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Chemistry

डीएनए origami विश्लेषण और प्रयोगों के लिए मीका और सिलिकॉन substrates की तैयारी

doi: 10.3791/52972 Published: July 23, 2015

Introduction

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पहली बार 2006 में शुरू की, डीएनए origami डीएनए oligonucleotides के स्वयं कोडांतरण प्रकृति designable और अत्यधिक आदेश दिया है nanostructures निर्माण करने के लिए इस्तेमाल करता है। संरचनाओं के असंख्य सूचित किया गया है 1, स्माइली 3-आयामी बक्से latched करने के लिए चेहरे से लेकर। 2 डीएनए origami क्रियाशील किया जा सकता है विभिन्न biomolecules और nanostructures, साथ nanoelectronics, चिकित्सा, और क्वांटम कंप्यूटिंग में अनुसंधान अनुप्रयोगों को जन्म दे रही है। 3 हालांकि, विश्लेषण और कई भविष्य के आवेदनों न केवल संरचनात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है, लेकिन यह भी सतहों के लिए डीएनए origami nanostructures की आसंजन पर हैं। मीका और क्रियाशील सिलिकॉन ऑक्साइड: इस पांडुलिपि में वर्णित विधि substrates के दो प्रकारों पर डीएनए origami नमूनों की तैयारी से संबंधित हैं।

यह 0.02 एनएम ± एनएम 0.37 की एक परत ऊंचाई के साथ, atomically फ्लैट है क्योंकि मीका डीएनए origami पढ़ाई के लिए पसंद की सब्सट्रेट है। 4 यह भी ईएएस हैily नमूना तैयार करने और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) के अध्ययन सरल बनाने, साफ कर दिया। रूसी अभ्रक प्रत्येक दरार विमान में पोटेशियम की एक उच्च घनत्व होता है, लेकिन जब पानी में इन आयनों मीका सतह से दूर फैलाना। अभ्रक सब्सट्रेट करने के लिए डीएनए origami के बंधन में मध्यस्थता करने के लिए, 2 मिलीग्राम + मीका के नकारात्मक आरोप रिवर्स और electrostatically सब्सट्रेट (चित्रा 1 ए) के लिए डीएनए फॉस्फेट रीढ़ बाध्य करने के लिए प्रयोग किया जाता है। Annealed डीएनए के 5 मिश्रण बड़े की उपस्थिति में 2 मिलीग्राम + -terminated सतह के लिए डीएनए origami के आसंजन एकल असहाय oligonucleotides (प्रधान किस्में) के आसंजन की तुलना में ज्यादा मजबूत है, क्योंकि प्रधान किस्में की ज्यादतियों अभ्रक पर उच्च कवरेज और अच्छा चित्र दे। नी 2 + और ​​सह 2 + सहित अन्य सकारात्मक आयनों का आरोप लगाया, अभ्रक पर डीएनए के आसंजन को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 6,7 adhe मध्यस्थता कर सकता है समाधान में monovalent और द्विसंयोजक फैटायनों की एकाग्रता को बदलनाडीएनए origami के सायन और सतह के प्रसार की दर। 8 हालांकि, अभ्रक, substrates तैयारी और जमा करने और ओरिगेमी rinsing के लिए प्रोटोकॉल अक्सर स्पष्ट रूप से एक स्पष्ट प्रोटोकॉल के बिना प्रकाशित पांडुलिपियों में। 9 वर्णित नहीं है, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है।

मीका एक इन्सुलेटर है, तो यह Nanoelectronics में कुछ अनुप्रयोगों के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में उपयुक्त नहीं है। एक पतली देशी ऑक्साइड के साथ passivated सिलिकॉन इनपुट / आउटपुट संरचनाओं और स्थलाकृतिक सुविधाओं को बनाने के लिए पहले मानार्थ धातु ऑक्साइड अर्धचालक (CMOS) प्रसंस्करण के साथ संगतता सहित वांछनीय इलेक्ट्रॉनिक गुण है। हवा में संग्रहीत सिलिकॉन वेफर्स एक मोटी थर्मल ऑक्साइड या एक उच्च कण गिनती के साथ, अपेक्षाकृत गंदा है कि पतली देशी ऑक्साइड फिल्म के साथ या तो passivated कर रहे हैं। सिलिकॉन ऑक्साइड मीका तुलना में काफी कम सतह चार्ज घनत्व है, और चार्ज घनत्व ऑक्साइड तैयारी और इतिहास पर अत्यधिक निर्भर है। मैग्नीशियम में आयन सांद्रता abo150 मिमी है, तो अच्छा कवरेज (4 / माइक्रोन से 2) आयताकार डीएनए origami की ऑक्सीजन प्लाज्मा इलाज किया सिलिकॉन substrates पर प्राप्त किया जा सकता है; बहरहाल, यह एकाग्रता और कवरेज इस्तेमाल किया जा रहा आकार और nanostructures की डिजाइन के आधार पर बदल सकता है। 10 एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल सतह प्रभारी ट्यूनिंग के लिए करने के लिए 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) (चित्रा 1 बी) के एक धनायनित आत्म इकट्ठे monolayer देते है ऑक्साइड। APTES पर प्राथमिक एमाइन सब्सट्रेट के प्रभारी और hydrophobicity को संशोधित करने, 9 से नीचे पीएच मान पर Protonated जा सकता है। APTES की एक पूरी monolayer के लिए 11 सफलतापूर्वक जमा किया, सिलिकॉन उचित रूप से अमेरिका के रेडियो निगम (आरसीए) प्रोटोकॉल का उपयोग साफ किया जाना चाहिए । इन प्रोटोकॉल जैविक अवशेषों और कण दूषित पदार्थों को दूर करने के लिए अमोनियम हाइड्रॉक्साइड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान (RCA1) में उपचार शामिल हैं। जलीय Hydrofluoric एसिड के घोल में एक छोटी खोदना के साथ-साथ देशी ऑक्साइड परत को हटाऑक्साइड का पालन करना है कि किसी भी आयनिक दूषित पदार्थों को। अंत में, नमूने एक पतली, वर्दी ऑक्साइड परत धातु और आयनिक दूषित पदार्थों को हटाने और फार्म करने के लिए एक हाइड्रोक्लोरिक एसिड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान (RCA2) के संपर्क में हैं। 12 सबसे cleanrooms के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बारे कड़े नियमों के साथ, CMOS सफाई प्रोटोकॉल के लिए डाकू नामित किया है इन क्षेत्रों में। एक आम समस्या midbandgap जाल बनाने के द्वारा CMOS संरचनाओं के इलेक्ट्रॉनिक गुणों को बाधित कर सकते हैं, जो इस तरह के रूप में सोडियम आयनों के रूप में आता है। 13 आयनों सामान्यतः का उपयोग अन्य शोधकर्ताओं के लिए समस्याओं के CMOS स्नान दूषित और कारण हो सकता है डीएनए origami तैयारी और बयान बफ़र्स में इस्तेमाल किया साफ कमरा। इस कारण से, हमारे समूह एक बेंच की सफाई 'गंदा' CMOS के डीएनए origami अनुसंधान के लिए इस्तेमाल छोटे नमूने के लिए विशेष रूप से व्यवस्था की उपयोग करता है। इस प्रक्रिया में परंपरागत cleanroom सेट अप करने के लिए एक अच्छा विकल्प है और एक cleanroom CMOS के बेंच के लिए पहुँच नहीं है कि प्रयोगशालाओं के लिए उपयुक्त हो सकता है।

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Protocol

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1. प्रयोग योजना और माल की तैयारी

  1. प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाएगा कि डीएनए origami के डिजाइन, एकाग्रता, और कार्यक्षमता का निर्धारण करते हैं। 14-16 यहाँ, हम मिलीग्राम / 2 + समाधान (40 मिमी Tris आधार, 20 मिमी 1x TAE में तैयार एक डीएनए origami आयत डिजाइन का उपयोग एसिटिक एसिड, 2 मिमी EDTA और 12 मिमी मैग्नीशियम एसीटेट, पीएच 8.0)। 17
  2. सभी सुझावों, ट्यूब, और कंटेनरों आटोक्लेव इस्तेमाल किया जाएगा। इन सामग्रियों को सभी संगत आटोक्लेव होना चाहिए।
  3. Rinsing के लिए बाँझ पानी की आपूर्ति तैयार करें। 18 MΩ एक्स सेमी पानी की लगभग 500 मिलीलीटर के साथ एक बाँझ जार भरें, एक hotplate पर जगह है, बंद टोपी के साथ 5 मिनट के लिए फोड़ा, और हॉटप्लेट के बंद जार लेने के लिए और कंटेनर पर रखा लेकिन कड़ा नहीं ढक्कन के साथ शांत करते हैं । फ्रिज में स्टोर और एक नया आपूर्ति हर महीने या जब आवश्यक तैयार करते हैं।

2. मीका सब्सट्रेट की तैयारी

  1. उचित आकार में कटौती करने के substrates (कैंची से 1 सेमी एक्स 1 सेमी वर्ग)। मीका पतली और भंगुर है। वैकल्पिक रूप से, काटने की आवश्यकता नहीं है कि डिस्क के रूप में अभ्रक की खरीद।
  2. डबल पक्षीय टेप का उपयोग मीका फोड़ना। डबल पक्षीय टेप का पालन किया जब मीका आयनों intercalating द्वारा अलग खनिजों की परतों से बना है, प्रत्येक परत से खुली किया जा सकता है। 18
    1. यकीन है कि यह टेप करने के लिए दृढ़ता से पालन किया जाता है, जिससे टेप मशीन में अभी भी दो तरफा टेप पर अभ्रक चौकों रखें। ध्यान से अभ्रक और टेप के बीच चिमटी स्लाइड, सर्वोच्च परत हटा दिया है और टेप पर बने रहने दिया जाएगा। तुरंत हटाने के बाद, अभ्रक वर्ग अपनी साफ पक्ष नीचे का सामना करना पड़ होगा। एक कंटेनर में भंडारण से पहले मीका पर फ्लिप करने के लिए सुनिश्चित करें।
    2. सबसे ऊपर परत और पर्याप्त सफाई के पूरी तरह हटाने सुनिश्चित करने के लिए इस तीन से चार बार दोहराएं।
  3. वैकल्पिक रूप से, डबल पक्षीय टेप का एक टुकड़ा के साथ एक कंटेनर या टेबल टॉप करने के लिए मीका पालन करना और एक दूसरे का टुकड़ा है करने के लिए उपयोगकरने के लिए टिक और शीर्ष सबसे अभ्रक परत छील। वैकल्पिक पद्धति डीएनए जमा करने और rinsing और कारण का समर्थन करने के लिए दूसरा आसंजन के लिए मुश्किल नमूना सुखाने बनाता है, हालांकि मीका ठीक से, दोनों ही मामलों में साफ हो जाएगा।

मीका पर 3. जमा डीएनए origami

  1. संक्षेप में, समाधान में nanostructures के प्रसार भी सुनिश्चित करने के लिए एक भंवर मिक्सर का उपयोग डीएनए origami की शीशी मिश्रण।
  2. पिपेट विंदुक टिप सब्सट्रेट स्पर्श नहीं करता है यह सुनिश्चित करना कि मीका पर समाधान के 4 μl। पर्याप्त कवरेज सुनिश्चित करने के लिए लगभग 10 मिनट के लिए मीका पर डीएनए origami छोड़ दें। बयान समय वांछित कवरेज के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल डीएनए origami की एकाग्रता (आंकड़े 2 और 3) के आधार पर अलग अलग होंगे।
    1. एक सिंक या अन्य तरल गोदाम से अधिक बाँझ पानी के 100 μl का उपयोग कर अभ्रक सब्सट्रेट के बंद डीएनए origami समाधान कुल्ला। चिमटी का उपयोग कर मीका उठाओ। पर पानी पिपेटसब्सट्रेट, चिमटी के सिरे की ओर बूंद के प्रवाह के साथ। अतिरिक्त पानी को निकालने के लिए एक तेज गति नीचे की ओर के साथ अभ्रक हिलाएँ। पानी के नमूने के प्रदूषण से बचने के लिए चिमटी की ओर बहेगा तो यह है कि ईमानदार चिमटी पकड़ो।
  3. 1 मिनट के लिए नाइट्रोजन की एक सतत स्ट्रीम (एन 2) के साथ सब्सट्रेट सूखी। किसी भी अतिरिक्त पानी निकाल दिया जाता है कि सुनिश्चित करें। बाँझ पानी की एक अतिरिक्त 100 μl से कुल्ला दोहराएँ। एक अतिरिक्त 3 मिनट के लिए 2 एन के साथ सब्सट्रेट सूखी। एक पूरी तरह से सूखा सब्सट्रेट सफल परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) विश्लेषण (चित्रा 4) के लिए आवश्यक है।
  4. एक बंद कंटेनर में AFM या दुकान का उपयोग कर सब्सट्रेट का विश्लेषण करें।

/ सिलिकॉन सफाई सेट अप 4. CMOS

  1. चेतावनी: CMOS के सेट-अप का उपयोग करते समय, हर समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें। अभिकर्मकों मजबूत एसिड, मजबूत कुर्सियां, Hydrofluoric एसिड (HF), और जो सीए मजबूत ऑक्सीकरण एजेंट शामिलअभिकर्मकों ठीक से निपटारा नहीं कर रहे हैं तो बेकार सॉल्वैंट्स के साथ प्रतिक्रिया। निम्नलिखित सुरक्षा सावधानियों का पालन करें:
    1. कोई अन्य प्रक्रियाओं या सेट अप के साथ एक रासायनिक हुड में सदन में CMOS बेंच।
    2. CMOS के बेंच का उपयोग करते समय nitrile दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, सुरक्षा चश्मे, बड़े औद्योगिक nitrile दस्ताने, एक फैल एप्रन, और हर समय एक चेहरा शील्ड पहनें।
    3. समाधान तैयार कर रहे हैं जब माध्यमिक रोकथाम के रूप में प्लास्टिक के टब का उपयोग करें।
    4. केंद्रित HF से निपटने के लिए एक निष्क्रिय fluorinated बहुलक मापने बीकर का प्रयोग करें।
    5. किसी भी त्वचा लोगों तक पहुंचाने के लिए प्राथमिक चिकित्सा के रूप में कैल्शियम gluconate मरहम उपलब्ध कराएं।
    6. केवल ठीक से प्रशिक्षित कर्मियों प्रक्रिया को पूरा करने के लिए अनुमति देते हैं।
    7. हमेशा प्रयोगशाला के एक अन्य सदस्य आपात स्थिति के मामले में भी मौजूद है सुनिश्चित करते हैं।
    8. हुड के पास सभी रसायनों के लिए एमएसडीएस जानकारी रखें।
    9. संस्था या कंपनी के रासायनिक फैल और जोखिम नीतियों से परिचित हो।
      नोट: HF आसानी से त्वचा में व्याप्त हैऔर जोखिम होता अगर हड्डियों और हानिकारक तंत्रिकाओं को प्रभावित करने, एक कैल्शियम मेहतर है। केंद्रित Hydrofluoric एसिड की कुछ मिलीलीटर के लिए चमड़े का जोखिम खतरनाक और घातक भी हो सकता है। उत्पन्न नहीं होती प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक सावधानियों स्थापित करना।
  2. अलग हॉट प्लेट पर एक अलग 250 मिलीलीटर कांच बीकर में RCA1 और RCA2 प्रदर्शन करते हैं। प्रत्येक बीकर एक हलचल बार शामिल करना चाहिए। हलचल बार बल्ब में धमाके नहीं करता है तो clamped थर्मामीटर का उपयोग कर समाधान के तापमान पर नजर रखने। वाष्पीकरण के प्रभाव को कम करने के लिए एक घड़ी कांच का उपयोग बीकर कवर।
  3. RCA1 तैयारी
    1. एक मापने बीकर का उपयोग कर नामित RCA1 बीकर में 18 MΩ एक्स सेमी पानी की 50 मिलीलीटर रखें।
    2. बीकर केंद्रित करने के लिए अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के 15 मिलीलीटर (एनएच 4 ओएच) जोड़ें। पानी के 25 एमएल के साथ मापने बीकर कुल्ला और RCA1 बीकर कुल्ला पानी जोड़ें।
    3. Hotplate पर गर्मी और दोषी पर मुड़ें और 70 डिग्री सेल्सियस के लिए RCA1 स्नान ले आओ। RCA1 बीकर करने के लिए 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड (ओ 2 एच 2) के 15 मिलीलीटर जोड़ें। एच 22 के बाद 1 घंटे के भीतर RCA1 समाधान का उपयोग करें जोड़ा गया है। पेरोक्साइड के 15 मिलीलीटर स्नान करने के लिए हर बार जोड़ा जाता है तो स्नान तीन दिनों की अवधि के भीतर कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है।
    4. पानी से अच्छी तरह मापने बीकर कुल्ला और एक उपयुक्त RCA1 अपशिष्ट बोतल में कुल्ला त्यागें।
  4. RCA2 तैयारी
    1. अच्छी तरह से rinsed मापने बीकर का उपयोग कर नामित RCA2 बीकर 18 MΩ एक्स सेमी पानी की 70 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के 15 मिलीलीटर जोड़ें। पानी की 20 मिलीलीटर के साथ मापने बीकर कुल्ला और RCA2 बीकर में जोड़ें।
    3. गर्मी बढ़ाने के लिए और समाधान के 70 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है जब तक हॉटप्लेट की गति हलचल।
    4. 30% एच 22 के 15 मिलीलीटर जोड़ें। RCA1 स्नान की तरह, एच 22 जोड़ा गया है जब से 1 घंटे के भीतर इस समाधान का उपयोग करें; इसके अतिरिक्त, स्नानएच 22 के 15 मिलीलीटर प्रत्येक उपयोग करने से पहले जोड़ा जाता है तो तीन दिन की अवधि के भीतर कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  5. HF के समाधान तैयारी
    1. एक निष्क्रिय fluorinated बहुलक बीकर में पानी की 50 मिलीलीटर रखें।
    2. उपाय 4 प्लास्टिक मापने बीकर में केंद्रित Hydrofluoric एसिड (49%) की मिलीलीटर और अक्रिय fluorinated बहुलक बीकर में जोड़ें।
    3. HF बीकर कुल्ला पानी जोड़ने, पानी की 50 मिलीलीटर की कुल के साथ बीकर मापने प्लास्टिक बाहर कुल्ला। पानी से अच्छी तरह मापने बीकर बाहर धोने और एक नामित HF के अपशिष्ट कंटेनर में धोने के त्यागें।

5. तैयारी और सिलिकॉन सब्सट्रेट सफाई

  1. चिप्स में सिलिकॉन वेफर्स काटना
    1. सिलिकॉन वेफर के फ्लैट पॉलिश सतह पर सीधा और समानांतर जाली दिशाओं को पहचानें। ये दिशा-निर्देश cleaving चौकों आसान बनाने में मदद करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। निम्नलिखित निर्देश cleav से संबंधितसिलिकॉन <110> आईएनजी और अन्य क्रिस्टल झुकाव के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता।
    2. इस तरह के एक नैपकिन के रूप में एक नरम सतह पर सिलिकॉन वेफर पॉलिश साइड-अप, रखें। हीरे की इत्तला दे दी मुंशी कलम, प्राथमिक फ्लैट बढ़त के साथ वेफर की धीरे निक नीचे का उपयोग करना। निक नीचे, इस तरह के एक क्लिप के रूप में, एक छोटे से तार प्लेस और धीरे निक के दोनों तरफ उंगलियों या चिमटी रखने और नीचे धक्का द्वारा वेफर के लिए दबाव लागू होते हैं। ऐसा करने से प्राकृतिक फोड़ना दिशा में क्रिस्टल जाली रेखा के साथ दो हिस्सों में वेफर अलग कर देगा।
    3. एक और नैपकिन पर एक पेंसिल और शासक के साथ, ऊपर और नैपकिन के नीचे दोनों पर डॉट्स अंकन द्वारा चौकों की यात्रा की चौड़ाई को मापने। सीधे लाइनों के साथ इन डॉट्स कनेक्ट करें। यह भी चौकोर आकार के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में काम करेगा।
    4. प्लेस वेफर की एक पंक्ति के खिलाफ प्लावित नैपकिन पर मापा जाता है लाइनों के बीच बढ़त पहला आधा और कदम 5.1.2 में हौसले piec सीधा टूट दोहरानेतों अब cleaved चौकों की चौड़ाई होना चाहिए। नैपकिन पर क्षैतिज वेफर मुड़ें। सीधा लाइनों के बीच यह प्लेस और कदम 5.1.2 में इस प्रक्रिया को दोहराने।
    5. Scratching को रोकने के लिए डि पानी से भरा एक साफ शीशी में हौसले cleaved वेफर चिप्स की दुकान। सिलिकॉन चिप अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता है, लेकिन प्रयोगों के शुरू करने से पहले साफ किया जाना चाहिए।
  2. सिलिकॉन के लिए CMOS सफाई
    1. RCA1 समाधान उचित तापमान पर पहुँच गया है,। ऑक्सीजन के बुलबुले के चिप्स और बीकर दीवारों पर बनेगी। एक 2 "व्यास के साथ एक निष्क्रिय fluorinated बहुलक टोकरी का उपयोग कर समाधान में दस 1 सेमी एक्स 1 सेमी सिलिकॉन चिप को आठ डूब यदि कोई उत्साह से भरा हुआ 2 2 हे अपमानित है एच, होता है। एक साथ चिपके से चिप्स रखने के लिए नीचे हर कुछ मिनट, 10 से 20 मिनट के लिए समाधान में चिप्स छोड़ दो टोकरी आंदोलनकारी और।
    2. ऊपर सिलिकॉन चिप युक्त टोकरी लिफ्ट और अच्छी तरह से नाली। टी पर टोकरी में ले जाएंऔर अपशिष्ट बीकर ओ 18 MΩ एक्स सेमी पानी से अच्छी तरह कुल्ला। धोने बीकर में विसर्जित कर दिया और ऊपर बजना और नीचे 20 सेकंड के लिए। टोकरी नाली और बेकार बीकर से अधिक पानी से अच्छी तरह कुल्ला। एक नामित RCA1 अपशिष्ट बोतल में बेकार बीकर खाली और पानी के साथ फिर से भरना।
    3. RCA1 सफाई पूर्ण होने पर, 10 से 20 सेकंड के लिए 01:50 HF के बीकर में टोकरी जगह है। चिप्स और HF मिश्रण करने के लिए एक सौम्य ऊपर और नीचे गति का प्रयोग करें। HF के पूरी तरह से दूर पलायन करने की अनुमति देने के लिए डुबोना बाल्टी लिफ्ट।
      नोट: चिप सतहों हाइड्रोफोबिक होना चाहिए; पानी चिप गीला, लेकिन इसके बजाय उच्च संपर्क कोण के साथ बूंदों फार्म नहीं होगा। इस सिलिकॉन ऑक्साइड दूर etched गया है और चिप अब सी एच बांड से समाप्त हो जाता है कि इंगित करता है।
    4. धोने बीकर प्लेस और एक प्लास्टिक के टब में बीकर कुल्ला कुल्ला, बीकर से अधिक टोकरी ले जाने और 18 MΩ एक्स सेमी पानी से कुल्ला। धोने बीकर में टोकरी डूब और 20 सेकंड के लिए आंदोलन।
    5. एक दूसरे नाली और rins को पूरा करें18 MΩ एक्स सेमी पानी के साथ ई चक्र। कुल्ला बीकर में धोने के पानी डंप और पानी से धो लें बीकर फिर से भरना। एक नामित प्लास्टिक HF के अपशिष्ट बोतल में सब बेकार डालो।
    6. RCA2 समाधान उचित तापमान पर पहुँच गया है, टोकरी का उपयोग कर समाधान में सिलिकॉन चिप डूब। 10 से 20 मिनट के लिए समाधान में छोड़ दें। चिप के कारण अब एक पतली (1-2 एनएम) ऑक्साइड फिल्म के विकास के लिए हाइड्रोफिलिक किया जाएगा।
    7. समय की उचित राशि के बाद निकालें और RCA1 के लिए के रूप में ही rinsing प्रक्रियाओं का पालन करें। उपयुक्त RCA2 बर्बाद कंटेनर में कचरे के निपटान। , प्लास्टिक चिमटी के साथ टोकरी से प्रत्येक चिप को दूर पानी से कुल्ला, और नाइट्रोजन के साथ सूखी झटका।
    8. एक प्लास्टिक वेफर बॉक्स में या 18 MΩ एक्स सेमी पानी की एक शीशी में स्टोर चिप्स। सफाई के बाद लगभग तीन दिनों के लिए पानी में संग्रहीत जब सिलिकॉन साफ ​​रहेगा। कार्य क्षेत्र ठीक तरह से साफ किया जाता है और CMOS दस्ताने के बाहरी धोया गया है कि सुनिश्चित करें। मुख्यमंत्री छोड़ दोहुड में ओएस दस्ताने सुखाने के लिए।

APTES-क्रियाशील पर सिलिकॉन 6. जमा डीएनए origami

  1. सिलिकॉन पर स्व इकट्ठे monolayer गठन
    1. उद्घाटन से पहले आरटी के लिए गर्म APTES। बोतल भी ठंडा है, तो संक्षेपण भंडारण के दौरान APTES की hydrolysis के कारण हो सकता है। 18 MΩ एक्स सेमी पानी की 1,980 μl और मिश्रण करने के लिए एक साफ जगमगाहट शीशी और चक्कर आने के लिए APTES के 20 μl जोड़ें। तुरंत इस समाधान का उपयोग करें।
    2. , जगमगाहट शीशी में एक साफ सिलिकॉन चिप चिंतनशील साइड-अप जगह यह टोपी, और 20 मिनट के लिए बैठते हैं। चिमटी का उपयोग कर चिप निकालें और 200 पानी के μl और एन 2 की एक धारा के साथ 1 मिनट के लिए शुष्क से कुल्ला।
  2. APTES Functionalized सिलिकॉन पर डीएनए origami जमा
    नोट: क्रियाशील सिलिकॉन पर डीएनए origami जमा करने के लिए कदम अभ्रक पर जमा करने के लिए उन लोगों के अनुरूप हैं।
    1. संक्षेप में डीएनए origami शीशी और पिपेट समाधान के 4 μl मिश्रणसिलिकॉन सब्सट्रेट पर। यदि आवश्यक हो, क्रियाशील सिलिकॉन अभ्रक सब्सट्रेट की तुलना में अधिक हाइड्रोफोबिक है के रूप में पूरे सब्सट्रेट कवर करने के लिए प्रयोग किया जाता डीएनए origami समाधान की मात्रा में वृद्धि। नीचे बयान समाधान प्रेस और लंबे समय के बयानों के दौरान वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक गिलास को कवर पर्ची का प्रयोग करें।
    2. समाधान के लिए इस्तेमाल किया एकाग्रता के लिए आवश्यक समय की राशि है और वांछित कवरेज के लिए खड़े (सतह कवरेज पर समय और एकाग्रता के प्रभाव के लिए आंकड़े 2 और 3 देखें) करते हैं। बाँझ 18 MΩ एक्स सेमी पानी की 100 μl के साथ सब्सट्रेट कुल्ला और 1 मिनट के लिए 2 एन के साथ सूखी।
    3. बाँझ पानी की एक अतिरिक्त 100 μl के साथ rinsing दोहराएँ और 3 मिनट के लिए 2 एन के साथ सब्सट्रेट सूखी।
    4. आगे के प्रयोगों या इमेजिंग प्रदर्शन किया जा सकता जब तक एक साफ कंटेनर में नमूना संग्रहीत करें। नमूने कैसे म्यू के आधार पर भंडारण के लगभग एक से दो सप्ताह के बाद कण संचय दिखाने शुरूचर्चा है कि वे संभाल रहे हैं।

7. AFM इमेजिंग और डीएनए origami नमूने की छवि विश्लेषण

  1. इमेजिंग प्रयोजनों के लिए हवा में मोड दोहन में है AFM का प्रयोग करें। मोड दोहन कम से कम बल संपर्क मोड की तुलना में कमजोर है nanostructures को लागू किया जाएगा कि यह सुनिश्चित करता है।
    नोट: इमेजिंग मापदंडों के साधन पर निर्भर हो जाएगा। प्रस्तुत सभी छवियों को एक बहुपद्वति NanoScope IIIa का उपयोग कर लिया गया।
  2. सोने चिंतनशील कोटिंग के साथ हवा में मोड दोहन गैर संपर्क के लिए चयन करें AFM जांच /, 300 किलोहर्ट्ज़ ~ की एक गुंजयमान आवृत्ति (नाममात्र), 40 एन / मी, और टिप त्रिज्या <10 एनएम के निरंतर बल।
  3. प्रक्रिया और NanoScope विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग AFM छवियों का विश्लेषण। ImageJ का उपयोग कवरेज गणना प्रदर्शन। 19

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Representative Results

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दो चर सब्सट्रेट पर डीएनए origami के कवरेज के हुक्म: समाधान एकाग्रता और जोखिम समय। सोखना अभ्रक पर डीएनए origami की विशेषताओं और क्रियाशील सिलिकॉन ऑक्साइड APTES पहले से सूचित किया गया है। 13 बयान समाधान और मीका पर अंतिम कवरेज में डीएनए origami की एकाग्रता के बीच संबंधों में वृद्धि एकाग्रता परिणाम दिखा, 1 टेबल और चित्रा 2 में संक्षेप हैं वृद्धि की कवरेज में। बंधन का समय-निर्भरता चित्रा 3। सतह कवरेज में देखा जाता है कि पहले अभ्रक पर डीएनए origami के बंधन व्यवहार और संशोधित सिलिकॉन ऑक्साइड सतहों यों के लिए अध्ययन किया गया था। 1x TAE बफर में 12 मिमी मैग्नीशियम में डीएनए origami सतह पर 30 मिनट के अवशोषण समय के बाद मीका पर 83.3% 3.1% ± कवरेज है। APTES SAMs के साथ संशोधित सिलिकॉन ऑक्साइड पर अधिकतम कवरेज अभ्रक पर अधिकतम कवरेज से कम है जो 60 मिनट के बाद मनाया जाता है। एएक उच्च सतह कवरेज सिलिकॉन ऑक्साइड क्रियाशील APTES पर आवश्यक है, तो अब जमाव समय की जरूरत है।

गरीब नमूना तैयार पैदा कर सकता है कि कई चर रहे हैं। सबसे अधिक परेशानी अपर्याप्त rinsing और सूख रहा है। बफर समाधान ठीक से rinsed नहीं है, तो बड़े समुच्चय सब्सट्रेट (चित्रा -4 ए) पर फार्म। Nanostructures सतह (चित्रा 4 बी) पर मैग्नीशियम लवण के धब्बे का पालन करना है जब 'डीएनए origami द्वीप' मनाया जाता है। अंत में, उच्च कवरेज के नमूनों के साथ, यह मुश्किल है AFM का उपयोग करने के लिए nanostructures अंतर करने के लिए बनाता है जो व्यक्ति के डीएनए origami (चित्रा 4C), के बीच ब्रिजिंग अतिरिक्त बफर घटकों के लिए संभव है। इन परिणामों के दोनों अभ्रक और सिलिकॉन substrates के लिए एक पूरी तरह से rinsing और सुखाने प्रोटोकॉल का पालन करके बचा जा सकता है।

सिलिकॉन ऑक्साइड substrates पर APTES फिल्मों के गठन के रूप में अच्छी तरह से समस्या पैदा कर सकते हैं। सिलिकॉन वेफर्स एक हैहटा दिया जाना चाहिए कि किसी न किसी सिलिकॉन ऑक्साइड परत और इसे क्रियाशील किया जा सकता से पहले सुधार एक चिकनी, पतली सिलिकॉन ऑक्साइड परत। एक ठीक से साफ सिलिकॉन सब्सट्रेट चित्रा 5 ए में सचित्र है। सिलिकॉन वेफर की सफाई के दौरान, यह दो चिप्स अभिकर्मकों (चित्रा 5 ब) के लिए जोखिम को अवरुद्ध, एक दूसरे के लिए अटक बनने के लिए यह संभव है के रूप में, यकीन है कि सिलिकॉन चिप की संख्या बहुत अधिक नहीं है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। साफ सिलिकॉन से अधिक एक सप्ताह के लिए 18 MΩ एक्स सेमी पानी में संग्रहित किया गया है, दूषित पदार्थों को परत में सुधार होगा और recleaning आवश्यक है। APTES आपूर्ति भी नमूना तैयार करने के साथ समस्या पैदा हो सकती है। APTES आसानी से monolayer के गठन के लिए जो आधार है, हाइड्रोलिसिस के माध्यम से polymerizes। 20 इस polymerization की हद APTES से अवगत कराया है कि पानी की एकाग्रता पर निर्भर है। समय के साथ और बार-बार प्रयोग के माध्यम से पानी APTES बोतल के अंदर गाढ़ा और दूषित करने के लिए, यह संभव हैआपूर्ति। जिसके परिणामस्वरूप polymerization के सब्सट्रेट (चित्रा 5C) का पालन करना है कि बड़े समुच्चय पैदा करता है। बढ़ी हुई खुरदरापन और समुच्चय की उपस्थिति मुश्किल है AFM का उपयोग डीएनए nanostructures की पहचान करता है। यह फ्रिज में एक प्लास्टिक की थैली में APTES बोतल की दुकान, और APTES संक्षेपण से बचने के लिए खोलने से पहले आरटी के लिए गर्म बोतल जाने के लिए अच्छा अभ्यास है।

चित्र 1
चित्रा 1. मीका के साथ बंधन एक योजनाबद्ध (ए) मीका और (बी) पर डीएनए origami के लिए बाध्यकारी तंत्र की तुलना क्रियाशील APTES सिलिकॉन ऑक्साइड (पैमाने पर नहीं)। द्विसंयोजक फैटायनों, आमतौर पर 2 मिलीग्राम + की उपस्थिति द्वारा मध्यस्थता है। Protonated एमाइन की एक monolayer 3-aminopropyltriethoxysilane सिलिकॉन ऑक्साइड सब्सट्रेट पर आसंजन को बढ़ावा देने के लिए किया जाता है समाप्त हो गया।

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चित्रा (ए) 2 एनएम, (बी) 4 एनएम, और (सी) 6 एनएम अभ्रक पर। सभी छवियों के लिए ऊंचाई पैमाने है 5 एनएम के 10 मिनट के बयानों के बाद चर कवरेज illustrating 2. AFM छवियों।

चित्र तीन
1x TAE बफर में 2 एनएम डीएनए origami, 12 मिमी मिलीग्राम के लिए चित्रा सतह कवरेज में 3. रुझान 2+। अभ्रक = बैंगनी रेखा और वृत्त मार्करों, APTES = पीला लाइनों और त्रिकोण मार्करों। एन = मानक त्रुटि के निर्धारण में 3।

चित्रा 4
चित्रा 4. गरीब rinsing और सुखाने पर nanostructures की (ए) सब्सट्रेट पर समाधान एकत्रीकरण, (बी) के डीएनए origami द्वीप समूह, और (सी) ब्रिजिंग पैदा कर सकता हैअतिरिक्त बफर लवण की उपस्थिति में उच्च कवरेज नमूने हैं। सभी छवियों के लिए ऊंचाई पैमाने पर 5 एनएम है।

चित्रा 5
चित्रा 5 (ए) स्वच्छ सिलिकॉन 1 वर्ग माइक्रोन से अधिक 0.5 की तुलना में कम आरएमएस खुरदरापन होनी चाहिए। एक पूरा APTES सैम (बी)। 1 वर्ग माइक्रोन से अधिक 1 एक की तुलना में एक आरएमएस खुरदरापन कम होना चाहिए एक अच्छा देशी ऑक्साइड पर जमा 1 वर्ग माइक्रोन से अधिक 2.29 एनएम के आरएमएस खुरदरापन के साथ एक अधूरे साफ सिलिकॉन ऑक्साइड पर बनाई फिल्म APTES। । APTES फिल्म के अंतराल और खुरदरापन नोट (सी) गाढ़ा कचरे के साथ दूषित APTES का एक नमूना से गठित सतह APTES; APTES बोतल रूपों बड़े कणों में हाइड्रोलिसिस। सभी छवियों के लिए ऊंचाई पैमाने पर 5 एनएम है।

Varyin साथ अभ्रक substrates के लिए तालिका 1. प्रतिशत कवरेज मापजी डीएनए origami समाधान सांद्रता। सभी बयान बार 10 मिनट हैं।

डीएनए origami समाधान मीका सब्सट्रेट पर% कवरेज
2 एनएम 8.49 ± 2.67 (एन = 5)
4 एनएम 55.89 ± 5.65 (एन = 3)
6 एनएम 77.44 ± 1.89 (एन = 4)

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Discussion

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सुसंगत और आदर्श परिणाम प्राप्त करने के लिए जोर दिया जाना करने की जरूरत है कि कई कदम उठाए हैं। मीका के नमूने, एक सख्त और पूरी तरह से rinsing के बाद और चरणों 3.3 और 3.4 के रूप में शासन सुखाने के लिए, अलग-अलग डीएनए origami की उच्च गुणवत्ता के चित्र प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में उल्लिखित विभिन्न समस्याओं के बिना है AFM का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है कि यह सुनिश्चित करेंगे। सिलिकॉन नमूने के लिए प्राथमिक महत्व के सब्सट्रेट की सफाई है। अच्छी तरह से और कुशलता से कदम 5.2 में उल्लिखित सफाई प्रक्रियाओं के बाद एक उचित साफ सिलिकॉन ऑक्साइड सतह प्राप्त किया जाएगा कि विश्वास दिलाता हूँ। साथ ही, गुणवत्ता और ऐसे हाइड्रोजन पेरोक्साइड, Hydrofluoric एसिड, और APTES के रूप में रसायन, की प्रभावशीलता की निगरानी, ​​प्रक्रिया को सुचारू रूप से चलता है कि यह सुनिश्चित करेंगे।

वर्णित तकनीकों APTES का केवल जलीय समाधान करने के लिए सीमित नहीं हैं। APTES और trimethylaminopropyltrimethoxysilyl क्लोराइड (TMAC) के एक मिश्रित monolayer हमें हो सकता हैधुन करने के लिए एड सिलिकॉन की सतह के प्रभारी और चर डीएनए origami आसंजन को बढ़ावा देने के। 11 TMAC एक स्थायी रूप से आरोप लगाया टर्मिनल चतुर्धातुक शामिल हैं एमाइन एन (सीएच 3) 3, APTES पर पीएच निर्भर प्रभारी की तुलना में। समाधान पर्यावरण protonation राज्य या TMAC धुन कर सकते हैं का समाधान एकाग्रता मिश्रित monolayer के सतह के प्रभारी बदलती TMAC के प्रभारी, प्रभावित और सब्सट्रेट और डीएनए origami के बीच बातचीत को प्रभावित नहीं करता है। इष्टतम डीएनए origami SAMs 100% से 40% TMAC एकाग्रता युक्त से मेल खाती है, जो 2 एनएम 0.75-1.5 प्रभार / की एक सतह के प्रभारी होने के monolayers के लिए मनाया गया बाइंडिंग। इस इष्टतम सतह प्रभारी APTES SAMs और 120 ओरिगेमी / TMAC SAMs पर माइक्रोन 2 पर लगभग 110 ओरिगेमी / माइक्रोन 2 की डीएनए origami कवरेज के लिए प्रेरित किया।

सिलिकॉन का एक लाभ यह है lithographic patterning प्रक्रियाओं के साथ अपनी संगतता है। उच्च मैग्नीशियमसांद्रता सिलिकॉन करने के लिए डीएनए origami के चुनिंदा बंधन को बढ़ावा देने के लिए प्लाज्मा इलाज सिलिकॉन आक्साइड के साथ प्रयोग किया जा सकता है। दूर मैग्नीशियम आयनों rinsing से बचने के लिए बयान समाधान से नमूना दूर करने और डीएनए origami deforming जब ध्यान रखा जाना चाहिए। Covalently सिलिकॉन ऑक्साइड सतह पर फैटायनों संलग्न 21,22 APTES प्रक्रिया रूपों, कपड़े धोने या तो बफर या पानी करता है के साथ rinsing संलग्न डीएनए origami नुकसान नहीं। 'आणविक liftoff के' विधि सिलिकॉन substrates patterning और डीएनए origami आसंजन को बढ़ावा देने के लिए एक और संभव मार्ग है। सिलिकॉन सब्सट्रेट इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी का उपयोग नमूनों है और APTES उजागर सब्सट्रेट पर जमा किया जाता है। Photoresist की liftoff के बाद, डीएनए origami को प्राथमिकता APTES के लिए बाध्य, नमूनों सतह पर जमा किया जा सकता है। 23

एक सब्सट्रेट के साथ डीएनए origami की बातचीत अनुसंधान और अनुप्रयोगों के लिए नए रास्ते खोलने, इसकी स्थिरता बदल जाता है। डीएनए origamमैं nanostructure आयाम के दृश्य परिवर्तन और कम से कम रासायनिक परिवर्तन के बिना 150 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जा सकता अभ्रक का पालन किया। 24 यह nanostructures के 70 डिग्री सेल्सियस। 25 से ऊपर dehybridized पूरा कर रहे हैं, जहां के समाधान में डीएनए origami की कमजोरी, के विपरीत में है, 26 यह स्थिरता गरम सिलिकॉन ऑक्साइड substrates पर बनाए रखा है। 27 यहां तक कि ऐसे हेक्सेन, टोल्यूनि, और इथेनॉल, आकार और nanostructures की कवरेज के रूप में विविध विलायक प्रणाली, में रखा जाता है। डीएनए origami के आश्चर्य की बात स्थिरता जैसे प्लाज्मा बढ़ाया वाष्प जमाव, आम photoresists और सॉल्वैंट्स का उपयोग करते हैं, और अद्वितीय रासायनिक बयान वातावरण, के रूप में पहले से असंगत लगा रहे थे कि आवेदन, डीएनए origami के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि इंगित करता है। हालांकि, डीएनए origami उनकी कार्यक्षमता को बनाए रखने के लिए कि क्या अभी भी अज्ञात है और संभव अनुप्रयोगों सीमित कर सकता है।

ऊंचा तापमान पर डीएनए origami की स्थिरता हालांकिs और विलायक प्रणालियों की एक सीमित संख्या निर्धारित किया गया है में, substrates पर डीएनए origami की दीर्घकालिक स्थिरता अभी भी अज्ञात है। बाँझ तकनीकों के उपयोग के संभावित संक्रमण से बचने के लिए आवश्यक है, लेकिन इस सतह बयान के बाद टाला नहीं जा सकता। इमेजिंग और नमूना विश्लेषण नमूना तैयार होने के बाद लगभग तुरंत पूरा किया जाना चाहिए; नमूना कण संचय और टूटी डीएनए nanostructures सहित नमूना गिरावट के विभिन्न उदाहरणों अक्सर पहचान कर रहे हैं (एक सप्ताह से अधिक) भी लंबे समय के लिए भंडारित किया जाता है। Nanoelectronics, biosensing, और अन्य सब्सट्रेट आधारित डीएनए origami अनुप्रयोगों में संभावित अनुसंधान रास्ते डीएनए के समय पर निर्भर अस्थिरता द्वारा सीमित किया जा सकता है। समय की लंबी अवधि के लिए स्थिरता की आवश्यकता होती है अनुप्रयोगों के लिए इन तकनीकों की सीमाओं की पहचान आगे जांच की आवश्यकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μl VWR International, LLC 22491733 10 reload tray of 96 tips
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene VWR International, LLC 87003-290 0.65 ml, natural
Research Plus Pippete - Single Channel - 20-200 μl A. Daigger & Company, Inc. EF8960F-3120000054 EACH Adjustable Volume
Research Plus Pippete - Single Channel - 2-20 μl A. Daigger & Company, Inc. EF8960D-3120000038 EACH Adjustable Volume
Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape Office Depot, Inc. 602710 3/4" x 300", Pack of 2
Vortex Mixer Thermo Scientific M37610-33Q
Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm Electron Microscopy Sciences 64917-2 6 per pack
6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat Nova Electronic Materials, Ltd. GC49266
Powder-Free Nitrile Examination Gloves VWR International, LLC 82062-428 Catalog number is for size large
High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating K-Tek Nanotechnology, Inc. HA_NC/15
Autoclave Pan A. Daigger & Company, Inc. NAL692-5000 EF25341C
Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch - 1 dz Spectrum Chemical Mfg. Corp. 106-15055 Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves.
Tweezers PTFE 200 mm Square Dynalon Corp. 316504-0002
Muscovite Mica Sheets V-5 Quality Electron Microscopy Sciences 71850-01 10 per pack
Mica Disc, 10 mm Ted Pella, Inc 50 Mica discs are optional
Scriber Diamon Pen for Glassware VWR International, LLC 52865-005
Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap - 20 ml VWR International, LLC 66022-060 Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner
4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz Dot Scientific, Inc. 6759-200
Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth VWR International, LLC 89043-554 Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached
Standar-Grade Glass Beaker, 250 ml Capacity VWR International, LLC 173506
Beakers, PTFE VWR International, LLC 89026-022 For use with HF
Shallow form watch glass, 3" VWR International, LLC 66112-107 Case of 12
Plastic Storage Container VWR International, LLC 470195-354 For secondary container
General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers VWR International, LLC 89095-564
High precision and ultra fine tweezers Electron Microscopy Sciences 78310-0
Polycarbonate Faceshield Fisher Scientific, Inc. 18-999-4542
Neoprene Apron Fisher Scientific, Inc. 19-810-609
Calcium Gluconate, Calgonate W.W Grainger, Inc. 13W861 Tube, 25 g
Hydrogen Peroxide 30% CR ACS 500 ml Fisher Scientific, Inc. H325 500 HARMFUL, TOXIC
3-Aminopropyltriethoxysilane Gelest Inc. SIA0610.0-25GM Let warm to room temperature before use.
Ammonium hydroxide, 2.5 L Fisher Scientific, Inc. A669-212 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Fisher Scientific, Inc. A144-212 HARMFUL, TOXIC
Hydrofluoric acid Fisher Scientific, Inc. A147-1LB HARMFUL, TOXIC
MultiMode Nanoscope IIIa Veeco Instruments, Inc. Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis
Dunk basket Made in lab Made in lab The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws.

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References

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डीएनए origami विश्लेषण और प्रयोगों के लिए मीका और सिलिकॉन substrates की तैयारी
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Pillers, M. A., Shute, R., Farchone, A., Linder, K. P., Doerfler, R., Gavin, C., Goss, V., Lieberman, M. Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation. J. Vis. Exp. (101), e52972, doi:10.3791/52972 (2015).More

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