Introduction
Voor het eerst geïntroduceerd in 2006, DNA-origami maakt gebruik van de zelfassemblerende aard van DNA-oligonucleotiden om ontwerpbaar en sterk geordende nanostructuren te produceren. 1 Een groot aantal structuren zijn gemeld, variërend van smiley gezichten tot 3-dimensionale dozen vergrendeld. 2 DNA-origami kunnen worden gefunctionaliseerd met verschillende biomoleculen en nanostructuren, die tot onderzoekstoepassingen in nano-elektronica, medicijnen en quantum computing. 3 De analyse en vele toekomstige toepassingen zijn niet alleen afhankelijk van constructie, maar ook de hechting van het DNA origami nanostructuren op oppervlakken. De in dit manuscript beschreven methoden hebben betrekking op de voorbereiding van de DNA-origami samples op twee soorten ondergronden: mica en gefunctionaliseerd siliciumoxide.
Mica is het substraat bij uitstek voor DNA origami studies omdat het atomair vlak, met een laag hoogte van 0,37 ± 0,02 nm nm. 4 is ook easily gereinigd, waardoor monstervoorbereiding en atomic force microscopie (AFM) studies eenvoudig. Micamica bevat een hoge dichtheid kalium per splijtenvliegtuig, maar deze ionen diffunderen van het mica oppervlak indien in water. Om de binding van DNA origami mediëren de mica substraat, Mg2 + wordt gebruikt om de negatieve lading van het mica keren en elektrostatisch DNA fosfaatruggengraat op het substraat (Figuur 1A) binden. 5 Mengsels van gehybridiseerd DNA in de aanwezigheid van grote uitwassen van stapelvezels strengen te hoge dekkingsgraad en goede afbeeldingen op mica omdat de hechting van DNA origami de Mg2 + -terminated oppervlak veel sterker dan de hechting van enkelstrengs oligonucleotiden (stapelvezels draden). Andere positief geladen ionen, zoals Ni2 + en Co2 + kan worden gebruikt om de hechting van DNA op mica controleren. 6,7 veranderen van de concentratie van eenwaardige en tweewaardige kationen in oplossing adhe mediërenSion en verspreiding oppervlak tarieven van DNA origami. 8 Echter, het protocol voor het bereiden van mica substraten en het storten en het spoelen van de origami wordt vaak niet expliciet beschreven in gepubliceerde manuscripten. 9 Zonder een duidelijk protocol, kunnen reproduceerbare resultaten moeilijk te verkrijgen zijn.
Mica is een isolator, dus het is niet geschikt als een substraat voor sommige toepassingen in de nano-elektronica. Silicon gepassiveerd met een dunne inheemse oxide heeft gewenste elektronische eigenschappen, met inbegrip van de compatibiliteit met eerdere gratis Metal-Oxide Semiconductor (CMOS) verwerking input / output structuren en topografische kenmerken creëren. Silicium wafers opgeslagen in de lucht worden gepassiveerd met ofwel een dikke thermisch oxide of dunne inheemse oxide film die relatief vies, met een hoge deeltjes tellen. Silicium oxide heeft een veel lagere oppervlakladingsdichtheid dan mica en de ladingsdichtheid is sterk afhankelijk oxide voorbereiding en geschiedenis. Bij magnesium ion concentratie above 150 mM, goede dekkingen (tot 4 / um 2) van rechthoekige DNA origami kan worden bereikt op zuurstofplasma behandeld silicium substraten; echter kan deze concentratie en dekking veranderen afhankelijk van de grootte en het ontwerp van de nanostructuren worden gebruikt. 10 Een alternatief protocol voor het afstemmen van de oppervlaktelading is een kationisch zelf samengestelde monolaag van 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTES) (Figuur 1B) hechten aan het oxyde. Het primaire amine op APTES kan worden geprotoneerd bij pH-waarden lager dan 9, modificeren van de lading en hydrofobiciteit van het substraat. 11 Voor een volledige monolaag van APTES met succes worden gedeponeerd, dient het silicium geschikt worden gereinigd met Radio Corporation of America (RCA) protocols . Deze protocollen zijn onder andere behandelingen in ammoniumhydroxide en waterstofperoxide oplossingen (RCA1) om organische resten en deeltjes verontreinigingen te verwijderen. Beknopte etch in waterig fluorwaterstofzuur verwijdert de natuurlijke oxidelaag metionische contaminanten die zich aan het oxide. Tenslotte worden de monsters blootgesteld aan een chloorwaterstofzuur en waterstofperoxideoplossing (rca2) metalen en ionische verontreinigingen te verwijderen en een dunne, uniforme oxidelaag. 12 meeste cleanrooms zijn kappen aangewezen CMOS reinigingsprotocollen, strikte regels wat kan worden gebruikt in deze gebieden. Een veel voorkomend probleem komt in de vorm van ionen zoals natrium, die de elektronische eigenschappen van CMOS structuren kunnen verstoren door het creëren midbandgap vallen. 13 ionen algemeen in DNA origami voorbereiding en depositie buffers CMOS baden kunnen vervuilen en leiden tot problemen voor andere onderzoekers die de clean room. Daarom onze groep een "vuile" CMOS reinigen bench specifiek ingericht voor de kleine monsters gebruikt voor DNA origami onderzoek. Dit proces is een goed alternatief voor de traditionele cleanroom set-up en kan geschikt zijn voor laboratoria die geen toegang hebben tot een cleanroom CMOS bank hoeft te hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Experiment Planning en Materiaal Voorbereiding
- Bepaal het ontwerp, concentratie en functionaliteit van het DNA origami die wordt gebruikt in de experimenten. 14-16 Hier gebruiken we een DNA Origami rechthoekontwerp bereid in 1 x TAE / Mg2 + oplossing (40 mM Tris-base, 20 mM azijnzuur, 2 mM EDTA en 12 mM magnesiumacetaat, pH 8,0). 17
- Autoclave alle tips, buizen en containers te gebruiken. Deze materialen moeten allemaal autoclaaf compatibel.
- Bereid een toevoer van steriel water voor het spoelen. Vul een steriele pot met ongeveer 500 ml van 18 MQ x cm water, plaats op een kookplaat, koken gedurende 5 min met de dop eraf, en neem de pot af van de kookplaat en laat afkoelen met het deksel geplaatst op de container, maar niet aangescherpt . Bewaar in de koelkast en voor te bereiden een nieuwe voorraad elke maand of wanneer nodig.
2. Voorbereiden van de Mica Substrate
- Cut substraten om de juiste grootte (1 cm x 1 cm vierkanten) met een schaar. Mica is dun en broos. Ook de aankoop van mica in disc vorm die niet nodig te snijden.
- Klieven het mica met dubbelzijdig tape. Mica is opgebouwd uit lagen van mineralen gescheiden door intercalerende ionen, kan elke laag worden afgepeld wanneer gehecht aan dubbelzijdige tape. 18
- Plaats de mica vierkantjes op de dubbelzijdige tape nog in de tape dispenser, zorg ervoor dat het stevig wordt vastgehouden aan de tape. Schuif de pincet tussen de mica en de tape, wordt de bovenste laag verwijderd worden en blijven op de tape. Onmiddellijk na het verwijderen, zal de mica plein heeft zijn schone kant naar beneden. Zorg ervoor dat de mica omdraaien voordat u in een container.
- Herhaal dit 3-4 keer om volledige verwijdering van de bovenste laag en goed kunnen worden schoongemaakt waarborgen.
- Ook houden de mica op een container of table-top met een stukje dubbelzijdige tape en gebruik een tweede stuk op saankruisen om en trek de top de meeste mica laag. De mica behoren is gereinigd in beide gevallen, hoewel de alternatieve methode afzetten DNA en spoelen en drogen van het monster bemoeilijkt door de tweede hechting aan de drager.
3. Deponeren DNA Origami op Mica
- Kortom, meng de flacon DNA origami met behulp van een vortex mixer om ervoor te zorgen zelfs verspreiding van nanostructuren in oplossing.
- Pipet 4 ul van oplossing op de mica, ervoor te zorgen dat de pipetpunt de ondergrond niet raakt. Laat de DNA-origami op de mica ongeveer 10 min om een adequate dekking te verzekeren. De afzettingstijd varieert afhankelijk van de concentratie van DNA origami gebruikt evenals de gewenste dekking (figuren 2 en 3).
- Spoel de DNA-origami oplossing off van de mica ondergrond met 100 ul steriel water over een wastafel of een andere vloeistof bakje. Pak de mica met een pincet. Pipet het water op desubstraat, met de stroom van de druppel naar de punt van de pincet. Schud de mica met een scherpe beweging naar beneden om het overtollige water te verwijderen. Houd de pincet rechtop zodat het water stroomt naar de pincet om verontreiniging van het monster te voorkomen.
- Droog het substraat met een gestage stroom stikstof (N 2) gedurende 1 min. Zorg ervoor dat het overtollige water wordt verwijderd. Herhaal de spoelen met een extra 100 pl steriel water. Droog het substraat met N2 gedurende nog eens 3 minuten. Een droog oppervlak noodzakelijk voor succesvolle atomic force microscopy (AFM) analyse (Figuur 4).
- Analyseer de ondergrond met behulp van AFM of op te slaan in een afgesloten container.
4. CMOS / Silicon Cleaning Set-up
- LET OP: Bij gebruik van de CMOS-set-up, het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen te allen tijde. De reagentia omvatten sterke zuren, sterke basen, fluorwaterstofzuur (HF), en sterk oxiderende middelen die can reageren met afval oplosmiddelen als reagentia worden niet goed afgevoerd. Houd u aan de volgende veiligheidsmaatregelen:
- Huis van de CMOS-bank in een chemische kap met geen andere processen of set-ups.
- Draag nitril handschoenen, laboratoriumjas, veiligheidsbril, grote industriële nitril, een lekkage schort, en gezichtsbescherming te allen tijde bij het gebruik van de CMOS bank.
- Gebruik plastic kuipjes als secundaire containment wanneer oplossingen worden bereid.
- Gebruik een inert gefluoreerde polymeren maatbeker voor de behandeling van de geconcentreerde HF.
- Maak calciumgluconaat zalf verkrijgbaar als eerste hulp voor eventuele blootstelling van de huid.
- Laat alleen goed opgeleid personeel om het proces uit te voeren.
- Zorg er altijd voor een ander lid van het lab aanwezig is in geval van nood is.
- Houd MSDS informatie voor alle stoffen in de buurt van de kap.
- Bekend zijn met de instelling of chemische morsen en belichting beleid bedrijf.
Opmerking: HF doordringt gemakkelijk huiden een calcium wegvangend middel, inwerkend op de botstructuur en beschadigen zenuwen als de blootstelling plaatsvindt. Dermale blootstelling aan enkele milliliters geconcentreerd fluorwaterstofzuur kan gevaarlijk en zelfs dodelijk zijn. Vestigen nodige voorzorgsmaatregelen om blootstelling komt niet voor zorgen.
- Voer RCA1 en rca2 in een aparte 250 ml glazen bekers op aparte kookplaten. Elke beker zou een roerstaafje bevatten. Monitor de temperatuur van de oplossing met behulp van thermometers geklemd zodat de roerstaaf niet bang in de lamp. Bedek de maatcilinders met een horlogeglas om de effecten van verdamping te verminderen.
- RCA1 Voorbereiding
- Plaats 50 ml van 18 MQ x cm water in de aangewezen RCA1 beker met behulp van een maatbeker.
- Voeg 15 ml geconcentreerd ammoniumhydroxide (NH4OH) aan de beker. Spoel de maatbeker met 25 ml water en voeg het spoelwater naar de RCA1 bekerglas.
- Zet de warmte en roerder op een verwarmingsplaat en breng de RCA1 bad tot 70 ° C. Voeg 15 ml van 30% waterstofperoxide (H 2 O 2) aan de RCA1 bekerglas. Gebruik RCA1 oplossing binnen 1 uur na de H 2 O 2 is toegevoegd. Het bad kan meerdere malen worden gebruikt binnen de tijdspanne van drie dagen of 15 ml peroxide wordt telkens aan het bad toegevoegd.
- Spoel de maatbeker grondig met water en het spoelwater weggooien in een geschikte fles RCA1 afval.
- Rca2 Voorbereiding
- Voeg 70 ml van 18 MQ x cm water naar de aangewezen rca2 beker met behulp van de grondig gespoeld maatbeker.
- Voeg 15 ml geconcentreerd zoutzuur (HCl). Spoel de maatbeker met 20 ml water en voeg deze toe aan de rca2 beker.
- Verhoog het vuur en roer snelheid van de kookplaat tot de oplossing 70 ° C bereikt.
- Voeg 15 ml 30% H 2 O 2. Net als de RCA1 bad, gebruiken deze oplossing binnen 1 uur vanaf het moment dat de H 2 O 2 wordt toegevoegd; Bovendien, het badkan meerdere keren worden hergebruikt binnen de tijdspanne van drie dagen of 15 ml H 2 O 2 wordt toegevoegd voor elk gebruik.
- HF oplossing Bereiding
- Plaats 50 ml water in een inert fluorpolymeer bekerglas.
- Maatregel 4 ml geconcentreerd fluorwaterstofzuur (49%) in de plastic maatbeker toevoegen aan de inert fluorpolymeer bekerglas.
- Spoel de plastic maatbeker met een totaal van 50 ml water, het toevoegen van het spoelwater naar het HF beker. Was de maatbeker grondig met water en gooi de wassingen in een aangewezen HF afvalcontainer.
5. Voorbereiden en reinigen van de Silicon Substrate
- Het snijden van silicium wafers in chips
- Identificeer de loodrechte en parallelle rooster aanwijzingen op het vlakke gepolijste oppervlak van het silicium wafer. Deze aanwijzingen worden gebruikt om te helpen klieven pleinen makkelijker. De volgende instructies behoort tot cleaving silicium <110> en kunnen niet geschikt zijn voor andere kristal oriëntaties.
- Plaats het silicium wafer gepolijste-side-up op een zachte ondergrond, zoals een servet. Met behulp van de schrijver pen-diamant getipt voorzichtig nick de bodem van de wafel langs de primaire vlakke rand. Plaats een dunne draad, zoals een paperclip, onder de inkeping en zachtjes druk uitoefenen op de wafer door het plaatsen van de vingers of een pincet aan weerszijden van de inkeping en naar beneden te duwen. Door dit te doen zal de wafer te scheiden in twee helften langs de kristalrooster lijn in de natuurlijke aanhangen richting.
- Op een servet, een potlood en liniaal de gewenste breedte van de kwadraten van markering stippen op zowel de bovenkant als de onderkant van het verband. Verbind deze punten met rechte lijnen. Dit zal dienen als leidraad voor zelfs vierkante vormen.
- Plaats een van de wafer halveert rand eerst tussen de gemeten lijnen op het servet gespoeld tegen de lijn en herhaal de in stap 5.1.2 De vers gebroken loodrecht pieces moet nu de breedte van de gesplitste vierkanten. Zet de wafer horizontaal op het servet. Plaats het tussen de loodlijnen en herhaal het proces in stap 5.1.2.
- Bewaar de vers gesplitst wafer chips in een schone flesje gevuld met DI water om krassen te voorkomen. De siliconen chips kan onbeperkt worden opgeslagen, maar moeten worden gereinigd voordat experimenten.
- CMOS Reiniging van Silicon
- Wanneer de RCA1 oplossing de juiste temperatuur heeft bereikt, dompel acht tot tien 1 cm x 1 cm siliciumchips in de oplossing onder toepassing van een inert fluorpolymeer mand met een diameter 2 '. Bubbles van zuurstof op de chips en beker wanden vormen. Zo neen borrelen optreedt, de H 2 O 2 is afgebroken. Laat de chips in de oplossing gedurende 10 tot 20 minuten, roeren van de mand omhoog en omlaag om de paar minuten de chips niet aan elkaar plakken.
- Til de mand met het silicium chips en goed uitlekken. Beweeg de mand over to het afval beker en goed naspoelen met 18 MQ x cm water. Onder te dompelen in de was beker en schudden op en neer voor de 20 sec. Giet de mand en goed naspoelen met water over het afval beker. Leeg het afval beker in een aangewezen RCA1 fles afval en vullen met water.
- Nadat RCA1 reinigen is voltooid, zet het mandje in de 1:50 HF bekerglas gedurende 10-20 sec. Gebruik een zachte op en neer beweging om de chips en HF mengen. Til de dunk emmer om de HF volledig weglopen.
Opmerking: De chip oppervlakken hydrofoob zijn; water zal niet nat van de chip, maar in plaats daarvan vormen druppels met een hoge contact hoeken. Dit geeft aan dat het siliciumoxide is weggeëtst en de chip nu eindigt op Si-H bindingen. - Plaats het wassen beker en spoel beker in een plastic bak, zet de mand over de spoeling beker en spoel af met 18 MQ x cm water. Dompel het mandje in de was beker en schud gedurende 20 sec.
- Vul een tweede afvoer en rinse cyclus met 18 MQ x cm water. Dump het waswater in de spoeling beker en vul de beker te wassen met water. Giet al het afval in een aangewezen plastic fles HF afval.
- Wanneer de rca2 oplossing de juiste temperatuur heeft bereikt, onderdompelen siliciumchips in de oplossingen met de korf. Laat de oplossing gedurende 10 tot 20 min. De chip zal nu hydrofiel door groei van een dunne (1-2 nm) oxide film.
- Verwijder na de juiste hoeveelheid tijd en volgen dezelfde spoelen procedures als voor RCA1. Gooi het afval in de juiste rca2 afvalcontainer. Verwijder elke chip uit de mand met plastic pincet, spoelen met water, en blaas droog met stikstof.
- Store chips in een plastic wafer doos of in een flacon van 18 MQ x cm water. Het silicium wordt schoon blijven wanneer ze worden bewaard in het water voor ongeveer drie dagen na het schoonmaken. Zorg ervoor dat het werkgebied goed wordt opgeruimd en de buitenkant van de CMOS handschoenen zijn gewassen. Laat de CMOS handschoenen in de kap te drogen.
6. Deponeren DNA Origami op APTES-gefunctionaliseerde Silicon
- Zelf geassembleerde Monolayer Formation on Silicon
- Warm APTES naar RT vóór opening. Als de fles te koud is, kan condensatie optreden, waardoor hydrolyse van het APTES tijdens opslag. Voeg 1980 ul van 18 MQ x cm water en 20 ul van APTES om een schone scintillatieflesje en krul te mengen. Gebruik deze oplossing onmiddellijk.
- Plaats een gereinigde silicium chip reflecterende-side-up in de scintillatieflesje, cap, en laat zitten voor 20 min. Verwijder de chip met een pincet en spoel met 200 pl water en droog gedurende 1 minuut met een stroom N2.
- Deponeren DNA origami op APTES Gefunctionaliseerde Silicon
Opmerking: De stappen voor het afzetten DNA origami op gefunctionaliseerde siliconen zijn dezelfde als voor het afzetten op mica.- Kort meng de DNA-origami flacon en de pipet 4 ul van oplossingop het siliciumsubstraat. Vergroot zonodig de hoeveelheid DNA origami is gebruikt voor het gehele dakvlak als gefunctionaliseerde silicium meer hydrofoob is dan de mica substraat. Gebruik een glazen afdekplaat slip naar beneden op de depositie oplossing en verdamping tijdens lange afzettingen te voorkomen.
- Laat de oplossing staan voor de hoeveelheid tijd die nodig is voor de toegepaste concentratie en de gewenste bereik (zie figuren 2 en 3 voor het effect van tijd en concentratie op oppervlaktebedekking). Spoel het substraat met 100 ul steriel 18 MQ x cm water en droog met N 2 voor 1 min.
- Herhaal het spoelen met een additionele 100 pl steriel water en droog het substraat met N2 3 min.
- Bewaar het monster in een schone container tot verdere experimenten of beeldvorming kan worden uitgevoerd. Monsters beginnen deeltjes accumulatie zien na ongeveer 1-2 weken opslag afhankelijk van much deze worden gehanteerd.
7. AFM beeldvorming en beeldanalyse van DNA Origami Monsters
- Gebruik AFM in Tapping mode in de lucht voor de beeldvorming doeleinden. Tapping mode zodat veel kracht wordt uitgeoefend op de fragiele nanostructuren, tegenover contactmode.
Opmerking: De beeldvormende parameters afhankelijk van het instrument. Alle foto's gepresenteerd werden gevangen met behulp van een MultiMode NanoScope IIIa. - Selecteer AFM probes voor contactloze / tapping mode in lucht, goud reflecterende coating, een resonante frequentie (nominaal) van ~ 300 kHz, krachtconstante 40 N / m, en tandpuntreikwijdte <10 nm.
- Proces en de AFM beelden met behulp NanoScope Analysis Software analyseren. Voer dekking berekeningen met behulp van ImageJ. 19
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Twee variabelen bepalen de dekking van DNA origami op de ondergrond: oplossing concentratie en belichtingstijd. De adsorptie-eigenschappen van DNA origami op mica en APTES gefunctionaliseerd silicium- oxide zijn eerder gerapporteerd. 13 De verhouding tussen de concentratie van DNA origami in de neerslagoplossing en de uiteindelijke dekkingen on mica zijn samengevat in tabel 1 en figuur 2, met toenemende concentratie results in de berichtgeving. De tijd-afhankelijkheid van binding is te zien in figuur 3. Surface dekking was eerder bestudeerd om de binding gedrag van de DNA-origami op mica en gewijzigd siliciumoxide oppervlakken kwantificeren. DNA origami in 12 mM magnesium in 1 x TAE buffer 83,3% ± 3,1% dekking op mica na 30 min absorptietijd aan de oppervlakte. Maximale dekking op siliciumoxide gemodificeerd met APTES SAMs wordt waargenomen na 60 min, hetgeen minder is dan de maximale dekking op mica. EENlangere depositie tijd nodig is als er een hoge oppervlakte dekking is vereist op APTES gefunctionaliseerde siliciumoxide.
Er zijn verschillende variabelen die een slechte monsterpreparatie kan veroorzaken. Het meest lastige is onvoldoende spoelen en drogen. Indien de bufferoplossing niet goed gespoeld, grote aggregaten op het substraat (Figuur 4A). 'DNA-origami-eilanden' worden waargenomen wanneer de nanostructuren zich aan flarden van magnesium zouten aan het oppervlak (Figuur 4B). Tenslotte hoge dekking samples, kan overtollige buffer componenten overbruggen tussen afzonderlijke DNA Origami (Figuur 4C), waardoor het moeilijk is om nanostructuren met AFM onderscheiden zijn. Deze resultaten kunnen worden vermeden door na grondig spoelen en drogen protocol voor zowel mica en silicium substraten.
Vorming van APTES films op siliciumoxide substraten kunnen problemen en opleveren. Silicium wafers hebben eenruwe laag siliciumoxide die moeten worden verwijderd en een gladdere, dunnere laag siliciumoxide hervormd voordat het kan worden gefunctionaliseerd. Een goed schoongemaakt siliciumsubstraat wordt geïllustreerd in figuur 5A. Tijdens het reinigen van de silicium wafer, is het belangrijk dat het aantal siliciumchips niet te hoog, aangezien het mogelijk dat twee chips te worden geplakt aan elkaar blokkeert blootstelling aan de reagentia (Figuur 5B). Als schoongemaakt silicium is opgeslagen in 18 x MQ cm water voor meer dan een week, zal de verontreiniging layer hervormen en recleaning noodzakelijk. De APTES aanbod kan ook problemen met monstervoorbereiding veroorzaken. APTES gemakkelijk polymeriseert door middel van hydrolyse, die de basis voor de monolaag vormen. 20 De mate van polymerisatie is afhankelijk van de concentratie van water dat de APTES blootstaat. Na verloop van tijd en door herhaald gebruik, is het mogelijk om water te condenseren in de APTES fles verontreinigenvoeding. De resulterende polymerisatie geeft grote aggregaten die zich aan het substraat (Figuur 5C). De toegenomen ruwheid en de aanwezigheid van aggregaten maakt het identificeren van DNA nanostructuren met behulp van AFM moeilijk. Het is een goede gewoonte om de APTES fles te slaan in een plastic zak in de koelkast, en laat de APTES fles warm RT vóór de opening om condensatie te voorkomen.
Figuur 1. Een schematische vergelijking van de binding mechanisme voor DNA origami op (A) mica en (B) APTES gefunctionaliseerd silicium- oxide (niet op schaal). Binding met mica wordt gemedieerd door de aanwezigheid van divalente kationen, gewoonlijk Mg2 +. Een monolaag van het geprotoneerde amine beëindigde 3-aminopropyltriethoxysilaan wordt toegepast om de hechting op het siliciumoxide-substraat te bevorderen.
<img alt = "Figuur 2" src = "/ files / ftp_upload / 52.972 / 52972fig2highres.jpg" width = "700" />
Figuur 2. AFM afbeeldingen illustreren variabele dekking na 10 min afzettingen van (A) 2 nM, (B) 4 nM, en (C) 6 nM on mica. De lengte niveau voor alle afbeeldingen is 5 nm.
Figuur 3. Trends in oppervlak dekking voor 2 nM DNA-origami in 1x TAE buffer, 12 mM Mg 2+. MICA = paarse lijn en cirkel markers, APTES = gele lijnen en driehoek markers. N = 3 in de bepaling van de standaard fout.
Figuur 4. Slechte spoelen en drogen kan (A) oplossing aggregatie op het substraat, (B) DNA origami eilanden, en (C) overbruggen van nanostructuren op veroorzakenhoge dekkingsgraad monsters in de aanwezigheid van overmaat buffer zouten. De lengte niveau voor alle afbeeldingen is 5 nm.
Figuur 5 (A) Clean silicium moet RMS ruwheid minder dan 0,5 A gedurende 1 vierkante micron. Een complete APTES SAM afgezet op een goede natuurlijke oxide moeten een RMS ruwheid van minder dan 1 Å dan 1 vierkante micron. (B) APTES film gevormd op een onvolledig gereinigde siliciumoxide met RMS ruwheid van 2,29 nm meer dan 1 vierkante micron. . Let op de lacunes en ruwheid van de APTES film (C) APTES oppervlak gevormd uit een steekproef van APTES besmet met gecondenseerde afval; hydrolyse in de APTES fles vormen grote deeltjes. De hoogte schaal voor alle beelden is 5 nm.
Tabel 1. Percentage dekking metingen voor mica ondergronden met varying DNA concentraties origami-oplossing. Alle depositie tijden zijn 10 min.
| DNA Origami Solution | % Dekking op Mica Substrate |
| 2 nM | 8,49 ± 2,67 (n = 5) |
| 4 nM | 55,89 ± 5,65 (n = 3) |
| 6 nM | 77,44 ± 1,89 (n = 4) |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende stappen die moeten worden benadrukt om consistente en ideaal resultaten te bereiken. Voor mica monsters, na een streng en grondig spoelen en drogen van het regime, zoals in de stappen 3.3 en 3.4, zal ervoor zorgen dat de beelden van hoge kwaliteit van de afzonderlijke DNA-origami kan worden bereikt met behulp van AFM zonder de verschillende problemen die in de Representatieve resultaten sectie. Van primair belang voor silicium monsters is de netheid van de ondergrond. Volgens de reinigingsprocedures beschreven in stap 5,2 grondig en zorgvuldig zal ervoor zorgen dat een geschikt gereinigde siliciumoxyde oppervlak wordt bereikt. Bovendien, het bewaken van de kwaliteit en effectiviteit van chemicaliën, zoals waterstofperoxide, waterstoffluoride en APTES, zal ervoor zorgen dat de procedure loopt.
De beschreven technieken zijn niet beperkt tot waterige oplossingen van APTES. Een gemengde monolaag van APTES en trimethylaminopropyltrimethoxysilyl (TMAC) kunnen onsed afstemmen het oppervlak silicium lading en bevorderen variabele DNA origami adhesie. 11 De TMAC bevat een vast aansluitpunt geladen quaternair amine -N (CH3) 3+, in vergelijking met de pH-afhankelijke lading op APTES. Omdat de oplossingenaanbod laat de protonering toestand of de lading van TMAC, variëren de oplossingsconcentratie van TMAC can tune de oppervlaktelading van de gemengde monolaag en laat de interactie tussen het substraat en de DNA origami. Optimale DNA origami binding werd waargenomen voor monolagen met een oppervlaktelading van 0,75-1,5 kosten / nm 2, wat overeenkomt met SAMs die 100% tot 40% TMAC concentratie. Deze optimale oppervlakte lading gevraagd DNA-origami dekkingen van ongeveer 110 origami / um 2 op APTES SAM en 120 origami / um 2 op TMAC SAM.
Een voordeel van silicium is de compatibiliteit met lithografische patroonvorming processen. Hoge magnesiumconcentraties kunnen worden gebruikt met plasma behandelde siliciumoxiden selectieve binding van DNA origami bevorderen silicium. Voorzichtigheid is geboden bij het verwijderen van het monster uit de neerslagoplossing te voorkomen spoelen magnesiumionen afstand en vervormen van het DNA Origami. 21-22 De werkwijze APTES vormen covalent kationen op het siliciumoxideoppervlak, zodat wassen of spoelen met buffer of water reageert het bijgevoegde DNA origami niet beschadigen. De 'moleculaire lancering' methode is een andere mogelijke route voor de patroonvorming van silicium substraten en het bevorderen van DNA-origami hechting. Het siliciumsubstraat wordt gevormd middels electron beam lithografie en APTES wordt afgezet op het blootgestelde substraat. Na lancering van de fotoresist, kan DNA origami worden afgezet op het gevormde oppervlak, bij voorkeur binding aan de APTES. 23
De interactie van DNA-origami met een substraat verandert de stabiliteit, het openen van nieuwe wegen voor onderzoek en toepassingen. DNA origami nageleefd mica kunnen zonder zichtbare verandering van nanostructuur afmetingen en minimale chemische veranderingen tot 150 ° C verwarmd. 24 Dit staat in schril contrast met de kwetsbaarheid van DNA origami in oplossing, waarbij de nanostructuren compleet boven 70 ° C. 25 dehybridized, 26 Dit evenwicht wordt ondersteund op verhitte substraten siliciumoxide. 27 Ook in diverse oplosmiddelsystemen, zoals hexaan, tolueen en ethanol, de vorm en de dekking van de nanostructuren worden gehandhaafd. De verrassende stabiliteit van DNA origami geeft aan dat toepassingen die voorheen gedacht onverenigbaar zoals plasma versterkte opdampen, gebruik van gemeenschappelijke fotoresists en oplosmiddelen en unieke chemische depositie omgevingen kan worden gebruikt in combinatie met DNA origami. Echter, of het DNA Origami behouden hun functionaliteit is nog onbekend en kunnen toepassingsmogelijkheden beperken.
Hoewel de stabiliteit van DNA origami bij verhoogde temperatuurs en een beperkt aantal oplosmiddelsystemen is bepaald, de langetermijnstabiliteit van DNA origami op substraten is nog onbekend. Het gebruik van steriele technieken is noodzakelijk om mogelijke verontreiniging te voorkomen, maar dit kan niet worden vermeden na oppervlak neerslaan. Beeldvorming en analyse moet vrijwel direct na monstervoorbereiding worden afgerond; als het monster wordt opgeslagen te lang (meer dan een week) verschillende voorbeelden van het monster degradatie worden vaak geïdentificeerd, met inbegrip van deeltjes accumulatie en gebroken DNA nanostructuren. Mogelijke onderzoek lanen in nano-elektronica, biosensoren en andere substraat gebaseerde DNA-origami-toepassingen kan worden beperkt door tijdsafhankelijke destabilisatie van het DNA. Het identificeren van de beperkingen van deze technieken voor toepassingen die een stabiliteit gedurende langere tijd moet verder worden onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μl | VWR International, LLC | 22491733 | 10 reload tray of 96 tips |
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR International, LLC | 87003-290 | 0.65 ml, natural |
| Research Plus Pippete - Single Channel - 20-200 μl | A. Daigger & Company, Inc. | EF8960F-3120000054 EACH | Adjustable Volume |
| Research Plus Pippete - Single Channel - 2-20 μl | A. Daigger & Company, Inc. | EF8960D-3120000038 EACH | Adjustable Volume |
| Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape | Office Depot, Inc. | 602710 | 3/4" x 300", Pack of 2 |
| Vortex Mixer | Thermo Scientific | M37610-33Q | |
| Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm | Electron Microscopy Sciences | 64917-2 | 6 per pack |
| 6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat | Nova Electronic Materials, Ltd. | GC49266 | |
| Powder-Free Nitrile Examination Gloves | VWR International, LLC | 82062-428 | Catalog number is for size large |
| High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating | K-Tek Nanotechnology, Inc. | HA_NC/15 | |
| Autoclave Pan | A. Daigger & Company, Inc. | NAL692-5000 EF25341C | |
| Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch - 1 dz | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | 106-15055 | Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves. |
| Tweezers PTFE 200 mm Square | Dynalon Corp. | 316504-0002 | |
| Muscovite Mica Sheets V-5 Quality | Electron Microscopy Sciences | 71850-01 | 10 per pack |
| Mica Disc, 10 mm | Ted Pella, Inc | 50 | Mica discs are optional |
| Scriber Diamon Pen for Glassware | VWR International, LLC | 52865-005 | |
| Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap - 20 ml | VWR International, LLC | 66022-060 | Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner |
| 4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz | Dot Scientific, Inc. | 6759-200 | |
| Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth | VWR International, LLC | 89043-554 | Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached |
| Standar-Grade Glass Beaker, 250 ml Capacity | VWR International, LLC | 173506 | |
| Beakers, PTFE | VWR International, LLC | 89026-022 | For use with HF |
| Shallow form watch glass, 3" | VWR International, LLC | 66112-107 | Case of 12 |
| Plastic Storage Container | VWR International, LLC | 470195-354 | For secondary container |
| General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers | VWR International, LLC | 89095-564 | |
| High precision and ultra fine tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78310-0 | |
| Polycarbonate Faceshield | Fisher Scientific, Inc. | 18-999-4542 | |
| Neoprene Apron | Fisher Scientific, Inc. | 19-810-609 | |
| Calcium Gluconate, Calgonate | W.W Grainger, Inc. | 13W861 | Tube, 25 g |
| Hydrogen Peroxide 30% CR ACS 500 ml | Fisher Scientific, Inc. | H325 500 | HARMFUL, TOXIC |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | Gelest Inc. | SIA0610.0-25GM | Let warm to room temperature before use. |
| Ammonium hydroxide, 2.5 L | Fisher Scientific, Inc. | A669-212 | HARMFUL, TOXIC |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific, Inc. | A144-212 | HARMFUL, TOXIC |
| Hydrofluoric acid | Fisher Scientific, Inc. | A147-1LB | HARMFUL, TOXIC |
| MultiMode Nanoscope IIIa | Veeco Instruments, Inc. | Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis | |
| Dunk basket | Made in lab | Made in lab | The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws. |
References
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
- Anderson, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459, 73-77 (2009).
- Wang, Z., Ding, B. Engineering DNA Self-Assemblies as Templates for Functional Nanostructures. Acc. Chem. Res. 47, 1654-1662 (2014).
- Xu, K., et al. Graphene Visualizes the First Water Adlayers on Mica at Ambient Conditions. Science. 329, 1188-1191 (2010).
- Bustamante, C., et al. Circular DNA-molecules imaged in air by scanning force microscopy. Biochemistry. 31, 22-26 (1992).
- Hsueh, C., et al. Localized Nanoscopic Surface Measurements of Nickel-Modified Mica for Single-Molecule DNA Sequence Sampling. ACS Appl Mater. Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Pastre, D., et al. Anionic polyelectrolyte adsorption on mica mediated by multivalent cations: A solution to DNA imaging by atomic force microscopy under high ionic strengths. Langmuir. 22, 6651-6660 (2006).
- Woo, S., et al. Self-assembly of two-dimensional DNA origami lattices using cation-controlled surface diffusion. Nature Communications. 5, 4889 (2014).
- Vesenka, J., et al. Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope. Ultramicroscopy. 42-44, 1243-1249 (1992).
- Adsorption studies of DNA origami on silicon dioxide. Albrechts, B., et al. 21st Micromechanics and Micro Systems Europe Workshop 2010, , (2010).
- Sarveswaran, K., et al. Adhesion of DNA Nanostructures and DNA Origami to lithographically patterned self-assembled monolayers in Si[100]. Proc. of SPIE-Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M-1 (2010).
- Kern, W., Puotien, D. A. Cleaning solutions based on hydrogen peroxide for use in silicon semiconductor technology. RCA Rev. 31, 187-206 (1970).
- Pillers, M., Goss, V., Lieberman, M. Electron-Beam Lithography and Molecular Liftoff for Directed Attachment of DNA Nanostructures on Silicon: Top-down Meets Bottom-up. Acc. Chem. Res. 47, 1759-1767 (2014).
- Saccá, B., Niemery, C. M. DNA Origami: The Art of Folding DNA. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 58-66 (2012).
- Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37, 5001-5006 (2009).
- Ben-Ishay, E., et al. Designing a Bio-responsive Robot from DNA. Origami. J. Vis. Exp. (77), e50268 (2013).
- Woo, S., et al. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nature Chemistry. 3, 620-627 (2011).
- Schlegel, M. L., et al. Cation sorption on the muscovite (001) surface in chloride solutions using high-resolution X-ray reflectivity. Geochim. Cosmochim. Acta. 70, 3549-3565 (2006).
- Rasband, W. S., Howarter, J. A., et al. National Institutes of Health. Langmuir. 22, Bethesda, Maryland, USA. 11142-11147 (2006).
- Kershner, R. J., et al. Placement and orientation of individual DNA shapes on lithographically patterned surfaces. Nature Nanotechnology. 4, 557-561 (2009).
- Hung, A. M., et al. Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed by lithographically confined DNA origami. Nature Nanotechnology. 5, 121-126 (2010).
- Sarveswaran, K., et al. et al.Adhesion of DNA nanostructure and DNA origami to lithographically patterned self-assembled monolayers on Si[100. Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M (2010).
- Pillers, M. A., Lieberman, M. Thermal stability of DNA origami on mica. J. Vac. Sci. Technol. B. 32, 040602 (2014).
- Song, J., et al. Direct Visualization of Transient Thermal Response of a DNA. Origami. J. Am. Chem. Soc. 134, 9844 (2012).
- Wei, X., et al. Mapping the thermal behavior of DNA origami nanostructures. J. Am. Chem. Soc. 135 (16), 6165-6176 (2013).
- Hyojeong Kim,, et al. Stability of DNA Origami Nanostructures under Diverse Chemical Environments. Chem. Mater. 26, 5265-5273 (2014).
