pan | A. Daigger & Company, Inc. | NAL692-5000 EF25341C | |
| Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch - 1 dz | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | 106-15055 | Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves. |
| Tweezers PTFE 200 mm Square | Dynalon Corp. | 316504-0002 | |
| Muscovite Mica Sheets V-5 Quality | Electron Microscopy Sciences | 71850-01 | 10 per pack |
| Mica Disc, 10 mm | Ted Pella, Inc | 50 | Mica discs are optional |
| Scriber Diamon Pen for Glassware | VWR International, LLC | 52865-005 | |
| Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap - 20 ml | VWR International, LLC | 66022-060 | Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner |
| 4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz | Dot Scientific, Inc. | 6759-200 | |
| Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth | VWR International, LLC | 89043-554 | Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached |
| Standar-Grade Glass Beaker, 250 ml Capacity | VWR International, LLC | 173506 | |
| Beakers, PTFE | VWR International, LLC | 89026-022 | For use with HF |
| Shallow form watch glass, 3" | VWR International, LLC | 66112-107 | Case of 12 |
| Plastic Storage Container | VWR International, LLC | 470195-354 | For secondary container |
| General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers | VWR International, LLC | 89095-564 | |
| High precision and ultra fine tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78310-0 | |
| Polycarbonate Faceshield | Fisher Scientific, Inc. | 18-999-4542 | |
| Neoprene Apron | Fisher Scientific, Inc. | 19-810-609 | |
| Calcium Gluconate, Calgonate | W.W Grainger, Inc. | 13W861 | Tube, 25 g |
| Hydrogen Peroxide 30% CR ACS 500 ml | Fisher Scientific, Inc. | H325 500 | HARMFUL, TOXIC |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | Gelest Inc. | SIA0610.0-25GM | Let warm to room temperature before use. |
| Ammonium hydroxide, 2.5 L | Fisher Scientific, Inc. | A669-212 | HARMFUL, TOXIC |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific, Inc. | A144-212 | HARMFUL, TOXIC |
| Hydrofluoric acid | Fisher Scientific, Inc. | A147-1LB | HARMFUL, TOXIC |
| MultiMode Nanoscope IIIa | Veeco Instruments, Inc. | Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis | |
| Dunk basket | Made in lab | Made in lab | The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws. |
References
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
- Anderson, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459, 73-77 (2009).
- Wang, Z., Ding, B. Engineering DNA Self-Assemblies as Templates for Functional Nanostructures. Acc. Chem. Res. 47, 1654-1662 (2014).
- Xu, K., et al. Graphene Visualizes the First Water Adlayers on Mica at Ambient Conditions. Science. 329, 1188-1191 (2010).
- Bustamante, C., et al. Circular DNA-molecules imaged in air by scanning force microscopy. Biochemistry. 31, 22-26 (1992).
- Hsueh, C., et al. Localized Nanoscopic Surface Measurements of Nickel-Modified Mica for Single-Molecule DNA Sequence Sampling. ACS Appl Mater. Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Pastre, D., et al. Anionic polyelectrolyte adsorption on mica mediated by multivalent cations: A solution to DNA imaging by atomic force microscopy under high ionic strengths. Langmuir. 22, 6651-6660 (2006).
- Woo, S., et al. Self-assembly of two-dimensional DNA origami lattices using cation-controlled surface diffusion. Nature Communications. 5, 4889 (2014).
- Vesenka, J., et al. Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope. Ultramicroscopy. 42-44, 1243-1249 (1992).
- Adsorption studies of DNA origami on silicon dioxide. Albrechts, B., et al. 21st Micromechanics and Micro Systems Europe Workshop 2010, , (2010).
- Sarveswaran, K., et al. Adhesion of DNA Nanostructures and DNA Origami to lithographically patterned self-assembled monolayers in Si[100]. Proc. of SPIE-Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M-1 (2010).
- Kern, W., Puotien, D. A. Cleaning solutions based on hydrogen peroxide for use in silicon semiconductor technology. RCA Rev. 31, 187-206 (1970).
- Pillers, M., Goss, V., Lieberman, M. Electron-Beam Lithography and Molecular Liftoff for Directed Attachment of DNA Nanostructures on Silicon: Top-down Meets Bottom-up. Acc. Chem. Res. 47, 1759-1767 (2014).
- Saccá, B., Niemery, C. M. DNA Origami: The Art of Folding DNA. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 58-66 (2012).
- Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37, 5001-5006 (2009).
- Ben-Ishay, E., et al. Designing a Bio-responsive Robot from DNA. Origami. J. Vis. Exp. (77), e50268 (2013).
- Woo, S., et al. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nature Chemistry. 3, 620-627 (2011).
- Schlegel, M. L., et al. Cation sorption on the muscovite (001) surface in chloride solutions using high-resolution X-ray reflectivity. Geochim. Cosmochim. Acta. 70, 3549-3565 (2006).
- Rasband, W. S., Howarter, J. A., et al. National Institutes of Health. Langmuir. 22, Bethesda, Maryland, USA. 11142-11147 (2006).
- Kershner, R. J., et al. Placement and orientation of individual DNA shapes on lithographically patterned surfaces. Nature Nanotechnology. 4, 557-561 (2009).
- Hung, A. M., et al. Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed by lithographically confined DNA origami. Nature Nanotechnology. 5, 121-126 (2010).
- Sarveswaran, K., et al. et al.Adhesion of DNA nanostructure and DNA origami to lithographically patterned self-assembled monolayers on Si[100. Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M (2010).
- Pillers, M. A., Lieberman, M. Thermal stability of DNA origami on mica. J. Vac. Sci. Technol. B. 32, 040602 (2014).
- Song, J., et al. Direct Visualization of Transient Thermal Response of a DNA. Origami. J. Am. Chem. Soc. 134, 9844 (2012).
- Wei, X., et al. Mapping the thermal behavior of DNA origami nanostructures. J. Am. Chem. Soc. 135 (16), 6165-6176 (2013).
- Hyojeong Kim,, et al. Stability of DNA Origami Nanostructures under Diverse Chemical Environments. Chem. Mater. 26, 5265-5273 (2014).
