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Chemistry

Preparazione di Mica e Silicon substrati per il DNA Origami Analisi e sperimentazione

doi: 10.3791/52972 Published: July 23, 2015

Introduction

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Introdotto nel 2006, origami di DNA utilizza la natura auto-assemblaggio di oligonucleotidi di DNA per la produzione di nanostrutture progettabili e molto ordinate. 1 Una miriade di strutture sono stati segnalati, che vanno da smiley volti agganciato scatole in 3 dimensioni. 2 origami di DNA può essere funzionalizzato con varie biomolecole e nanostrutture, dando luogo ad applicazioni di ricerca in nanoelettronica, medicina e informatica quantistica. 3 Tuttavia, l'analisi e molte applicazioni future non dipendono solo sulla progettazione strutturale, ma anche l'adesione delle nanostrutture origami DNA alle superfici. I metodi descritti in questo manoscritto riguardano la preparazione dei campioni di DNA origami su due tipi di substrati: mica e ossido di silicio funzionalizzato.

Mica è il substrato di scelta per studi origami DNA perché è atomicamente piatta, con un'altezza strato di 0,37 nm ± 0,02 nm. 4 È anche easily puliti, rendendo la preparazione del campione e microscopia a forza atomica (AFM) studi semplice. Mica muscovite contiene un'alta densità di potassio in ciascun piano di clivaggio, ma questi ioni diffusa dalla superficie mica quando in acqua. Per mediare il legame di Origami DNA al substrato di mica, Mg 2+ è utilizzato per invertire la carica negativa della mica ed elettrostaticamente impegnare la spina dorsale fosfato DNA al substrato (Figura 1A). 5 Miscugli di DNA ricotto in presenza di grandi eccessi di filamenti sintetiche conferiscono elevata copertura e buone immagini sul mica perché l'adesione di origami di DNA alla 2+ superficie -terminated Mg è molto più forte l'adesione di oligonucleotidi a singolo filamento (fili fiocco). Altri ioni positivi, compresi Ni 2+ e Co 2+ possono essere utilizzati per controllare l'adesione di DNA su mica. 6,7 Modifica della concentrazione di cationi monovalenti e divalenti in soluzione può mediare Adhesione e diffusione superficie tassi di origami di DNA. 8 Tuttavia, il protocollo per la preparazione di sottofondi mica e depositando e risciacquare l'origami è spesso non esplicitamente descritta nei manoscritti pubblicati. 9 Senza un protocollo chiaro, risultati riproducibili possono essere difficili da ottenere.

Mica è un isolante, quindi non è adatto come substrato per alcune applicazioni in nanoelettronica. Silicon passivata con un ossido sottile nativo ha desiderabili proprietà elettroniche, compresa la compatibilità con trasformazione preliminare gratuito semiconduttore metallo-ossido (CMOS) per creare strutture di ingresso / uscita e le caratteristiche topografiche. Wafer di silicio memorizzati in aria sono passivate sia con un ossido termico spesso o sottile pellicola di ossido nativo che è relativamente sporca, con un elevato numero di particelle. Ossido di silicio ha una densità di carica superficiale molto più basso di mica, e la densità di carica dipende altamente preparazione di ossido e la storia. Alle concentrazioni di ioni magnesio above 150 mm, buone coperture (fino a 4 / micron 2) di forma rettangolare origami di DNA può essere realizzato su di ossigeno plasma trattato substrati di silicio; tuttavia, questa concentrazione e la copertura possono variare a seconda delle dimensioni e disegno delle nanostrutture utilizzati. 10 Un protocollo alternativo per accordare la carica superficiale è quello di collegare un cationico monostrato auto-assemblato di 3-amminopropiltrietossisilano (APTES) (Figura 1B) per l'ossido. L'ammina primaria APTES può essere protonata a valori di pH inferiori a 9, modificando la carica e idrofobicità del substrato. 11 Per un monostrato completo di APTES da depositare con successo, il silicio deve essere opportunamente pulito usando Radio Corporation of America (RCA) protocolli . Questi protocolli includono trattamenti in idrossido di ammonio e soluzioni di perossido di idrogeno (RCA1) per rimuovere i residui organici e contaminanti particellari. Una breve etch in soluzione acquosa di acido fluoridrico rimuove lo strato di ossido nativo insiemeeventuali contaminanti ionici che aderiscono al ossido. Infine, i campioni sono esposti ad una soluzione di acido cloridrico e acqua ossigenata (RCA2) per rimuovere metallo e contaminanti ionici e formare un sottile strato di ossido uniforme. 12 La maggior parte delle camere bianche hanno designato cappe per protocolli di pulizia CMOS, con regole severe su ciò che può essere usato in queste aree. Un problema comune si presenta sotto forma di ioni come il sodio, che possono disturbare le proprietà elettroniche di strutture CMOS con la creazione di trappole midbandgap. 13 ioni comunemente usato in origami di DNA di preparazione e di deposizione buffer potrebbero contaminare i bagni CMOS e causare problemi per altri ricercatori che utilizzano la camera pulita. Per questo motivo, il nostro gruppo utilizza un 'sporche "CMOS panchina di pulizia predisposto appositamente per i piccoli campioni utilizzati per la ricerca origami di DNA. Questo processo è una buona alternativa per la camera bianca tradizionale set-up e può essere adatto per i laboratori che non hanno accesso a una panchina CMOS camera bianca.

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Protocol

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1. Esperimento Pianificazione e Preparazione del materiale

  1. Determinare la progettazione, la concentrazione, e la funzionalità del origami di DNA che verrà utilizzato negli esperimenti. 14-16 Qui, usiamo un disegno DNA origami rettangolo preparato in 1x TAE / soluzione Mg 2+ (40 mM Tris-base, 20 mM acido acetico, EDTA 2 mM e 12 mM di acetato di magnesio, pH 8,0). 17
  2. Autoclavare tutti i suggerimenti, i tubi e contenitori da utilizzare. Tali materiali devono essere tutti autoclave compatibili.
  3. Preparare una fornitura di acqua sterile per il risciacquo. Riempire un barattolo sterile con circa 500 ml di 18 MW x cm d'acqua, posto su una piastra, far bollire per 5 minuti con il cappuccio, e prendere il vaso largo della piastra e lasciare raffreddare con il coperchio posizionato sul contenitore, ma non serrata . Conservare in frigorifero e preparare una nuova offerta ogni mese o quando necessario.

2. Preparazione del substrato Mica

  1. Substrati tagliati a dimensione appropriata (1 cm x 1 centimetri quadrati) con le forbici. Mica è sottile e fragile. In alternativa, l'acquisto di mica in forma di disco che non richiede il taglio.
  2. Cleave mica con del nastro biadesivo. Mica è composta da strati di minerali separati da intercalando ioni, ogni livello può essere staccata quando aderito a nastro biadesivo. 18
    1. Posizionare i quadrati mica sul nastro biadesivo ancora nel dispenser del nastro, facendo attenzione che è aderito fermamente al nastro. Scorrere delicatamente le pinzette tra la mica e il nastro, il livello più alto sarà rimosso e rimangono sul nastro. Subito dopo la rimozione, la piazza mica avrà la sua parte pulita rivolto verso il basso. Assicurati di capovolgere la mica sopra prima di riporlo in un contenitore.
    2. Ripetere questo tre o quattro volte per assicurare la rimozione completa dello strato superiore più e pulizia adeguata.
  3. In alternativa, aderire la mica ad un contenitore o da tavolo con un pezzo di nastro biadesivo e utilizzare un secondo pezzo di ssegno di spunta a e staccare la parte superiore più strati di mica. La mica sarà adeguatamente puliti in entrambi i casi, anche se il metodo alternativo rende depositare DNA e risciacquo e asciugatura campione difficile a causa della seconda adesione al supporto.

3. Depositare Origami DNA su Mica

  1. In breve, miscelare il flacone di origami di DNA utilizzando un vortex per garantire anche la dispersione di nanostrutture in soluzione.
  2. Dispensare 4 ml di soluzione sulla mica, assicurando che la punta della pipetta non tocchi il substrato. Lasciare l'origami di DNA sul mica per circa 10 minuti al fine di garantire una copertura adeguata. Il tempo di deposizione varia a seconda della concentrazione di origami di DNA utilizzato così come la copertura desiderata (figure 2 e 3).
    1. Sciacquare la soluzione origami di DNA off del substrato di mica con 100 ml di acqua sterile sopra un lavandino o un recipiente di liquido. Raccogliete la mica con una pinzetta. Pipettare l'acqua sullasubstrato, con il flusso della goccia verso la punta della pinzetta. Agitare la mica con un basso movimento affilati per rimuovere l'acqua in eccesso. Tenere le pinzette in posizione verticale in modo che l'acqua fluirà verso le pinzette per evitare la contaminazione del campione.
  3. Essiccare il substrato con un flusso costante di azoto (N 2) per 1 min. Assicurarsi che l'acqua in eccesso viene rimossa. Ripetere il risciacquo con altri 100 ml di acqua sterile. Essiccare il substrato con N 2 per un ulteriore 3 min. Un substrato completamente asciutto è necessaria per il successo microscopia a forza atomica (AFM) analisi (Figura 4).
  4. Analizzare il supporto con AFM o conservare in un contenitore chiuso.

4. CMOS / Silicon Cleaning Set-up

  1. ATTENZIONE: Quando si usano i CMOS set-up, utilizzare dispositivi di protezione individuale in ogni momento. I reagenti sono acidi forti, basi forti, acido fluoridrico (HF), e agenti fortemente ossidanti che can reagire con solventi di scarto se i reagenti non vengono smaltite correttamente. Rispettare le seguenti precauzioni:
    1. Casa dei CMOS panchina in una cappa chimica senza altri processi o set-up.
    2. Indossare guanti di nitrile, camice da laboratorio, occhiali di sicurezza, guanti di nitrile industriali di grandi dimensioni, un grembiule fuoriuscita, e una visiera in ogni momento quando si utilizza la panca CMOS.
    3. Utilizzare vasche di plastica come contenimento secondario quando le soluzioni sono preparate.
    4. Utilizzare un misurino polimero fluorurato inerte per la gestione del HF concentrato.
    5. Fare calcio gluconato unguento disponibile come primo soccorso per qualsiasi esposizione della pelle.
    6. Consentono solo da personale adeguatamente addestrato per eseguire il processo.
    7. Assicurarsi sempre un altro membro del laboratorio è presente in caso di emergenza.
    8. Mantenere informazioni scheda di sicurezza per tutte le sostanze chimiche vicino al cofano.
    9. Avere familiarità con l'istituzione di politiche o fuoriuscita chimica e l'esposizione dell'azienda.
      Nota: HF permea prontamente pelleed è un tesoro di calcio, che colpisce le ossa e nervi dannosi in caso di esposizione. Esposizione cutanea a pochi ml di acido fluoridrico concentrato può essere pericoloso e persino fatale. Stabilire le precauzioni necessarie per garantire l'esposizione non si verifica.
  2. Eseguire RCA1 e RCA2 in separata da 250 bicchieri di vetro ml su piastre separate. Ogni bicchiere deve contenere un ancoretta. Monitorare la temperatura della soluzione con termometri serrati in modo che il ancoretta non sbatte nel bulbo. Coprite i bicchieri con un vetro d'orologio per diminuire gli effetti di evaporazione.
  3. RCA1 Preparazione
    1. Mettere 50 ml di 18 MW x cm di acqua nel bicchiere RCA1 designato con un misurino.
    2. Aggiungere 15 ml di idrossido di ammonio concentrato (NH 4 OH) nel becher. Risciacquare il misurino con 25 ml di acqua e aggiungere l'acqua di risciacquo nel becher RCA1.
    3. Accendere il fuoco e agitatore sulla piastra e portare il bagno RCA1 a 70 ° C. Aggiungere 15 ml di 30% di perossido di idrogeno (H 2 O 2) nel becher RCA1. Utilizzare la soluzione RCA1 entro 1 ora dopo l'H 2 O 2 è stato aggiunto. Il bagno può essere utilizzato più volte nell'arco di tre giorni se 15 ml di perossido viene aggiunto al bagno ogni volta.
    4. Risciacquare il misurino con acqua ed eliminare il risciacquo in una bottiglia di rifiuti RCA1 appropriata.
  4. RCA2 Preparazione
    1. Aggiungere 70 ml di 18 MW x cm di acqua nel bicchiere RCA2 designato utilizzando il misurino accuratamente sciacquati.
    2. Aggiungere 15 ml di acido cloridrico concentrato (HCl). Risciacquare il misurino con 20 ml di acqua e aggiungere al bicchiere RCA2.
    3. Aumentare il fuoco e mescolare velocità della piastra riscaldante fino a soluzione raggiunge i 70 ° C.
    4. Aggiungere 15 ml di 30% H 2 O 2. Come il bagno RCA1, utilizzare questa soluzione entro 1 ora dal momento in cui viene aggiunto il H 2 O 2; Inoltre, il bagnopuò essere riutilizzato più volte nell'arco di tre giorni se 15 ml di H 2 O 2 è aggiunto prima di ogni uso.
  5. HF Soluzione Preparazione
    1. Mettere 50 ml di acqua in un becher polimero fluorurato inerte.
    2. Misura 4 ml di acido fluoridrico concentrato (49%) nel misurino di plastica e aggiungerlo al bicchiere polimero fluorurato inerte.
    3. Risciacquare la plastica misurino con un totale di 50 ml di acqua, aggiungendo l'acqua di risciacquo nel becher HF. Lavare il misurino con acqua ed eliminare i lavaggi in un contenitore per rifiuti HF designato.

5. La preparazione e pulizia del substrato di silicio

  1. Taglio wafer di silicio in chip
    1. Identificare le indicazioni reticolo perpendicolari e parallele sulla superficie levigata piatta del wafer di silicio. Queste direzioni sono utilizzati per contribuire a rendere più facile piazze fendendo. Le seguenti istruzioni si riferiscono a cleaving silicio <110> e potrebbe non essere adatto per altri orientamenti di cristallo.
    2. Posizionare il wafer di silicio lucidato-side-up su una superficie morbida, come un tovagliolo. Utilizzando la penna scrivano diamantato, delicatamente nick fondo della fetta lungo il bordo primario piatta. Inserire un filo, come ad esempio una graffetta, sotto il nick e comprimendo leggermente la cialda posizionando dita o pinzetta su entrambi i lati del nick e spingendo verso il basso. In questo modo si separare il wafer in due metà lungo la linea di reticolo cristallino in direzione fendi naturale.
    3. Su un altro tovagliolo, con una matita e righello, misurare la larghezza desiderata dei quadrati marcando puntini sulla parte superiore e la parte inferiore del tovagliolo. Collegare questi punti con linee rette. Questo servirà come linea guida per forme anche quadrate.
    4. Mettere uno dei wafer dimezza bordo-prima tra le linee misurate sul tovagliolo arrossata contro la linea e ripetere il passaggio in 5.1.2 L'appena rotto perpendicolare pieces dovrebbero ora essere la larghezza dei quadrati spaccati. Ruotare il wafer orizzontalmente sul tovagliolo. Mettere tra le righe perpendicolari e ripetere il processo al punto 5.1.2.
    5. Conservare i circuiti integrati della cialda appena spaccati in una fiala pulita riempita con acqua deionizzata per evitare di graffiare. I chip di silicio possono essere conservati a tempo indeterminato, ma devono essere puliti prima di iniziare gli esperimenti.
  2. CMOS Pulizia della Silicon
    1. Quando la soluzione RCA1 ha raggiunto la temperatura appropriata, immergere otto-dieci 1 cm x 1 centimetri chip di silicio nella soluzione utilizzando un inerte fluorurato cesto polimero con un "diametro di 2. Bolle di ossigeno formeranno sul chip e pareti beaker. Se no bubbling si verifica, l'H 2 O 2 è degradato. Lasciare i chip nella soluzione per 10 a 20 minuti, agitando il cesto su e giù ogni pochi minuti per mantenere i chip si attacchino.
    2. Sollevare il cesto contenente i chip al silicio e scolateli bene. Spostare il cestino sopra to il bicchiere rifiuti e risciacquare abbondantemente con 18 MW x cm d'acqua. Immergere nel bicchiere lavaggio e dondolare su e giù per 20 secondi. Scolare il canestro e risciacquare abbondantemente con acqua sopra il bicchiere rifiuti. Svuotare il bicchiere rifiuti in una bottiglia di scarico RCA1 designato e riempire con acqua.
    3. Dopo la pulizia RCA1 completata, posizionare il cestello nel contenitore 01:50 HF per 10 a 20 secondi. Utilizzare un delicato movimento su e giù per mescolare i chip e HF. Sollevare il secchio dunk per consentire la HF di scaricare completamente via.
      Nota: Le superfici di chip dovrebbero essere idrofobiche; acqua non bagnare il chip, ma invece formare goccioline con angoli di contatto elevate. Questo indica che l'ossido di silicio è stato inciso via ed il chip viene ora risolto da legami Si-H.
    4. Porre il recipiente di lavaggio e risciacquo bicchiere in una vasca di plastica, spostare il cestino sopra il bicchiere di risciacquo e risciacquare con 18 MW x cm d'acqua. Immergere il cestello nel contenitore di lavaggio e agitare per 20 secondi.
    5. Completa un secondo scarico e Rinse ciclo con 18 MW x cm d'acqua. Dump l'acqua di lavaggio nel contenitore risciacquo e riempire il bicchiere di lavaggio con acqua. Versare tutti i rifiuti in un flacone di scarico HF plastica designato.
    6. Quando la soluzione RCA2 ha raggiunto la temperatura appropriata, immergere i chip di silicio nelle soluzioni utilizzando il cesto. Lasciare nella soluzione per 10 a 20 min. Il chip sarà ora idrofilo a causa della crescita di un sottile (1-2 nm) di ossido di pellicola.
    7. Rimuovere dopo la giusta quantità di tempo e di seguire le stesse procedure di risciacquo come ad RCA1. Smaltire i rifiuti nel contenitore dei rifiuti RCA2 appropriata. Rimuovere ogni chip dal cestino con le pinzette in plastica, sciacquare con acqua e asciugare con azoto.
    8. Conservare chips in una scatola di wafer di plastica o in una fiala di 18 MW x cm d'acqua. Il silicio rimarrà pulito se conservati in acqua per circa tre giorni dopo la pulizia. Assicurarsi che l'area di lavoro è adeguatamente ripulito e l'esterno dei guanti CMOS sono stati lavati. Lasciare la CMGuanti OS nel cappuccio a secco.

6. Depositare Origami DNA su Silicon APTES-funzionalizzati

  1. Auto-assemblato monostrato Formazione su silicio
    1. APTES caldo per RT prima dell'apertura. Se la bottiglia è troppo freddo, condensa può verificarsi, causando idrolisi dei APTES durante la conservazione. Aggiungi 1.980 ml di 18 MW x cm d'acqua e 20 ml di APTES ad una fiala di scintillazione pulito e agitare per mescolare. Utilizzare immediatamente questa soluzione.
    2. Inserire un chip di silicio pulito riflettente-side-up nella fiala di scintillazione, cap, e lasciate riposare per 20 minuti. Rimuovere il chip con una pinzetta e sciacquare con 200 ml di acqua e asciugare per 1 minuto con un flusso di N 2.
  2. Depositare origami di DNA su APTES funzionalizzato Silicon
    Nota: La procedura per il deposito di origami di DNA su silicio funzionalizzato sono analoghi a quelli per il deposito su mica.
    1. Brevemente miscelare il flacone origami di DNA e pipettare 4 ml di soluzionesul substrato di silicio. Se necessario, aumentare il volume della soluzione origami di DNA utilizzati per coprire l'intero substrato come il silicio funzionalizzato è più idrofobico del substrato di mica. Utilizzare una scivolata copertura in vetro a premere la soluzione di deposizione e ad evitare l'evaporazione durante le lunghe deposizioni.
    2. Sia la soluzione riposare per il tempo necessario affinché la concentrazione utilizzata e la copertura desiderata (vedere figure 2 e 3 per l'effetto del tempo e concentrazione sulla copertura di superficie). Sciacquare il substrato con 100 ml di sterile 18 MW x cm acqua e asciugare con N 2 per 1 min.
    3. Ripetere il risciacquo con altri 100 ml di acqua sterile e asciugare il substrato con N 2 per 3 min.
    4. Conservare il campione in un contenitore pulito fino a ulteriori esperimenti o di imaging possono essere eseguiti. Campioni cominciano a mostrare di accumulo del particolato dopo circa uno o due settimane di conservazione a seconda di come much sono gestite.

7. AFM Imaging and Image Analysis di Origami DNA Campioni

  1. Utilizzare AFM in modalità Tapping in aria a scopo di imaging. Toccando modalità assicura che una forza minima sarà applicata alle nanostrutture fragili, rispetto alla modalità di contatto.
    Nota: I parametri di imaging dipenderanno strumento. Tutte le immagini presentate sono state catturate utilizzando una MultiMode Nanoscope IIIa.
  2. Selezionare le sonde AFM per la non-contatto / modalità in aereo toccando, con oro rivestimento riflettente, una frequenza di risonanza (nominale) di ~ 300 kHz, forza costante di 40 N / m, e punta il raggio <10 nm.
  3. Elaborare e analizzare le immagini AFM utilizzando Nanoscope software di analisi. Eseguire calcoli di copertura utilizzando ImageJ. 19

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Representative Results

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Due variabili dettare la copertura di origami di DNA sul substrato: concentrazione della soluzione e il tempo di esposizione. Le caratteristiche di adsorbimento di origami DNA su mica e APTES ossido di silicio funzionalizzate sono state precedentemente riportate. 13 Il rapporto tra la concentrazione di origami di DNA nella soluzione di deposizione e le coperture finali mica sono riassunti nella Tabella 1 e nella Figura 2, che mostra i risultati di concentrazione crescente in una maggiore copertura. La dipendenza dal tempo di legame è visibile in figura 3. La copertura superficiale è stato precedentemente studiato per quantificare il comportamento di legame di Origami DNA su mica e superfici di ossido di silicio modificati. Origami DNA di magnesio 12 mM in tampone TAE 1x ha 83,3% ± 3,1% di copertura su mica dopo 30 min tempo di assorbimento sulla superficie. Massima copertura di ossido di silicio modificato con APTES SAM si osserva dopo 60 min, che è inferiore alla massima copertura su mica. LaOccorre tempo di deposizione più se è richiesta una elevata copertura superficie su APTES funzionalizzati ossido di silicio.

Ci sono diverse variabili che possono causare una cattiva preparazione del campione. Il più fastidioso è inadeguata risciacquo e asciugatura. Se la soluzione tampone non viene risciacquato correttamente, grandi aggregati formano sul substrato (Figura 4A). si osservano "isole di origami di DNA 'quando le nanostrutture aderiscono a macchie di sali di magnesio sulla superficie (Figura 4B). Infine, con campioni coprenti, è possibile disporre di componenti tampone eccesso ponte tra origami DNA individuale (Figura 4C), il che rende difficile distinguere nanostrutture mediante AFM. Questi risultati possono essere evitati seguendo un accurato risciacquo e asciugatura protocollo per entrambi i substrati mica e silicio.

Formazione di pellicole APTES su substrati di ossido di silicio può porre problemi. Wafer di silicio hanno unruvida strato di ossido di silicio che deve essere rimosso e un più agevole, più sottile strato di ossido di silicio riformato prima che possa essere funzionalizzato. Un substrato di silicio pulito correttamente è illustrato nella Figura 5A. Durante la pulizia del wafer di silicio, è importante assicurarsi che il numero di chip di silicio non è troppo alta, in quanto è possibile che due chip a diventare bloccati tra loro, bloccando l'esposizione ai reagenti (Figura 5B). Se silicio puliti è stata conservata in 18 MW x cm di acqua per più di una settimana, lo strato di contaminante si riforma e ripulitura è necessario. La fornitura APTES può anche causare problemi con la preparazione del campione. APTES prontamente polimerizza per idrolisi, che è la base per la formazione monostrato. 20 L'entità di questo polimerizzazione dipende dalla concentrazione di acqua che il APTES è esposta. Nel corso del tempo e l'uso ripetuto, è possibile che l'acqua di condensa all'interno della bottiglia APTES e contaminare lafornitura. La polimerizzazione risultante produce grandi aggregati che aderiscono al substrato (Figura 5C). La maggiore ruvidità e la presenza di aggregati rende identificare nanostrutture di DNA utilizzando AFM difficile. E 'buona norma conservare la bottiglia APTES in un sacchetto di plastica nel frigorifero, e lasciare che il APTES bottiglia calda per RT prima di aprire per evitare la formazione di condensa.

Figura 1
Figura 1. Un ossido di silicio confrontando il meccanismo vincolante per origami DNA (A) mica e (B) APTES funzionalizzato schematica (non in scala). Binding con mica è mediato dalla presenza di cationi bivalenti, solitamente Mg 2+. Un monostrato di ammina protonata terminato 3 amminopropiltrietossisilano è utilizzato per promuovere l'adesione sul substrato di ossido di silicio.

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Figura 2. immagini AFM illustrano copertura variabile dopo 10 min deposizioni di (A) 2 Nm, (B) 4 Nm, e (C) 6 Nm mica. La scala di altezza per tutte le immagini è di 5 nm.

Figura 3
Figura 3. Tendenze nella copertura di superficie per 2 nM origami di DNA in tampone 1x TAE, Mg 12 mm 2+. MICA = linea viola e cerchio marcatori, APTES = linee gialle e marcatori triangolari. N = 3 in determinazione di standard error.

Figura 4
Figura 4. Scarsa risciacquo e asciugatura possono causare (A) soluzione aggregazione sul substrato, (B) isole origami DNA, e (C) bridging di nanostrutture sullacampioni coprenti in presenza di sali tampone in eccesso. La scala di altezza di tutte le immagini è di 5 nm.

Figura 5
Figura 5. (A) Pulire silicio dovrebbe avere RMS rugosità inferiore a 0,5 A più di 1 micron quadrati. Una completa APTES SAM depositato su un buon ossido nativo dovrebbe avere una rugosità RMS meno di 1 Å oltre 1 micron quadrati. (B) APTES pellicola formata su un ossido di silicio non completamente puliti con RMS rugosità di 2,29 nm oltre 1 micron quadrati. . Nota le lacune e rugosità del film APTES (C) APTES superficie formata da un campione di APTES contaminati con rifiuti condensata; idrolisi in forme bottiglia APTES grandi particolato. La scala di altezza per tutte le immagini è di 5 nm.

Tabella 1. Percentuale misure di copertura per sottofondi mica con varying DNA concentrazioni della soluzione origami. Tutti gli orari di deposizione sono 10 min.

Soluzione Origami DNA % Di copertura su Mica substrato
2 nM 8.49 ± 2.67 (N = 5)
4 Nm 55.89 ± 5.65 (N = 3)
6 Nm 77.44 ± 1.89 (N = 4)

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Discussion

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Ci sono diversi passaggi che devono essere sottolineata per ottenere risultati coerenti e ideali. Per i campioni di mica, a seguito di un rigoroso e accurato risciacquo e asciugatura regime, come nelle fasi 3.3 e 3.4, farà in modo che le immagini di alta qualità di origami di DNA dell'individuo possono essere raggiunti utilizzando AFM senza i vari problemi descritti nella sezione risultati rappresentativi. Di importanza primaria per i campioni di silicio è la pulizia del substrato. Seguendo le procedure di pulizia descritte al punto 5.2 accuratamente e meticolosamente assicurerà che una superficie di ossido di silicio opportunamente pulita sarà raggiunto. Inoltre, il monitoraggio della qualità e l'efficacia di sostanze chimiche, come il perossido di idrogeno, acido fluoridrico, e APTES, assicurerà che la procedura senza intoppi.

Le tecniche descritte non sono limitati solo soluzioni acquose di APTES. Un monostrato misto di APTES e cloruro trimethylaminopropyltrimethoxysilyl (TMAC) può essere noied sintonizzare la carica superficiale di silicio e promuovere variabile origami DNA adesione. 11 La TMAC contiene un quaternario terminale carica permanentemente ammina -N (CH 3) 3 +, rispetto alla carica dipendente dal pH sulla APTES. Poiché l'ambiente soluzione non influisce sullo stato protonazione o la carica di TMAC, variando la concentrazione della soluzione di TMAC può sintonizzare la carica superficiale del monostrato misto e influenzano l'interazione tra il substrato ed il origami di DNA. Ottimale origami di DNA legame è stato osservato per monolayers hanno una carica superficiale di 0,75-1,5 oneri / nm 2, che corrisponde a SAM contenente 100% al 40% di concentrazione TMAC. Questa carica superficiale ottimale richiesto coperture origami di DNA di circa 110 origami / micron 2 su APTES SAM e 120 origami / micron 2 su TMAC SAM.

Un vantaggio di silicio è la sua compatibilità con i processi di patterning litografiche. Alta magnesioconcentrazioni possono essere utilizzati con ossidi di silicio trattati al plasma per promuovere legame selettivo di origami DNA silicio. Bisogna fare attenzione quando si rimuove il campione dalla soluzione di deposizione per evitare il risciacquo gli ioni magnesio via e deformare il origami di DNA. 21,22 Le forme di processo APTES covalentemente attaccato cationi sulla superficie di ossido di silicio, in modo da lavaggio o risciacquo con tampone o fa acqua Non danneggiare il origami di DNA in allegato. Il metodo 'decollo molecolare' è un altro possibile percorso per patterning substrati di silicio e la promozione di origami di DNA adesione. Il substrato di silicio è modellata utilizzando litografia a fascio elettronico e APTES viene depositato sul substrato esposto. Dopo decollo del photoresist, origami di DNA può essere depositato sulla superficie modellata, preferenzialmente legandosi alla APTES. 23

L'interazione di origami di DNA con un substrato cambia la sua stabilità, aprendo nuove strade per la ricerca e le applicazioni. Origam DNAho aderito ad mica può essere riscaldato a 150 ° C senza alterazione visibile della dimensione di nanostrutture e delle trasformazioni chimiche minime. 24 Ciò è in netto contrasto con la fragilità di origami di DNA in soluzione, dove le nanostrutture sono completi dehybridized oltre i 70 ° C. 25, 26 Questa stabilità è mantenuta su substrati di ossido di silicio riscaldati. 27 Anche in sistemi solventi diversi, come ad esempio esano, toluene ed etanolo, la forma e la copertura delle nanostrutture sono mantenute. La stabilità sorprendente di origami DNA indica che le applicazioni che in precedenza erano incompatibili, come il plasma potenziata deposizione di vapore, uso di fotoresist comuni e solventi, e ambienti di deposizione chimica unici, possono essere usati in combinazione con origami di DNA. Tuttavia, se l'origami di DNA mantengono la loro funzionalità è ancora sconosciuta e può limitare le possibili applicazioni.

Sebbene la stabilità di origami DNA a temperatura elevatas e in un numero limitato di sistemi solventi è stata determinata, la stabilità a lungo termine di origami di DNA su substrati è ancora sconosciuta. È necessario evitare possibili contaminazioni L'uso di tecniche sterili, ma ciò non può essere evitato dopo la deposizione superficiale. Imaging e analisi dei campioni devono essere completati quasi subito dopo la preparazione del campione; se il campione è immagazzinato per troppo tempo (maggiore di una settimana) vari esempi di degrado campione vengono spesso identificate, anche di accumulo del particolato e DNA nanostrutture rotti. Possibili percorsi di ricerca in nanoelettronica, biosensori, e altre applicazioni del DNA origami substrato a base possono essere limitate dal destabilizzazione dipendente dal tempo del DNA. Identificazione delle limitazioni di queste tecniche per applicazioni che richiedono stabilità per periodi di tempo più lunghi richiede ulteriori indagini.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μl VWR International, LLC 22491733 10 reload tray of 96 tips
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene VWR International, LLC 87003-290 0.65 ml, natural
Research Plus Pippete - Single Channel - 20-200 μl A. Daigger & Company, Inc. EF8960F-3120000054 EACH Adjustable Volume
Research Plus Pippete - Single Channel - 2-20 μl A. Daigger & Company, Inc. EF8960D-3120000038 EACH Adjustable Volume
Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape Office Depot, Inc. 602710 3/4" x 300", Pack of 2
Vortex Mixer Thermo Scientific M37610-33Q
Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm Electron Microscopy Sciences 64917-2 6 per pack
6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat Nova Electronic Materials, Ltd. GC49266
Powder-Free Nitrile Examination Gloves VWR International, LLC 82062-428 Catalog number is for size large
High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating K-Tek Nanotechnology, Inc. HA_NC/15
Autoclave Pan A. Daigger & Company, Inc. NAL692-5000 EF25341C
Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch - 1 dz Spectrum Chemical Mfg. Corp. 106-15055 Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves.
Tweezers PTFE 200 mm Square Dynalon Corp. 316504-0002
Muscovite Mica Sheets V-5 Quality Electron Microscopy Sciences 71850-01 10 per pack
Mica Disc, 10 mm Ted Pella, Inc 50 Mica discs are optional
Scriber Diamon Pen for Glassware VWR International, LLC 52865-005
Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap - 20 ml VWR International, LLC 66022-060 Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner
4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz Dot Scientific, Inc. 6759-200
Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth VWR International, LLC 89043-554 Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached
Standar-Grade Glass Beaker, 250 ml Capacity VWR International, LLC 173506
Beakers, PTFE VWR International, LLC 89026-022 For use with HF
Shallow form watch glass, 3" VWR International, LLC 66112-107 Case of 12
Plastic Storage Container VWR International, LLC 470195-354 For secondary container
General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers VWR International, LLC 89095-564
High precision and ultra fine tweezers Electron Microscopy Sciences 78310-0
Polycarbonate Faceshield Fisher Scientific, Inc. 18-999-4542
Neoprene Apron Fisher Scientific, Inc. 19-810-609
Calcium Gluconate, Calgonate W.W Grainger, Inc. 13W861 Tube, 25 g
Hydrogen Peroxide 30% CR ACS 500 ml Fisher Scientific, Inc. H325 500 HARMFUL, TOXIC
3-Aminopropyltriethoxysilane Gelest Inc. SIA0610.0-25GM Let warm to room temperature before use.
Ammonium hydroxide, 2.5 L Fisher Scientific, Inc. A669-212 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Fisher Scientific, Inc. A144-212 HARMFUL, TOXIC
Hydrofluoric acid Fisher Scientific, Inc. A147-1LB HARMFUL, TOXIC
MultiMode Nanoscope IIIa Veeco Instruments, Inc. Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis
Dunk basket Made in lab Made in lab The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws.

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References

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Preparazione di Mica e Silicon substrati per il DNA Origami Analisi e sperimentazione
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Pillers, M. A., Shute, R., Farchone, A., Linder, K. P., Doerfler, R., Gavin, C., Goss, V., Lieberman, M. Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation. J. Vis. Exp. (101), e52972, doi:10.3791/52972 (2015).More

Pillers, M. A., Shute, R., Farchone, A., Linder, K. P., Doerfler, R., Gavin, C., Goss, V., Lieberman, M. Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation. J. Vis. Exp. (101), e52972, doi:10.3791/52972 (2015).

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