Introduction
Först infördes 2006, utnyttjar DNA origami självorganiserande karaktär DNA-oligonukleotider att producera designable och mycket beställt nanostrukturer. 1 En myriad av strukturer har rapporterats, från smiley ansikten till låst 3-dimensionella lådor. 2 DNA origami kan funktionaliseras med olika biomolekyler och nanostrukturer, vilket ger upphov till forskningsansökningar inom nanoelektronik, medicin och kvantdatorer. 3 Men analysen och många framtida tillämpningar är inte bara beroende av konstruktion, men också på vidhäftningen av DNA origami nanostrukturer till ytor. De metoder som beskrivs i detta manuskript avser framställning av DNA-origami prover på två typer av underlag: glimmer och funktionaliserad kiseloxid.
Glimmer är substratet valt för DNA-origami studier eftersom det är atomiskt platt, med en skikthöjd av 0,37 nm ± 0,02 nm. 4 Det är också easily rengöras, vilket gör provberedning och atomkraftsmikroskopi (AFM) studier okomplicerad. Muskovit glimmer innehåller en hög täthet av kalium i varje klyvningsplanet, men dessa joner diffundera bort från glimmer ytan när den är i vatten. Mediera bindning av DNA-origami till glimmer substrat, Mg2 + används för att vända den negativa laddningen av glimmer och elektrostatiskt binda DNA-fosfatryggraden till substratet (Figur 1A). 5 Blandningar av glödgad DNA i närvaro av stora överskott av stapel strängarna ge hög täckning och bra bilder på glimmer eftersom vidhäftningen av DNA origami till Mg2 + -terminated yta är mycket starkare än vidhäftningen av enkelsträngade oligonukleotider (stapel strängarna). Andra positivt laddade joner, inklusive Ni2 + och Co2 + kan användas för att styra vidhäftningen av DNA på glimmer. 6,7 Ändring av koncentrationen av monovalenta och divalenta katjoner i lösning kan mediera adhEsionen och ytdiffusion andelen DNA-origami. 8 Men protokollet för framställning glimmersubstrat och sätta in och skölja origami ofta inte uttryckligen beskrivs i den publicerade manuskript. 9 Utan en tydlig protokoll, kan reproducerbara resultat vara svårt att få.
Glimmer är en isolator, så det är inte lämpligt som ett substrat för vissa tillämpningar inom nanoelektronik. Silicon passiv med en tunn nativ oxid har önskvärda elektroniska egenskaper, inklusive kompatibilitet med tidigare gratis Metal-Oxide Semiconductor (CMOS) behandling för att skapa input / output strukturer och topografiska egenskaper. Kiselskivor som är lagrade i luft är passiverad med antingen en tjock termisk oxid eller tunna olegerade oxidfilm som är relativt smutsig, med en hög räkna partikelformigt. Kiseloxid har en mycket lägre ytladdningsdensitet än glimmer, och laddningstätheten är mycket beroende av oxid förberedelse och historia. Vid magnesium jonkoncentrationer above 150 mM, goda omfattningar (upp till 4 / im 2) rektangulär DNA origami kan uppnås på syreplasmabehandlade kiselsubstrat; emellertid kan denna koncentration och täckning ändras beroende på storleken och utformningen av nanostrukturer som används. 10 Ett alternativt protokoll för avstämning av ytladdningen är att fästa en katjonisk självmonterat monoskikt av 3-aminopropyltrietoxisilan (APTES) (Figur 1B) till oxiden. Den primära aminen på APTES kan protoneras vid pH-värden under 9, modifiering av laddningen och hydrofobiciteten för substratet. 11 För en fullständig monoskikt av APTES att framgångsrikt deponeras måste kisel lämpligt rengöras med Radio Corporation of America (RCA) protokoll . Dessa protokoll omfattar behandlingar i ammoniumhydroxid och väteperoxidlösningar (RCA1) för att avlägsna organiska rester och partikelföroreningar. En kort etsning i vattenhaltig fluorvätesyralösning avlägsnar skiktet av nativ oxid tillsammans mednågra jonföroreningar som ansluter sig till oxid. Slutligen prover utsatta för en klorvätesyra och väteperoxidlösning (RCA2) för avlägsnande av metall och joniska kontaminanter och bilda ett tunt, likformigt oxidskikt. 12 De flesta renrum har utsett huvar för CMOS rengöringsprotokoll, med strikta regler om vad som kan användas inom dessa områden. Ett vanligt problem kommer i form av joner såsom natrium, vilket kan störa de elektroniska egenskaperna hos CMOS strukturer genom att skapa midbandgap fällor. 13 Joner som vanligen används i DNA-origami förberedelse och deponerings buffertar kan förorena CMOS bad och orsaka problem för andra forskare som använder renrummet. Av denna anledning använder vår grupp en "smutsiga" CMOS rengöringsbänk anordnad speciellt för de små prover som användes för DNA-origami forskning. Denna process är ett bra alternativ till den traditionella renrums set-up och kan vara lämpliga för laboratorier som inte har tillgång till en renrums CMOS bänk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Experiment planering och materialberedning
- Bestämma utformningen, koncentration och funktionalitet av DNA origami som kommer att användas i experimenten. 14-16 Här använder vi en DNA origami rektangel konstruktion framställd i 1x TAE / Mg2 + lösning (40 mM tris-bas, 20 mM ättiksyra, 2 mM EDTA och 12 mM magnesiumacetat, pH 8,0). 17
- Autoklav alla tips, rör och behållare som ska användas. Dessa material måste alla vara autoklav kompatibla.
- Förbered ett förråd av sterilt vatten för sköljning. Fyll en steril burk med ca 500 ml 18 Mohm x cm vatten, plats på en värmeplatta, koka i 5 minuter med locket och ta burken bort från plattan och låt svalna med locket placeras på behållaren men inte åtdragen . Förvara i kylskåp och förbereda en ny leverans varje månad eller vid behov.
2. Förbereda Mica Substrate
- Cut substrat till lämplig storlek (1 cm x 1 cm kvadrater) med en sax. Glimmer är tunn och skör. Alternativt, köpa glimmer i skivform som inte kräver kapning.
- Klyva glimmer med dubbelhäftande tejp. Glimmer är sammansatt av skikt av mineraler åtskilda av interkalaterande joner, kan varje skikt skalas av när följs dubbelhäftande tejp. 18
- Placera glimmer rutor på dubbelhäftande tejp fortfarande i tejpdispensern, vilket gör att den är fäst ordentligt på bandet. Skjut försiktigt pincetten mellan glimmer och bandet, kommer översta lagret tas bort och kvar på bandet. Omedelbart efter avlägsnandet kommer glimmer torget har sin rena sidan vänd nedåt. Var noga med att vända glimmer över innan lagring i en behållare.
- Upprepa detta tre till fyra gånger för att säkerställa fullständigt avlägsnande av den översta lagret och tillräcklig rengöring.
- Alternativt vidhäfta glimmer till en behållare eller bord-topp med en bit dubbelsidig tejp och använda en andra bit för att sMarkera om du vill och dra av det översta glimmer skikt. Glimmer kommer rengöras ordentligt i båda fallen, även om den alternativa metoden gör avsättning DNA och sköljning och torkning av provet svårt på grund av den andra vidhäftningen till bäraren.
3. Sätta DNA Origami på Glimmer
- I korthet, blanda flaskan med DNA-origami med hjälp av en vortexblandare för att säkerställa en jämn spridning av nanostrukturer i lösning.
- Pipett 4 il lösning på glimmer, se till att pipettspetsen inte vidrör underlaget. Låt DNA origami på glimmer i ungefär 10 minuter för att säkerställa tillräcklig täckning. Avsättningstiden varierar beroende på koncentrationen av DNA origami som används samt den önskade täckningen (figurerna 2 och 3).
- Skölj DNA origami lösningen bort av glimmer substrat med användning av 100 pl sterilt vatten över ett handfat eller annan vätska behållare. Plocka upp glimmer med pincett. Pipet vattnet påsubstrat, med flödet av droppen mot spetsen av pincett. Skaka glimmer med en skarp rörelse nedåt för att avlägsna överskottsvatten. Håll pincett upprätt så att vattnet rinner mot pincett för att undvika kontaminering av provet.
- Torka substratet med en stadig ström av kväve (N 2) under 1 minut. Se till att eventuellt överskott av vatten avlägsnas. Upprepa sköljningen med ytterligare 100 pl sterilt vatten. Torka substratet med N 2 under ytterligare 3 minuter. En helt torr substrat är nödvändigt för framgångsrik atomkraftsmikroskopi (AFM) analys (Figur 4).
- Analysera underlaget med hjälp av AFM eller förvara i en sluten behållare.
4. CMOS / Silicon Cleaning Set-up
- VARNING: När du använder CMOS set-up, använda personlig skyddsutrustning vid alla tillfällen. Reagensen innefattar starka syror, starka baser, fluorvätesyra (HF), och starka oxidationsmedel som can reagerar med resterande lösningsmedel om reagenser inte kasseras. Följ följande säkerhetsföreskrifter:
- Hus CMOS bänk i en kemisk huva med några andra processer eller uppställningar.
- Bär nitrilhandskar, labbrock, skyddsglasögon, stora industriella nitril handskar, en spill förkläde, och en visir vid alla tillfällen när du använder CMOS bänken.
- Använd plaströr som sekundär inneslutning när lösningar bereds.
- Använd en inert fluorpolymer mätbägaren för hantering av koncentrerade HF.
- Gör kalciumglukonat salva finns som första hjälpen för alla hudexponering.
- Tillåt endast utbildad personal för att utföra processen.
- Se alltid till en annan medlem av labbet är närvarande i nödfall.
- Håll SDB information för alla kemikalier i närheten av huven.
- Känna till institutionens eller företagets kemiska spill och exponerings politik.
Obs: HF tränger lätt hudenoch är en kalcium asätare, som påverkar ben och skadliga nerver om exponeringen sker. Hudexponering för några milliliter koncentrerad fluorvätesyra kan vara farlig och livshotande. Inrätta nödvändiga åtgärder för att säkerställa exponering förekommer inte.
- Utför RCA1 och RCA2 i en separat 250 ml glasbägare på separata kokplattor. Varje bägare bör innehålla en omrörarstav. Övervakning av temperaturen i lösningen med användning av termometrar klämda så omrörarstaven inte bang in i glödlampan. Täck bägarna med användning av ett urglas för att minska effekterna av indunstning.
- RCA1 Framställning
- Placera 50 ml av 18 MQ x cm vatten i den utsedda RCA1 bägaren med hjälp av en mätning bägare.
- Tillsätt 15 ml koncentrerad ammoniumhydroxid (NH4OH) till bägaren. Skölj mätbägaren med 25 ml vatten och tillsätt sköljvattnet till RCA1 bägare.
- Slå på värmen och omröraren på kokplattan och bringa RCA1 badet till 70 ° C. Tillsätt 15 ml 30% -ig väteperoxid (H 2 O 2) till RCA1 bägare. Använd RCA1 lösning inom en timme efter det att H 2 O 2 har lagts till. Badet kan användas flera gånger inom loppet av tre dagar om 15 ml peroxid tillsättes till badet varje gång.
- Skölj mätbägaren noggrant med vatten och kassera sköljning i en lämplig RCA1 avfallsflaska.
- RCA2 Framställning
- Lägg 70 ml 18 Mohm x cm vatten till den utsedda RCA2 bägaren använder sköljas mätbägare.
- Lägg 15 ml koncentrerad saltsyra (HCl). Skölj mätbägaren med 20 ml vatten och tillsätt det till RCA2 bägaren.
- Öka värmen och rör hastighet värmeplatta tills lösningen når 70 ° C.
- Tillsätt 15 ml 30% H2O 2. Liksom RCA1 badet, använd denna lösning inom en timme från det att H2O 2 tillsätts; dessutom badetkan återanvändas flera gånger inom loppet av tre dagar om 15 ml H2O 2 tillsättes före varje användning.
- HF-lösning Framställning
- Placera 50 ml vatten i ett inert fluorerad polymer bägare.
- Mät 4 ml koncentrerad fluorvätesyra (49%) i plast mätbägaren och lägga till den inerta fluorerade polymeren bägare.
- Skölj ur plasten mätbägare med totalt 50 ml vatten, tillsätta sköljvattnet till HF bägaren. Tvätta ut mätbägaren noggrant med vatten och kassera tvätt i en utsedd HF avfallsbehållare.
5. Förberedelser och Rengöring av kiselsubstratet
- Skärkiselskivor till chips
- Identifiera de vinkelräta och parallella gitter riktningar på den plana polerade ytan av kiselskivan. Dessa riktningar används för att göra klyvnings rutor lättare. Följande instruktioner avser cleaving kisel <110> och kanske inte passar för andra kristallorienteringar.
- Placera kiselskiva polerade-side-up på ett mjukt underlag, till exempel en servett. Använda diamantbestyckade rits penna försiktigt nick botten av skivan längs den primära platt kant. Placera en liten tråd, såsom ett gem, nedanför hacket och tryck försiktigt på skivan genom att placera fingrarna eller pincett på vardera sidan av hacket och trycka ner. Att göra detta kommer att separera skivan i två halvor längs kristallgitterlinjen i naturliga cleave riktning.
- På en annan servett, med en penna och linjal, mäta upp den önskade bredden av kvadrat genom märkning prickar på både toppen och botten av bindan. Anslut dessa punkter med raka linjer. Detta kommer att fungera som en riktlinje för även kvadratiska former.
- Placera en av skivan halvorna kant först mellan de uppmätta linjerna på bindan spolas mot linjen och upprepa i steg 5.1.2 nyligen brutit vinkelrät pieces bör nu vara bredden på kluvna torg. Vrid skivan horisontellt på servetten. Placera den mellan de vinkelräta linjer och upprepa processen i steg 5.1.2.
- Förvara nyligen klyvs rån marker i en ren flaska fylld med avjoniserat vatten för att undvika repor. De kiselchips kan lagras på obestämd tid, men bör rengöras innan experiment.
- CMOS Rengöring av Silicon
- När RCA1 lösningen har nått den lämpliga temperaturen, översvämmas åtta till tio 1 cm x 1 cm kiselbrickor i lösningen med användning av en inert fluorerad polymer korg med en 2 "diameter. Bubblor av syre kommer att ligga på chips och bägare väggar. Om ingen bubblande inträffar H2O 2 försämras. Låt markerna i lösningen under 10 till 20 min, omrörning korgen upp och ner med några minuters mellanrum för att hålla markerna fastnar i varandra.
- Lyft korgen innehåller kiselchips upp och rinna av väl. Flytta korgen över to avfalls bägaren och skölj noga med 18 Mohm x cm vatten. Sänk i tvätt bägaren och litegrann upp och ner under 20 sekunder. Töm korgen och skölj noga med vatten över avfallet bägaren. Töm avfallsbägare i en utsedd RCA1 avfallsflaskan och fyll på med vatten.
- Efter RCA1 rengöring är klar, placera korgen i 1:50 HF bägaren för 10 till 20 sekunder. Använd en mild upp och ner rörelse för att blanda chips och HF. Lyft dunk skopan för att göra det möjligt för HF rinna helt borta.
Obs! Spånytor bör vara hydrofoba; vatten kommer inte att väta chipet, men i stället bilda droppar med höga kontaktvinklar. Detta indikerar att kiseloxid har etsats bort och chipet nu avslutas av Si-H-bindningar. - Placera tvätt bägaren och skölj bägaren i en plastbalja, flytta korgen över skölj bägaren och skölj med 18 Mohm x cm vatten. Sänk korgen i tvätt bägare och rör om 20 sek.
- Fyll i en andra avlopp och Rinse cykel med 18 Mohm x cm vatten. Dumpa tvättvattnet i skölj bägaren och fylla tvätt bägaren med vatten. Häll allt avfall till anvisad plast HF avfallsflaska.
- När RCA2 lösningen har nått den lämpliga temperaturen, dränka kiselchips i lösningarna med hjälp av korgen. Låt i lösningen i 10 till 20 minuter. Chipet kommer nu att vara hydrofilt på grund av tillväxt av ett tunt (1-2 nm) oxidfilm.
- Ta bort efter lämplig tid och följer samma sköljnings förfaranden som för RCA1. Ta hand om avfallet i lämplig RCA2 avfallsbehållare. Ta bort varje chip från korgen med plast pincett, skölj med vatten, och föna med kväve.
- Förvara chips i en plastskiva låda eller i en injektionsflaska med 18 MQ x cm vatten. Kisel förblir ren när förvaras i vatten i cirka tre dagar efter rengöring. Se till att arbetsområdet är ordentligt rengjorda upp och utsidan av CMOS-handskarna har tvättats. Lämna CMOS handskar i huven för att torka.
6. Sätta DNA Origami på APTES-funktion Silicon
- Själv monterade monolager Formation på Silicon
- Varma APTES till RT före öppning. Om flaskan är för kallt, kan kondens uppstå med hydrolys av APTES under lagring. Lägg 1.980 il 18 MQ x cm vatten och 20 pl APTES till en ren scintillationsampull och snurra för att blanda. Använd denna lösning omedelbart.
- Placera en rengjord kiselchip reflekterande sida upp i scintillationsflaska, råga, och låt sitta i 20 minuter. Avlägsna chipet med användning av pincett och skölj med 200 fil vatten och torka i en minut med en ström av N2.
- Avsättning av DNA-origami på APTES funktionaliserad Kisel
Obs: Stegen för deponering DNA origami på funktion kisel motsvarar dem för avsättning på glimmer.- Blanda kort DNA-origami flaskan och pipett 4 il lösningpå kiselsubstratet. Om det behövs, öka volymen av DNA-origami lösning som används för att täcka hela underlaget som den funktionaliserade kisel är mer hydrofoba än glimmer substratet. Använd en glaskupa slip att trycka avsättningslösningen ner och förhindra avdunstning under långa nedfall.
- Låt lösningen stå under den tid som krävs för den använda koncentrationen och den önskade täckningen (se figurerna 2 och 3 för effekten av tid och koncentration på yttäckning). Skölj substratet med 100 ul steril 18 MQ x cm vatten och torka med N2 under 1 minut.
- Upprepa sköljningen med ytterligare 100 | il sterilt vatten och torka substratet med N2 under 3 min.
- Förvara provet i en ren behållare tills ytterligare experiment eller avbildning kan utföras. Prover börja visa partikel ackumulering efter cirka en till två veckor för lagring beroende på hur much de hanteras.
7. AFM Imaging och bildanalys av DNA Origami Prover
- Använd AFM i Tapping läge i luften för avbildningsändamål. Gängläge ser till att så lite kraft kommer att tillämpas på de bräckliga nanostrukturer, jämfört med kontaktläge.
Anmärkning: De avbildningsparametrar kommer att vara beroende på instrumentet. Alla bilder som presenteras har tagits med en Multinanoscope Illa. - Välj AFM sonder för icke-kontakt / knacka läge i luft, med guld reflekterande beläggning, en resonansfrekvens (nominellt) på ~ 300 kHz, kraftkonstant på 40 N / m, och spetsradie <10 nm.
- Process och analysera AFM-bilder med hjälp av Nanoscope Analysis Software. Utför täckningsberäkningar med ImageJ. 19
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Två variabler diktera täckningen av DNA-origami på substratet: lösningens koncentration och exponeringstid. De adsorptionsegenskaper av DNA origami på glimmer och APTES funktionaliserad kiseloxid har tidigare rapporterats. 13 Förhållandet mellan koncentrationen av DNA-origami i avsättningslösningen och de slutliga omfattningar på glimmer är sammanfattade i tabell 1 och figur 2, som visar ökande resultat koncentrations ökad täckning. Den tidsberoende bindning ses i fig 3. Yttäckning tidigare studerats för att kvantifiera bindningsbeteendet av DNA origami på glimmer och modifierade kiseloxidytor. DNA origami i 12 mM magnesium i 1x TAE-buffert har 83,3% ± 3,1% täckning på glimmer efter 30 min absorption tid på ytan. Maximal täckning på kiseloxid modifierad med APTES SAMs observeras efter 60 minuter, vilket är mindre än den maximala täckning på glimmer. ENDet behövs längre avsättning tid om det krävs en hög yttäckning på APTES funktionkiseloxid.
Det finns flera variabler som kan orsaka dålig provberedning. Det mest besvärande är otillräcklig sköljning och torkning. Om buffertlösningen inte sköljes ordentligt, stora aggregat bildas på substratet (Figur 4A). "DNA-origami öar" observeras när nanostrukturer följer fläckar av magnesiumsalter på ytan (Figur 4B). Slutligen, med hög täckning prover, är det möjligt att ha överskott buffertkomponenter överbryggande mellan enskilda DNA origami (Figur 4C), vilket gör det svårt att skilja nanostrukturer med hjälp av AFM. Dessa resultat kan undvikas genom att följa en grundlig sköljning och torkning protokoll för både glimmer och kiselsubstrat.
Bildning av APTES filmer på kiseloxid substrat kan innebära problem. Kiselskivor har engrov kiseloxidskikt som måste tas bort och en mjukare, tunnare kiseloxidskikt reformeras innan det kan funktionaliseras. Ett ordentligt rengjorda kiselsubstrat visas i figur 5A. Under rengöring av kiselskivan, är det viktigt att se till att antalet kiselchips inte är för hög, eftersom det är möjligt för två chips för att fastna vid varandra, blockering exponering för reagensen (Figur 5B). Om rengöras kisel har lagrats i 18 Mohm x cm vatten för mer än en vecka, kommer föroreningsskiktet reformera och recleaning är nödvändigt. Den APTES utbudet kan också orsaka problem med provberedning. APTES polymeriserar lätt genom hydrolys, vilket är grunden för monoskiktet bildas. 20 Omfattningen av denna polymerisation är beroende på koncentrationen av vatten som den APTES är utsatt för. Med tiden och genom upprepad användning, är det möjligt för vatten att kondensera inuti APTES flaskan och förorenaleverans. Den resulterande polymerisationen producerar stora aggregat som följer underlaget (Figur 5C). Den ökade grovhet och närvaro av aggregat gör att identifiera DNA nanostrukturer med hjälp av AFM svårt. Det är god praxis att lagra APTES flaskan i en plastpåse i kylen och låt APTES flaska varm RT innan du öppnar för att undvika kondens.
Figur 1. En schematisk jämförelse av bindande mekanism för DNA origami på (A) glimmer och (B) APTES funktionaliserad kiseloxid (ej skalenlig). Bindning med glimmermedieras av närvaron av divalenta katjoner, vanligen Mg2 +. Ett monoskikt av den protonerade aminterminerade 3-aminopropyltrietoxisilan används för att gynna vidhäftning på kiseloxidsubstrat.
<img alt = "Bild 2" src = "/ filer / ftp_upload / 52972 / 52972fig2highres.jpg" width = "700" />
Figur 2. AFM-bilder illustrerar variabel täckning efter 10 min nedfall av (A) 2 nM, (B) 4 nM, och (C) 6 nM på glimmer. Höjden skala för alla bilder är 5 nm.
Figur 3. Utvecklingen av yttäckning för 2 nM DNA origami i 1x TAE-buffert, 12 mM Mg 2+. MICA = lila linje och cirkelmarkörer, APTES = gula linjer och triangelmarkörer. N = 3 i fastställandet av standardfelet.
Figur 4. Dålig sköljning och torkning kan orsaka (A) lösning aggregering på substratet, (B) DNA-origami öar, och (C) överbryggning av nanostrukturer påhög täckning prover i närvaro av överskott av buffertsalter. Höjden skala för alla bilder är 5 nm.
Figur 5. (A) Rengör kisel bör ha RMS ojämnhet som är mindre än 0,5 A över 1 kvadrat mikron. En komplett APTES SAM deponeras på en bra nativ oxid bör ha en RMS ojämnhet som är mindre än 1 A över 1 kvadrat mikron. (B) APTES film bildad på en ofullständigt rengjorda kiseloxid med RMS råhet 2,29 nm över 1 kvadrat mikron. . Notera luckor och ojämnheter i APTES filmen (C) APTES yta bildad av ett urval av APTES kontaminerade med kondenserad avfall; hydrolys i APTES flaskformer stora partiklar. Höjden skala för alla bilder är 5 nm.
Tabell mätningar 1. procents täckning för glimmersubstrat med varying DNA origami lösningskoncentrationer. Alla avsättningstider är 10 minuter.
| DNA Origami Lösning | % Täckning på Mica Substrate |
| 2 nM | 8,49 ± 2,67 (n = 5) |
| 4 nM | 55,89 ± 5,65 (n = 3) |
| 6 nM | 77,44 ± 1,89 (n = 4) |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera steg som måste betonas att uppnå konsekventa och perfekt resultat. För glimmer prover, efter en strikt och noggrann sköljning och torkning regim, som i steg 3.3 och 3.4, kommer att se till att bilder av enskilda DNA-origami högkvalitativa kan uppnås med hjälp av AFM utan de olika problem som beskrivs i avsnittet Resultat representanten. Av största vikt för kiselprover är städning av underlaget. Efter rengöringsrutiner som beskrivs i steg 5,2 noggrant och minutiöst kommer att säkerställa att ett lämpligt rengjorda kiseloxid yta uppnås. Dessutom, övervaka kvaliteten och effektiviteten av kemikalier, såsom väteperoxid, fluorvätesyra, och APTES, kommer att se till att förfarandet löper smidigt.
De tekniker som beskrivs är inte begränsade till enbart vattenlösningar av APTES. En blandad monolager av APTES och trimethylaminopropyltrimethoxysilyl (TMAC) kan vara ossed att ställa kiselytan avgift och främja variabel DNA origami vidhäftning. 11 TMAC innehåller en permanent laddad terminal kvartar amin-N (CH 3) 3 +, jämfört med pH-beroende laddning APTES. Eftersom lösningen miljön inte påverkar protonetillståndet eller laddningen hos TMAC, variera lösningskoncentration av TMAC burk avstämma ytladdningen hos det blandade monoskiktet och påverka interaktionen mellan substratet och DNA origami. Optimal DNA-origami bindning observerades för monoskikt som har en ytladdning av 0,75-1,5 laddningar / nm 2, vilket motsvarar SAM innehållande 100% till 40% TMAC koncentration. Denna optimala ytladdning uppmanas DNA origami omfattningar av cirka 110 origami / um 2 på APTES SAMs och 120 origami / um 2 på TMAC SAM.
En fördel med kisel är dess förenlighet med litografiska mönstring processer. Hög magnesiumkoncentrationer kan användas med plasmabehandlade kiseloxider för att främja selektiv bindning av DNA origami till kisel. Man måste vara försiktig när du tar bort provet från deponerings lösning för att undvika att skölja magnesiumjoner bort och deformerar DNA origami. 21,22 De APTES processformer kovalent fästa katjoner på kiseloxidytan, så tvättning eller sköljning med buffert eller vatten gör inte skada den bifogade DNA origami. Den "molekylära liftoff metoden är en annan möjlig väg för mönstring kiselsubstrat och främja DNA origami vidhäftning. Kiselsubstratet mönstras med användning av elektronstrålelitografi och APTES är avsatt på det exponerade substratet. Efter uppskjutningen av fotoresisten kan DNA origami avsättas på den mönstrade ytan, preferentiellt bindning till APTES. 23
Samspelet mellan DNA origami med ett substrat ändrar dess stabilitet, vilket öppnar nya vägar för forskning och tillämpningar. DNA origamJag följs glimmer kan värmas till 150 ° C utan synlig förändring av nanostruktur dimensioner och minimala kemiska förändringar. 24 Detta står i skarp kontrast till den bräckliga DNA origami i lösning, där nanostrukturer är kompletta dehybridiserad över 70 ° C. 25 26 Denna stabilitet upprätthålls på uppvärmda kiseloxid substrat. 27 Även i olika lösningsmedelssystem, såsom hexan, toluen och etanol, form och omfattning av nanostrukturer bibehålls. Den överraskande stabiliteten av DNA origami indikerar att applikationer som tidigare ansågs oförenliga, såsom plasmaförstärkt ångavsättning, användning av vanliga fotoresister och lösningsmedel, och unika kemiska deponerings miljöer, kan användas i samband med DNA-origami. Men om DNA-origami behålla sin funktionalitet är fortfarande okänd och kan begränsa möjliga tillämpningar.
Fastän stabiliteten hos DNA-origami vid förhöjd temperaturs och i ett begränsat antal lösningsmedelssystem har fastställts, är fortfarande okänd den långsiktiga stabiliteten av DNA origami på substrat. Användningen av sterila tekniker är nödvändig för att undvika eventuell kontaminering, men detta kan inte undvikas efter ytan nedfall. Imaging och provanalys måste fyllas nästan omedelbart efter provberedning; Om provet lagras för länge (mer än en vecka) olika exempel på prov nedbrytning är ofta identifieras, inklusive partikelansamling och trasiga DNA nanostrukturer. Möjliga forsknings vägar i nanoelektronik, biosensing, och andra substrat baserad DNA-origami program kan begränsas av tidsberoende destabilisering av DNA. Identifiera de begränsningar för dessa tekniker för tillämpningar som kräver stabilitet under längre tidsperioder kräver ytterligare utredning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μl | VWR International, LLC | 22491733 | 10 reload tray of 96 tips |
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR International, LLC | 87003-290 | 0.65 ml, natural |
| Research Plus Pippete - Single Channel - 20-200 μl | A. Daigger & Company, Inc. | EF8960F-3120000054 EACH | Adjustable Volume |
| Research Plus Pippete - Single Channel - 2-20 μl | A. Daigger & Company, Inc. | EF8960D-3120000038 EACH | Adjustable Volume |
| Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape | Office Depot, Inc. | 602710 | 3/4" x 300", Pack of 2 |
| Vortex Mixer | Thermo Scientific | M37610-33Q | |
| Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm | Electron Microscopy Sciences | 64917-2 | 6 per pack |
| 6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat | Nova Electronic Materials, Ltd. | GC49266 | |
| Powder-Free Nitrile Examination Gloves | VWR International, LLC | 82062-428 | Catalog number is for size large |
| High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating | K-Tek Nanotechnology, Inc. | HA_NC/15 | |
| Autoclave Pan | A. Daigger & Company, Inc. | NAL692-5000 EF25341C | |
| Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch - 1 dz | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | 106-15055 | Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves. |
| Tweezers PTFE 200 mm Square | Dynalon Corp. | 316504-0002 | |
| Muscovite Mica Sheets V-5 Quality | Electron Microscopy Sciences | 71850-01 | 10 per pack |
| Mica Disc, 10 mm | Ted Pella, Inc | 50 | Mica discs are optional |
| Scriber Diamon Pen for Glassware | VWR International, LLC | 52865-005 | |
| Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap - 20 ml | VWR International, LLC | 66022-060 | Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner |
| 4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz | Dot Scientific, Inc. | 6759-200 | |
| Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth | VWR International, LLC | 89043-554 | Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached |
| Standar-Grade Glass Beaker, 250 ml Capacity | VWR International, LLC | 173506 | |
| Beakers, PTFE | VWR International, LLC | 89026-022 | For use with HF |
| Shallow form watch glass, 3" | VWR International, LLC | 66112-107 | Case of 12 |
| Plastic Storage Container | VWR International, LLC | 470195-354 | For secondary container |
| General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers | VWR International, LLC | 89095-564 | |
| High precision and ultra fine tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78310-0 | |
| Polycarbonate Faceshield | Fisher Scientific, Inc. | 18-999-4542 | |
| Neoprene Apron | Fisher Scientific, Inc. | 19-810-609 | |
| Calcium Gluconate, Calgonate | W.W Grainger, Inc. | 13W861 | Tube, 25 g |
| Hydrogen Peroxide 30% CR ACS 500 ml | Fisher Scientific, Inc. | H325 500 | HARMFUL, TOXIC |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | Gelest Inc. | SIA0610.0-25GM | Let warm to room temperature before use. |
| Ammonium hydroxide, 2.5 L | Fisher Scientific, Inc. | A669-212 | HARMFUL, TOXIC |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific, Inc. | A144-212 | HARMFUL, TOXIC |
| Hydrofluoric acid | Fisher Scientific, Inc. | A147-1LB | HARMFUL, TOXIC |
| MultiMode Nanoscope IIIa | Veeco Instruments, Inc. | Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis | |
| Dunk basket | Made in lab | Made in lab | The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws. |
References
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
- Anderson, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459, 73-77 (2009).
- Wang, Z., Ding, B. Engineering DNA Self-Assemblies as Templates for Functional Nanostructures. Acc. Chem. Res. 47, 1654-1662 (2014).
- Xu, K., et al. Graphene Visualizes the First Water Adlayers on Mica at Ambient Conditions. Science. 329, 1188-1191 (2010).
- Bustamante, C., et al. Circular DNA-molecules imaged in air by scanning force microscopy. Biochemistry. 31, 22-26 (1992).
- Hsueh, C., et al. Localized Nanoscopic Surface Measurements of Nickel-Modified Mica for Single-Molecule DNA Sequence Sampling. ACS Appl Mater. Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Pastre, D., et al. Anionic polyelectrolyte adsorption on mica mediated by multivalent cations: A solution to DNA imaging by atomic force microscopy under high ionic strengths. Langmuir. 22, 6651-6660 (2006).
- Woo, S., et al. Self-assembly of two-dimensional DNA origami lattices using cation-controlled surface diffusion. Nature Communications. 5, 4889 (2014).
- Vesenka, J., et al. Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope. Ultramicroscopy. 42-44, 1243-1249 (1992).
- Adsorption studies of DNA origami on silicon dioxide. Albrechts, B., et al. 21st Micromechanics and Micro Systems Europe Workshop 2010, , (2010).
- Sarveswaran, K., et al. Adhesion of DNA Nanostructures and DNA Origami to lithographically patterned self-assembled monolayers in Si[100]. Proc. of SPIE-Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M-1 (2010).
- Kern, W., Puotien, D. A. Cleaning solutions based on hydrogen peroxide for use in silicon semiconductor technology. RCA Rev. 31, 187-206 (1970).
- Pillers, M., Goss, V., Lieberman, M. Electron-Beam Lithography and Molecular Liftoff for Directed Attachment of DNA Nanostructures on Silicon: Top-down Meets Bottom-up. Acc. Chem. Res. 47, 1759-1767 (2014).
- Saccá, B., Niemery, C. M. DNA Origami: The Art of Folding DNA. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 58-66 (2012).
- Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37, 5001-5006 (2009).
- Ben-Ishay, E., et al. Designing a Bio-responsive Robot from DNA. Origami. J. Vis. Exp. (77), e50268 (2013).
- Woo, S., et al. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nature Chemistry. 3, 620-627 (2011).
- Schlegel, M. L., et al. Cation sorption on the muscovite (001) surface in chloride solutions using high-resolution X-ray reflectivity. Geochim. Cosmochim. Acta. 70, 3549-3565 (2006).
- Rasband, W. S., Howarter, J. A., et al. National Institutes of Health. Langmuir. 22, Bethesda, Maryland, USA. 11142-11147 (2006).
- Kershner, R. J., et al. Placement and orientation of individual DNA shapes on lithographically patterned surfaces. Nature Nanotechnology. 4, 557-561 (2009).
- Hung, A. M., et al. Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed by lithographically confined DNA origami. Nature Nanotechnology. 5, 121-126 (2010).
- Sarveswaran, K., et al. et al.Adhesion of DNA nanostructure and DNA origami to lithographically patterned self-assembled monolayers on Si[100. Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M (2010).
- Pillers, M. A., Lieberman, M. Thermal stability of DNA origami on mica. J. Vac. Sci. Technol. B. 32, 040602 (2014).
- Song, J., et al. Direct Visualization of Transient Thermal Response of a DNA. Origami. J. Am. Chem. Soc. 134, 9844 (2012).
- Wei, X., et al. Mapping the thermal behavior of DNA origami nanostructures. J. Am. Chem. Soc. 135 (16), 6165-6176 (2013).
- Hyojeong Kim,, et al. Stability of DNA Origami Nanostructures under Diverse Chemical Environments. Chem. Mater. 26, 5265-5273 (2014).
