Abstract
Membraan receptor-ligand-interacties mediëren vele cellulaire functies. Bindingskinetiek en downstream signalering veroorzaakt door deze moleculaire interacties worden waarschijnlijk beïnvloed door de mechanische omgeving waarin binding en signalering plaatsvinden. Een recente studie toonde aan dat mechanische kracht antigen herkenning door kunnen regelen en activeren van de T-celreceptor (TCR). Dit werd mogelijk gemaakt door een nieuwe technologie die we ontwikkeld en genoemd fluorescentie biomembraan kracht sonde (fBFP), die single-molecule kracht spectroscopie gecombineerd met fluorescentiemicroscopie. Met behulp van een ultra-soft menselijke rode bloedcellen als gevoelige krachtsensor, een high-speed camera en real-time imaging volgtechnieken, de fBFP is ~ 1 pN (10 -12 N) ~ 3 nm tot ~ 0,5 msec kracht, ruimtelijke en temporele resolutie. Met de fBFP, kan men precies enkele receptor-ligand bindingskinetiek onder dwang regelgeving en tegelijkertijd het binding-geactiveerd intracellulaire cal metenCium signalering op een enkele levende cellen. Deze nieuwe technologie kan worden gebruikt om andere membraan receptor-ligand interactie en signalering bestuderen andere cellen onder mechanische regeling.
Introduction
Cel-cel en cel-extracellulaire matrix (ECM) adhesie wordt gemedieerd door binding tussen celoppervlakreceptoren ECM proteïnen, en / of lipiden 1. Binding cellen mogelijk maakt functionele structuur 1 vormen, alsmede erkennen communiceren, en reageren op de omgeving 1-3. Unlike oplosbare proteïnen (bijvoorbeeld cytokines en groeifactoren) die binden van een driedimensionaal (3D) vloeistoffase op het celoppervlak receptoren, celadhesie receptoren vormen banden met hun liganden over een smalle spleet junctie met twee tegenover elkaar gelegen oppervlakken die moleculaire beperken overbruggen diffusie in een dimensionale (2D) interface van 4-7 twee. In tegenstelling tot 3D kinetiek die vaak worden gemeten met traditionele binding assays (bijvoorbeeld oppervlakte plasmon resonantie of SPR), 2D kinetiek te kwantificeren met gespecialiseerde technieken zoals atomaire kracht microscopie (AFM) 10/08, stromingskamerinfusie 11,12, micropipet 13,14, optischepincet 15 en biomembraan kracht sonde (BFP) 16-21.
Meer dan louter fysieke koppeling verschaffen voor mobiele samenhang adhesiemoleculen zijn een belangrijke component van de signalering machines voor de cel te communiceren met de omgeving. Er is toenemende belangstelling voor het begrip hoe ligand betrokkenheid van adhesiemoleculen initieert intracellulaire signalering en hoe de eerste signaal wordt getransduceerd in de cel geweest. Intuïtief, eigenschappen van receptor-ligand binding kan invloed hebben op de signalen induceert. Het is echter moeilijk om mechanistische relaties tussen de extracellulaire en intracellulaire interactie signaleringsgebeurtenissen ontleden met traditionele ensemble van biochemische assays vanwege de vele beperkingen, zoals een slechte tijdsresolutie en het totale gebrek aan ruimtelijke resolutie. Bestaande methoden die zowel biofysische (2D receptor-ligand bindingskinetiek) toestaan en biochemische (signalering) opmerkingen over live-cellen omvatten substraten van instelbare stijfheid 22, elastomeer pijler arrays 23 en stroom kamer / microfluïdische apparaten opgenomen met fluorescentie vermogen 24-26. Echter, uitlezingen van signalering en receptor-ligand binding hebben (meestal door verschillende mogelijkheden) afzonderlijk te verkrijgen, waardoor het moeilijk om temporele en ruimtelijke relaties van obligatiekenmerken met signalerende gebeurtenissen ontleden.
Conventionele BFP is een ultragevoelige kracht spectroscopie met hoge spatiotemporele resolutie 17. Het maakt gebruik van een flexibele rode bloedcellen (RBC) als een kracht sensor, waardoor de meting van de single-molecule 2D-kinetiek, mechanische eigenschappen en conformationele veranderingen 14,16,19-21,27-29. Een fluorescerende beeldvorming gebaseerd BFP (fBFP) correleert de receptor-ligand binding kinetiek met de bindende geactiveerd cell signaling in single-molecule schaal. Met deze opstelling, in situ cell signaling-activiteiten in het kader van het oppervlak mechanical stimulering werd waargenomen in T-cellen 27. De fBFP is veelzijdig en kan worden gebruikt voor onderzoek naar celadhesie en signalering gemedieerd door andere moleculen in andere cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de richtlijnen van en is door het menselijk onderzoek ethische commissie van het Georgia Institute of Technology zijn goedgekeurd.
1. Human RBC Isolatie, Biotinylatie en Osmolariteit Aanpassing
Opmerking: Stap 1.1 moet worden uitgevoerd door een opgeleide medische professional zoals een verpleegkundige, met een Institutional Review Board goedgekeurd protocol.
- Verkrijgen 8-10 gl (één druppel) van bloed van vingerprik en aan 1 ml van het carbonaat / bicarbonaatbuffer (Tabel 1 en 2). Voorzichtig vortex of pipet het mengsel en centrifugeer gedurende 1 min bij 900 x g. Gooi supernatant en was eens te meer.
- In een klein bekerglas te wegen 3.5-4 mg biotine-PEG3500-NHS linker (tabel 1). Oplossen in carbonaat / bicarbonaatbuffer de eindconcentratie 3 mg / ml te maken.
- Meng 171 ul carbonaat / bicarbonaatbuffer, 10 pl RBC pakket en 1049 glBiotine-PEG3500-NHS linker-oplossing en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Was de RBC eenmaal met carbonaat / bicarbonaatbuffer en vervolgens tweemaal met N2-5% buffer (Tabel 1 en 2).
- Doe ondertussen de linker fles met dop losgekomen in een glazen vacuüm exsiccator gevuld met droogmiddelen in de bodem en vacuüm gedurende 5 min, en vervult de exsiccator met argon. Draai de dop en neem de fles uit. Dicht de fles met plastic folie paraffine (tabel 1), plaatst deze in een bak met droogmiddelen op de bodem en berg -20 ° C.
Opmerking: De stappen die het gebruik van biotine-PEG3500-NHS linker omvatten, waaronder 1.2-1.4 (behalve de incubatie en wassen in 1,3), moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd. - Verdun nystatine in N2-5% buffer tot een eindconcentratie van 40 ug / ml te maken. Meng 5 pl gebiotinyleerd RBC met 71,4 gl nystatine (tabel 1) oplossing en incubeer gedurende 1 uur bij 0 &# 176; C. Tweemaal wassen met N2-5% buffer en winkel met N2-5% buffer + 0,5% BSA (Tabel 1) in de koelkast (4 ° C).
2. Glass Bead silanisatie
- Reinigen van Bead Surface
- Weeg 50 mg glasparels poeder en opnieuw op te schorten ze in 500 ul van DI water.
- Meng 0,5 ml 30% H 2 O 2 (tabel 1) met 9,5 ml DI water in een bekerglas van 50 ml, voeg vervolgens 2 ml geconcentreerd NH4OH (tabel 1) en breng deze oplossing een verwarmingsketel op een hete plaat .
- Voeg de glasparels de kokende oplossing en laat koken gedurende nog 5 min. Draai de oplossing elke min.
- Na het koken, dragen ~ 5 ml van deze hete kraal ophanging in een 15 ml micro-centrifugebuis en vul met RT DI water. Centrifugeer bij 3500 xg gedurende 5 minuten, te verwijderen en gooi het supernatant.
- Transfer nog 5 ml heet kraal schorsing en toe te voegen aan de gewassen kralen, Bijvullen met meer DI water, meng goed en centrifuge opnieuw. Herhaal deze procedure tot ongeveer 50 ml gedeïoniseerd water wordt gebruikt, die in totaal 4-5 maal wassen wordt.
- Breng de parelsuspensie in een 1 ml ampul. Herhaal het wassen van de bolletjes met methanol (tabel 1) door centrifugeren bij 17.000 xg gedurende 5 min gedurende 3 keer, en uiteindelijk resuspendeer de kralen in 1 ml 100% methanol.
- Bead Surface thiolering
- Aan een 50 ml centrifugebuis voeg 45,6 ml methanol, 0,4 ml azijnzuur (Tabel 1), 1,85 ml gedeïoniseerd water, 1,15 ml 3-mercaptopropyltrimethoxysilaan (MPTMS) (Tabel 1) en 1 ml parels suspensie bereid in 2,1, Vervolgens incuberen bij kamertemperatuur 3 uur.
- Na de reactie verwijdert alle reactanten door eenmaal wassen met verse methanol en resuspendeer de parels in 500 pl methanol. Gelijkmatig verdelen deze geconcentreerde glazen kraal suspensie in een set van 20 droge en schone glazen flesjes metschroefdoppen. Verdampen van de methanol met behulp van een straal droge argon langzaam draaien de flesjes teneinde een dunne laag droog kralen geven aan de zijkanten van elk flesje.
- Plaats de flacons van kralen in een voorverwarmde oven op 120 ° C gedurende 5 minuten en daarna nemen en snel plaats de dop (s) losjes op. Plaats de flesjes in een glazen vacuumexsiccator gevuld met droogmiddelen in de bodem en stofzuigen de exsiccator met een vacuümpomp tot gekoeld.
- Spoel de gestofzuigd exsiccator met droge argon aan de exsiccator tot normale atmosferische druk te brengen. Verwijder de exsiccator deksel en snel draai de dop (s) op de flacon. Dicht de flesjes met plastic paraffine film en bewaar ze bij kamertemperatuur in een droge donkere opbergdoos.
- Bij onmiddellijk gebruik, neem een flacon droge korrels en eenmaal wassen met fosfaatbuffer (tabellen 1 en 2), resuspendeer in 50 gl fosfaatbuffer en bewaar bij 4 ° C. Deze geconcentreerde kraal preparaat wordt hiernaals "MPTMS beads" in de volgende stappen.
Opmerking: Met de juiste opslag, kon MPTMS kralen functioneel voor maximaal drie maanden blijven.
3. Bead functionalisering
- Covalent Coating eiwitten op Beads
- Neem een bepaald volume (bijvoorbeeld 2,5 pl) van het eiwit bouillon en meng met een gelijk volume van carbonaat / bicarbonaat buffer oplossing 1 te maken.
Opmerking: Het volume afhankelijk van de voorraad concentratie en het gewenste uiteindelijke plaatsdichtheid van het eiwit op het oppervlak korrels. - In een klein bekerglas te wegen 2-3 mg MAL-PEG3500-NHS linker (tabel 1) en los het met carbonaat / bicarbonaat buffer tot een uiteindelijke concentratie van 0,231 mg / ml te bereiken.
- Meng Oplossing 1 met een gelijk volume van de linker bereid in 3.1.2. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 min om Oplossing 2 te maken.
- Ondertussen, plaats de linker fles met losgemaakte dop in een glas vacuümexsiccator filled met droogmiddelen in de bodem en vacuüm gedurende 5 minuten, en vul de exsiccator met argon. Draai de dop en neem de fles uit. Dicht de fles met plastic folie paraffine, plaatst deze in een bak met droogmiddelen op de bodem en berg -20 ° C.
Opmerking: De stappen die het gebruik van MAL-PEG3500-NHS linker omvatten, waaronder 3.1.2-3.1.4 (behalve de incubatie in 3.1.3), moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd. - Meng 5 ui MPTMS kralen met Oplossing 2 en voeg fosfaatbuffer (tabel 1) tot een eindvolume van 250 pl te maken.
- Incubeer de korrels een nacht bij kamertemperatuur, 3 keer wassen met fosfaatbuffer en resuspendeer in 100 ul fosfaatbuffer en bewaar bij 4 ° C.
- Neem een bepaald volume (bijvoorbeeld 2,5 pl) van het eiwit bouillon en meng met een gelijk volume van carbonaat / bicarbonaat buffer oplossing 1 te maken.
- Voorbereiding Eiwit / Streptavidine (SA) Coated Beads
- Volg protocol 3.1.1-3.1.4.
- Meng 5 ui MPTMS kralen met Oplossing 2 en 5 gl 4 mg / ml streptavidine-maleïmide (SA-MAL) (Tabel 1) Oplossing en voeg fosfaatbuffer tot een eindvolume van 250 pl te maken.
- Incubeer de korrels een nacht bij kamertemperatuur, 3 keer wassen met fosfaatbuffer en uiteindelijk resuspendeer in 100 ul fosfaatbuffer en bewaar bij 4 ° C.
- Coating Streptavidine op glaskralen
- Meng 5 ui MPTMS kralen met 5 gl 4 mg / ml SA-oplossing en voeg 140 pl fosfaatbuffer.
- Incubeer de korrels een nacht bij kamertemperatuur, 3 keer wassen met fosfaatbuffer en resuspendeer in 50 gl fosfaatbuffer en bewaar bij 4 ° C.
- Coaten van de SA Coated Beads met een Gebiotinyleerd Protein
- Meng 5 ui SA beklede parels met het eiwit (volume afhankelijk van de gewenste coating dichtheid) en voeg fosfaatbuffer om het uiteindelijke volume op 100 pl.
- Incubeer het mengsel overnacht bij 4 ° C of gedurende 3 uur bij kamertemperatuur, 3 keer wassen met fosfaatbuffer, en resuspendeer in 50 gl phosphate buffer en opgeslagen bij 4 ° C.
4. Celbereiding
Opmerking: Om de cellen T-cellen 27 of bepaalde cellijnen 21,29 zuiveren volgens standaardprocedures cell zuiveringsprotocollen overeenkomend met die van cellen gebruikt, bijvoorbeeld.
- Voor fBFP experimenten, wanneer de celsuspensie wordt bereid, voeg fura2-AM (tabel 1), opgelost in DMSO aan de celsuspensie tot een eindconcentratie van 2 uM bereikt, incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en daarna eenmaal wassen. Houd dit fluorescent geladen celsuspensie in het donker tot gebruik.
5. Voorbereiding voor Micropipetten en een Cell Chamber
- Voorbereiding Micropipetten
- Snijd lange capillaire glazen buisjes (tabel 1) met een glassnijder in korte stukjes van ongeveer 3 centimeter in lengte. Mount één stuk op de micropipet trekker (tabel 1), klik op de "Trek", maarton zodat het midden van het capillair wordt door de machine worden verwarmd en de capillaire zullen worden getrokken uit de beide einden twee capillairen van scherpe punten (raw micropipetten) maken.
Opmerking: Door het volgen van het product richtlijn, de gewenste morfologie van de ruwe pipet heeft 6-8 mm conus en 0,1-0,5 um tip. - Monteer een rauwe pipet op de pipet houder van de micropipet smederij (tabel 1). Verwarm de glazen bol op de smederij smelten. Steek de punt van de pipet in het ruwe glazen bol. Afkoelen van de glazen bol en trek de ruwe pipet om het te breken van buiten en laat de tip in de bol. Herhaal deze procedure tot de gewenste tip opening wordt verkregen.
Opmerking: Voorbeelden van een micropipet tip inwendige diameter: 2,0-2,4 urn voor RBC, ~ 1,5 urn voor een kraal, ~ 2-4 micrometer voor een T-cel en -7 urn voor een hybridoma cel.
- Snijd lange capillaire glazen buisjes (tabel 1) met een glassnijder in korte stukjes van ongeveer 3 centimeter in lengte. Mount één stuk op de micropipet trekker (tabel 1), klik op de "Trek", maarton zodat het midden van het capillair wordt door de machine worden verwarmd en de capillaire zullen worden getrokken uit de beide einden twee capillairen van scherpe punten (raw micropipetten) maken.
- Het bouwen van een Cell Chamber
Let op: de cel kamer is gebouwd op basis van een home-made kamerhouder, bestaande uit twee stukken metaal vierkantjes (Cu / Al) en een handgreep die ze met elkaar verbindt (figuur 1D). - Snij een 40 mm x 22 mm x 0,2 mm dekglaasje met een glazen mes in twee 40 mm x 11 mm x 0,2 mm gesneden (dekglaasje 1 en 2). Glue dekglaasje 1 van vet op de bovenzijde van de kamer houder in de manier waarop zij overbrugt de twee metalen pleinen en soortgelijke dekglaasje lijm 2 aan de onderzijde, waarbij een parallel dekglaasje celkamer (figuur 1D) vormt.
- Gebruik een pipet om 200 gl buffer experimentele injecteren tussen twee dekglaasjes. Zorg ervoor dat de buffer hecht aan beide dekglaasjes. Voorzichtig draaien en schud de kamer te laten de buffer raken beide uiteinden van de kamer.
- Injecteer minerale olie voorzichtig in beide zijwanden van de kamer aan weerszijden van de experimentele bufferzone waardoor de buffer uit de buitenlucht verzegeling. Injecteer suspensies probe korrels (bijvoorbeeld pMHC-beklede korrels), RBC's en doelen(Bijvoorbeeld T-cellen) in het bovenste, middelste en onderste delen van de bufferzone respectievelijk.
6. BFP experiment
Figuur 1: fBFP assemblage (A) Een overzicht beeld van de fBFP hardware-systeem.. (B) Een schematische tekening van het fBFP hardwaresysteem. (C) De dual-cam systeem "DC2" (oranje) waarop de high-speed camera (blauw) en een fluorescentie camera (wit) werden gemonteerd. (D) De microscoop podium dat een experiment kamer en drie micropipet manipulatie systemen past. (E en F) Microfoto van BFP setting in een experimentele kamer. (E) Micropipetten samenstel waarin de pipette probe (links), doel pipet (rechtsboven) en helper pipet (rechtsonderechts). (F) Probe kraal plaatsing. Een sonde kraal werd gemanipuleerd door een helper pipet en bevestigd aan een RBC apex om een kracht probe te vormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Schakel de microscoop (tabel 1) en de lichtbron. Plaats de kamer op de belangrijkste microscoop podium (figuur 1A, D).
- Installeer de drie micropipetten van BFP (figuur 1D. Links: probe, een RBC, exact pak: doel, een cel of korrel, rechtsonder pak: helper, een parel grijpen).
- Gebruik van een micro-injector (tabel 1) een micropipet experimentele buffer backfill. Haal de pipet houder (tabel 1) en houd het op een lagere plek op het water druipen van de tip mogelijk te maken. Steek snel de micropipet in de houder tip en zorg ervoor dat er geen luchtbel krijgt in de micropipettijdens het inbrengen. Draai de houder vast.
- Monteer elke pipet houder op de bijbehorende micro-manipulator. Duw de micropipet in de richting van de kamer, zodat hun tips voer de kamer buffer gebied. Pas de positie van de micropipet en vinden ze onder de microscoop gezichtsveld.
- Verplaats u in de kamer houder podium om de kolonies van drie elementen (de rode bloedcellen, de doelstellingen en de sonde kralen) vinden één-op-één. Pas de positie van de overeenkomstige micropipet door te draaien aan de knoppen van de manipulatoren te laten de tip van de micropipet aanpak ene cel / kraal. Zuig de cellen / korrel door de druk in de overeenkomstige micropipet. Alle drie micropipetten hun overeenkomstige elementen vastleggen.
- Verplaats u in de kamer houder podium om een open ruimte weg van de kolonies van de geïnjecteerde elementen, waar het experiment wordt uitgevoerd vinden. Schakel de microscoop visuele modus om de afbeelding te visualiseren op de computer programma op het computerscherm. Verplaats alle drie elementen op pipet tips in beeld veld van het programma.
- Lijn de probe kraal en RBC en nauwkeurig manoeuvreren probe kraal aan de apex van de RBC kort treffen de hiel op de RBC en zachtjes trekken. Pas de druk van de helper micropipet om voorzichtig te blazen de kraal weg, zodat het links zal worden gelijmd op de RBC apex (Figuur 1F). Ga weg van de helper micropipet en lijn het doel en sonde kraal (Figuur 2A).
Figuur 2:. BFP systeem en de testcyclus (A) Video-microfoto die een kracht sonde (links) en een target T-cellen (rechts) afgezogen door hun respectievelijke pipettes.The stationaire werking probe bestaat uit een gezwollen RBC en een bijgevoegd -ligand dragende bead. De receptor-dragendeT-cellen (doel) wordt gemonteerd op een piezotranslator tegengesteld gericht aan de probe. De ROI is aangegeven in groen. De rand tracker is aangegeven in een blauwe lijn. De inzet toont het ligand (pMHC, kralen kant) en receptor (TCR, T-cel kant) paar op de twee tegengestelde oppervlakken in het gebied gemarkeerd in oranje. (B) Het intensiteitprofiel van de kraal rand in (A). De ROI regio in de x-richting wordt uitgezet als x-as (in aantal pixels) en de lichtsterkte (in grijswaarde) gemiddeld door binning 30 pixels langs de y-richting. (C) de doorbuiging van de RBC en de positie van de hiel en het doel (T-cellen) in een testcyclus kracht clamp test. De verticale en horizontale stippellijnen geven de nulstaaf positie van de RBC apex en het tijdsverloop resp. De lijn rand tracker van de RBC vervorming wordt weergegeven in blauw in elk paneel. Dezelfde maar minder stappen adhesie frequentie aangenomenassay en thermische fluctuatie assay (waarbij de stap van "dissociëren" ontbreekt) (welke de stappen "clamp" en "scheiden" ontbreekt).
- Op het programma, in de visie gebied venster gebruik maken van de hulpmiddelen in het programma aan de respectievelijke stralen van de sonde micropipet (R p) te meten, de RBC (R 0), de cirkelvormige contactoppervlak tussen de RBC en sonde kraal (R c) , waarbij de schatting van de veerconstante van de RBC (k) kan de volgende vergelijking 17,30,
waarbij Δ p is het streven druk sonde pipetpunt.
Opmerking: Uit de wet van Hooke dat de bindende kracht, F, kan worden gekwantificeerd door het product van de lente constant en verplaatsing van de sonde kraal (d), dat wil zeggen, F = d (Figuur 2C). - Voer de gewenste RBC veerconstante in het programma (Zie Protocol rubriek 6.6. De veerconstante is doorgaans ingesteld op 0,25 of 0,3 pN / nm voor de kracht klem assay en hechting frequentie test en 0,1 pN / nm voor de thermische fluctuatie assay) , waarin een vereiste aspiratie druk zal terugkeren in de eenheid van de centimeter water. Stel de hoogte van de watertank die links naar pipet van de sonde tot de gewenste opzuigen druk is bereikt.
- Teken een horizontale lijn over de RBC-top, die een bocht zal opleveren in de aangrenzende venster waarin de helderheid (grijswaarde) van elke pixel langs deze lijn. Sleep de drempel lijn om ongeveer de helft van de diepte van de curve (figuur 2A, B).
Opmerking: De minimale punt van de helderheid curve onder de drempel regel geeft de positie van de hiel grens, dus slechts één lokaal minimum is toegestaan. Indien twee of meer lokale minima zijn op dit moment,geeft aan dat de afbeelding niet optimaal is (waarschijnlijk te wijten aan het beeld niet scherp, of een slechte afstemming tussen de sonde kraal en de RBC). - Selecteer de gewenste experiment modus: thermische fluctuatie assay, hechting frequentie test of kracht klem test. Instellen als gewenst (bv botsing kracht = 15 PN, het laden rate = 1000 pN / s, contacttijd = 1 sec, klemkracht = 20 PN (voor kracht clamp-test), etc) de parameters.
- Klik op "Start", waarin het programma naar het doel pipet verplaatsen en rijden het doel in en uit het contact met de sonde (zie representatieve resultaten sectie voor details) mogelijk maakt. De gegevensverzameling wordt parallel uitgevoerd, waarbij de positie van de sonde hiel in real time vastgelegd. Stop het programma door te klikken op de knop "Stop experiment", op dat moment een venster zal pop uit aan het redden van de verkregen gegevens mogelijk te maken.
7. Fluorescentie BFP (fBFP) experiment
- Om de fluore gebruikenscence functie van het BFP systeem zet de excitatielichtbron (Tabel 1) en de fluorescentie camera (Tabel 1), die worden bestuurd door een afzonderlijk programma (tabel 1). Op het programma selecteert de parameters voor fluorescentie beeldvorming, waaronder gain, belichting, excitatie kanalen (in dit geval, 340 nm en 380 nm licht), enz. Volg alle voorbereidingen in de BFP experiment protocol, met inbegrip van het afstemmen van de sonde en het doel, die zal zorgen voor visualisatie van de doelcel live-tl-image opgewonden door 340 nm of 380 nm excitatie licht.
- Gebruik het snijden gereedschap om ruwweg sectie het gebied waarbinnen de cel zal blijven gedurende de gehele opnameperiode.
Opmerking: Door de toepassing van de aanpak-contact-retractie cyclus zal de cel vooruit en achteruit herhaaldelijk, waardoor het doorgesneden gebied is veel groter dan de cel zelf. - Klik op "Record" om de 340 nm een toestaand 380 nm licht afwisselend prikkelen de intracellulaire fluorescentie kleurstof (fura2), en een paar overeenkomstige fluorescentiebeelden afwisselend ongeveer elke seconde geregistreerd. Klik simultaan "Start" programma om de BFP experiment voor analyse moleculaire interactie en de fluorescentie imaging experiment intracellulaire calcium signaaloverdracht bewaken beginnen. Het systeem toont een ruwe gegevensbestand van het receptor-ligand-binding (zie figuur 6A hieronder) en een reeks van fluorescerende beelden in TIFF formaat voor de calciumsignalen produceren.
8. Data Analyse
- BFP Data Analyse
- Data-analyse voor de hechting frequentie test
- Sequentieel inspecteren elke cyclus van 'kracht vs. tijd "signaal en eenvoudig opnemen die cycli bevatten een hechting evenement en welke niet, en samen te vatten tot een gemiddelde hechting frequentie opleveren.
- Verzamel de breuk kracht van elk hechting evenement, datis de piekwaarde van de lineair hellende kracht voordat bond breuk. Na het verzamelen van een voldoende hoeveelheid breuk krachten in een reeks van ramp tarieven, leiden de breuk krachtverdeling bij elke ramp tarief waaruit de kracht-afhankelijke off-rate van receptor-ligand dissociatie wordt afgeleid met behulp van dynamische kracht spectroscopie analyse 18,31.
- Data-analyse voor de thermische fluctuatie assay
- Opeenvolgend inspecteren het vastklemmen fase signaal van elke cyclus, die waarschijnlijk bevat meerdere bond associatie en dissociatie gebeurtenissen. Gebruik de klem fase thermische fluctuatie niveau (de gemiddelde standaardafwijking van een glijdende interval van 70 opeenvolgende tijdstippen van de kraal positie) in de "kracht vs. tijd" signaal als een leidraad voor de obligatie associatie en dissociatie gebeurtenissen te onderscheiden, omdat een band formatie komt overeen met een afname van de thermische fluctuatie.
- Wijs het interval vanaf het moment van bindingsdissociatie (wanneer de thermal fluctuatie hervat normaal niveau) om het moment van de volgende binding vorming als wachttijd, en wijzen de duur van de binding van deelneming aan dissociatie bankpost- levensduur, die beide gedurende dezelfde data controle. Bereken de gemiddelde wachttijd en de gemiddelde band leven, die respectievelijk weerspiegelen de wederzijdse van on-tarief en die van off-rate onder zero-force 16,30.
- Data-analyse voor kracht klem assay
- Record parameters van alle leven evenementen, waaronder de gemiddelde kracht en obligatiemarkten leven met het volgnummer, alsmede de starttijd en de eindtijd, waardoor men een levenslange cumulatieve curve te tekenen (bijvoorbeeld figuur 6C, gele curve).
- Verzamel een voldoende hoeveelheid van de levensduur van evenementen in het kader van een reeks van krachten. Groep hen in verschillende kracht bakken, die een gemiddelde levensduur in elke kracht bin zal produceren, en helemaal op een "gemiddelde levensduur vs. force "curve (figuur 4).
- Data-analyse voor de hechting frequentie test
- Calcium fluorescentie Imaging Data Analyse
- Stel de intensiteitsdrempel tot fluorescentiebeelden een duidelijke contour van de cel in zowel 340 nm en 380 nm kanalen zonder achtergrondruis (Figuur 5A, B). Raadpleeg vervolgens intracellulair Ca2 + signaal beeld voor beeld met een pseudo-kleuraanduidelement het intensiteitsniveau (figuur 6B), die verband houdt, gebaseerd op de intensiteit verhouding van 340 nm / 380 nm, om de "genormaliseerde Ca2 + intensiteit versus genereren . tijd "curve (figuur 6C). Gebruik de pseudo-kleur fluorescentie beelden naar een film die de fluorescentie niveau tweede toont door tweede te produceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het BFP techniek werd ontwikkeld door het laboratorium in Evans 1995 17. Deze picoforce gereedschap is uitgebreid gebruikt om interacties van eiwitten geïmmobiliseerd op oppervlakken meten, teneinde tweedimensionale kinetiek van adhesiemoleculen analyseren interactie met hun liganden 16,19,20, 30, moleculaire elasticiteit 21,29 meten en te bepalen eiwit conformatieveranderingen 21. Voor een fBFP, een extra set van de epi-fluorescentie-gerelateerde apparaten met de bijbehorende software-systeem (tabel 1) wordt toegevoegd (Figuur 1 A - C).
Het fBFP bestaat uit een hardwaresysteem (optische, mechanische en elektrische componenten) en een softwaresysteem (tabel 1 en figuur 1A, B). Een omgekeerde microscoop (figuur 1A, midden) met optische componenten waarmee heldere-veld en epi-fluorescentie microscopie maakt het hoofdgedeelte vanhet fBFP systeem, waarop het experiment podium en pipet manipulatoren zijn gemonteerd. Een fluorescentie lichtbronbesturingseenheid (figuur 1A, linksboven) wordt gebruikt om alternerende excitatie licht leveren. Een dual-cam systeem "DC2" splitst het licht in twee en stuurt ze naar een high-speed camera (blauw) en een fluorescentie camera (wit) (Figuur 1A, linksonder). De voormalige verzamelt het de sonde voor positiebepaling en de laatste verzamelt fluorescentie beelden uitgezonden van de doelcel op twee golflengten. Het experiment wordt bewaakt en gecontroleerd door twee computers die host-pc 1 (figuur 1A, rechtsboven, bijgesneden in het beeld te wijten aan de beperkte ruimte) is aangesloten op zowel de high-speed camera en de fluorescentie camera en is verantwoordelijk voor de uitvoering experiment en data acquisitie en host PC 2 is verbonden met de bewakingscamera en verantwoordelijk voor het presenteren van een volledige weergave van de BFP experiment (Figuur 1A, B).
Tijdens een experiment, de experimentator maakt gebruik van drie micropipetten te grijpen en te manipuleren respectievelijk cellen en microsferen (figuur 1E, F). Een typisch beeld van een BFP experiment bestaat uit een kracht probe, die is samengesteld door het bevestigen van een probe kraal op de top van een opgezogen RBC en een doelcel / bead (Figuur 2A). Een gebied van belang (ROI), waarin het randgebied van de kraal aan de RBC apex bevat, wordt gevolgd door een snelle-speed camera (2000 fps) aan de vervorming van de RBC in real-time te volgen. De bijgehouden verplaatsing van de kraal dan worden gebruikt om de externe kracht uitgeoefend op de berekening force probe (zie de aantekening in Protocol 6.6), gezien de veerconstante van de BFP (Figuur 2A, B).
Hechting frequentie test, thermische fluctuatie assay, en de kracht klem test zijn de drie meest gebruikte experimentele modes op een BFP systeem. Door adkiest één van deze drie modi, wordt een BFP experiment uit herhaalde testcycli die sequentieel uitgevoerd.
In hechting frequentie test, het doel benaderingen contacten en de probe kraal op een bepaalde contacttijd (bijvoorbeeld 1 seconde) en trekt direct terug naar de oorspronkelijke positie en begint de volgende cyclus. Een hechting event wordt gereflecteerd door een trekkracht signaal gedurende de retractiefase. Deze aanpak-contact-retractie cyclus wordt 50 maal herhaald ten minste 3 target-probe paren een gemiddelde SEM van hechting frequentie P a berekenen.
Thermische fluctuatie test wordt gebruikt voor de levensduur metingen onder nul-force. In elke cyclus, na het aanraken van de sonde korrel, wordt het doel teruggetrokken naar de nulstaaf positie vastgeklemd in contact met de hiel zonder dat druk of spanning van 20 seconden, en vervolgens terug naar de oorspronkelijke stand om de volgende cyclus te beginnen. Bond associatie / dissociatie onder zero-krachtgemanifesteerd als een plotselinge daling / stijging van de thermische schommelingen van de kraal 16,30.
Force klem test wordt gebruikt voor de levensduur metingen onder krachten. Een gewenste klemkracht (bijvoorbeeld 20 pN) wordt vóór de proef stellen. De doelstelling wordt telkens gedreven om contact probe bead gedurende een bepaalde contacttijd (bijvoorbeeld 1 seconde) om de vorming van een receptor / ligand binding toelaten (figuur 2C, panelen 2 en 3) en vervolgens trekken (figuur 2C, Paneel 4 ). Wanneer er geen binding wordt gevormd, blijkt uit geen trekkracht signaal op de RBC, of wanneer de binding scheurt voordat de ingestelde klemkracht wordt het doel terug naar de oorspronkelijke positie en begint de volgende cyclus. In de bindingsgebeurtenissen de retractiefase overleeft, wordt het doel gehouden op de klemkracht met een overeenkomstige verlenging van de RBC van d tot binding dissocieert (figuur 2C, panelen 5 en 6), en keert dan terug naar de oorspronkelijke ponerenion aan de volgende cyclus (Figuur 2C, Panel 7) starten. Levensduur wordt gedefinieerd als het tijdsinterval vanaf het moment wanneer de kracht bereikt het gewenste niveau om het moment van bindingsdissociatie 20.
Voor al deze drie BFP experimentele modes, dient de experimentator kan de aanpak-vormen een inbreuk-contact-retract- (clamp -) zie (dissociate-) return testcyclus (figuur 2C), die worden herhaald voor meerdere keren 16,20 , 21.
De gegevens van elke experimentele wijze van BFP kunnen worden geanalyseerd op verschillende manieren om de gewenste resultaten leiden. De gemiddelde levensduur curve is een representatief resultaat van de kracht klem assay (figuur 4). Het weerspiegelt de wederzijdse off-tarieven van de receptor-ligand dissociatie onder krachten. Thermische fluctuatie assay maakt de karakterisering van 2D on-rate en off-rate van een receptor-ligandpaar onder nulstaaf 16; terwijl hechting frequency assay maakt de 2D-on-rate, off-rate en affiniteit onder nul-force 13.
De add-in van de fluorescentie beeldvormingsfunctie voeren ter controle van de intracellulaire Ca2 + niveau van een enkele cel, die wordt gebruikt als het uitlezen van celsignalen in dit systeem. Om deze functie te gebruiken tijdens een fBFP experiment, moet men vooraf laden van de cellen met een Ca 2+ indicator. Bij fura2-AM waarbij de fluorescerende kleurstof, werden de fluorescentie beelden van dezelfde cel onder 340 nm en 380 nm excitatie kanalen afwisselend in het experiment en geïnspecteerd pair per pair in de analyse. Een intensiteit drempel werd toegewezen aan het fluorescerende elk kanaal op de achtergrond ruis te verwijderen en te erkennen de cel contour (figuur 5). Vergelijking van elk paar van de fluorescentiebeelden maakt de berekening van de intracellulaire Ca 2+ niveau. Duidelijke fluorescerende beelden van de cel onder zowel 340 nmen 380 nm excitatie kanalen nodig voor nauwkeurige meting van de Ca 2+ niveau (Figuur 5A, B), terwijl de slechte beelden met niet verwaarloosbare achtergrondruis zal leiden tot vertekende resultaten en moet worden vermeden (Figuur 5C).
Door de invoering van controleerbare mechanische stimulatie op de cel en opnemen cell Ca 2+ niveau tegelijk, de fBFP biedt een krachtige single-molecule tool om mechanisch-transductie studeren op een levende cel. Het is vermeldenswaard dat de hier beschreven platform is heel veelzijdig; in principe, kan men het ontwerp tal van manieren van aanbrengen van kracht op de cel om specifieke doeleinden passen en tegelijkertijd de controle diverse signalering gebeurtenissen van belang. De kracht-afhankelijke kinetische gegevens worden geanalyseerd in de context van het gekozen signaal uitlezing kenmerken van force gereguleerde receptor-ligand kinetiek, de geïnduceerde signalering, en de mate extraheren. In het voorbeeld van TCR signaling, een agonist-specifieke TCR-pMHC vangst bond werd voor het eerst ontdekt en vervolgens de relevantie ervan voor T-cell Ca 2+ flux werd onderzocht 27. De strategie was om de piekwaarde van Ca 2+ flux nemen het signaleringsbericht uitlezing om de beste voorspeller vragen over verschillende kinetische parameters, zoals het aantal verklevingen, de kracht amplitude van de binding, de gemiddelde levensduur, de langste levensduur en cumulatieve levensduur van de opeenvolgend gevormde bindingen. Weergegeven in figuur 6 is een voorbeeld van gelijktijdig opgenomen obligatie levensduur (wanneer een sluitkracht van 10 pN werd toegepast) van een T-cel en de accumulatie ervan en het overeenkomstige Ca2 + signaalverloop. In dit geval, vier levenslange gebeurtenissen voorafgaand aan de tijd toen Ca 2+ niveau begon te verheffen op 55 sec, de opslag een bedrag van 10 seconden bond leven. Dit niveau van de levensduur van accumulatie veroorzaakte een Ca 2+ signaal met een piek van genormaliseerde fura2 verhoudingvan 1,8 die zich op 65 sec. Een systematische wiskundige analyse van die gegevens verzameld van vele individuele cellen bleek dat de beste correlaat van Ca 2+ signalering sterkte levens gecumuleerd in de 1e minuut van herhaalde TCR-pMHC interacties (zie Referentie 27 voor technische details).
Figuur 3: Voorbeeldige time-force ruwe data rondingen van een no-adhesie gebeurtenis (A), een breuk kracht event (B) en een levensduur evenement (C). Verschillende fasen van de cyclus en de corresponderende kromme segmenten worden respectievelijk aangeduid in elk paneel. De kracht (y-as) is afgeleid van het volgen van de positie wisseling van de probe korrel, zoals weergegeven in figuur 2C. (A) Geen hechting: de druksterkte (negatief) kracht in het contact fase rendement to nul bij het terugtrekken. (B) een breuk-kracht event: Een treksterkte (positieve) kracht trekt via de receptor-ligand binding aan langwerpige RBC, die breekt tijdens het retractiefase. (C) A levengebeurtenis: de band blijft bestaan totdat de klemkracht is bereikt en daarna dissocieert. De duur van de levengebeurtenis aangegeven. De breuk-kracht event (B) en het begin van de levengebeurtenis (C) worden met een asterisk aangegeven.
Figuur 4:. "Gemiddelde levensduur versus kracht" curve van OT1 T-cel interactie met haar agonist OVA (groen) en antagonist G4 (blauw) De samengevoegde gegevens worden gegroepeerd in verschillende kracht bakken, en het gemiddelde ± SEM van obligaties levens is uitgezet tegen geweld.
Figuur 5:. Representatieve Ca 2+ beelden geëxciteerd bij twee golflengten (A, B) Correct beeldherkenning van een T-cel (in rood aangegeven) bij 340 nm (A) en 380 nm (B) kanalen op basis point-to- wijzen screenen met behulp van een goed toegewezen intensiteit drempel. (C) onmogelijkheid om de fluorescentie afbeelding van een T-cel (aangeduid in het rood) opname in de 340 nm excitatie kanaal, als gevolg van slechte fura2 laden.
Figuur 6: Superpositie van de "intracellulaire Ca2 + (relatief fura2 ratio) versus tijd" en de "cumulatieve versus tijd" krommen van een OT1 T-cel genererend door herhaaldelijk aanraken van de T-cel met een OVA-beklede bead dan 300 sec. (A) A krachtcurve toont een reeks van niet-hechting, breuk-kracht, en speciale gebeurtenissen die door meerdere keren in de tijd. (B) Epi-fluorescentie pseudo kleurenbeelden van intracellulair Ca2 + signalen in de T-cellen op verschillende tijdspunten. De genormaliseerde Ca2 + niveau wordt aangegeven door de pseudo-kleurenschaal rechts. (C) Superpositie van de Ca2 + signaalverloop (rood) en de cumulatieve kromme (geel) op hetzelfde tijdsverloop. De Ca2 + curve uitgezet gebaseerd op de Ca2 + imaging. Een Ca 2+ flux wordt aangeduid door een scherpe verhoging van de genormaliseerde fura2 ratio. De tijd dat Ca2 + de piek bereikt wordt aangegeven met een stippellijn. De aanvangstijd van elk leven evenement wordt aangegeven op de cumulatieve curve (solide driehoek).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een succesvolle fBFP experiment brengt een paar kritische overwegingen. Ten eerste, voor de berekening van krachten betrouwbaar zijn, de micropipet, de RBC en de probe hiel moet worden afgestemd coaxiaal zo dicht mogelijk. De projectie van de RBC in de pipet moet ongeveer één probe pipet diameter zodat de wrijving tussen de RBC en de pipet verwaarloosbaar. Voor een typische humane RBC, de optimale pipet diameter 2,0-2,4 urn, waarbij een beste passing van vergelijking 1 17,30 oplevert. Ten tweede, om te waarborgen metingen geldende clamp test en thermische fluctuatie assay zijn meestal voor enkele bindingen, een adhesie frequentie van minder dan 20% moet worden gehandhaafd 10,13,30. Hier moet aspecifieke adhesies zorgvuldig geregeld (meestal <5% met voldoende blokkeren met BSA). Bovendien worden de gegevens verzameld pas vanaf hechting events met één force-drop - kenmerk van een enkel-molecule gedrag (analoog aan een eenstaps verdwijnenvan fluorescentie in single-molecule FRET). Ten derde, het laden concentratie van de fluorescentie kleurstof worden geoptimaliseerd van geval tot geval om de beste beeldkwaliteit te bereiken. Ten vierde, de toxiciteit van de kleurstof belastingstoestanden T-cellen of andere cellen van belang moet zorgvuldig vóór elk experiment worden onderzocht. Bijvoorbeeld, de bindingsaffiniteit van receptor-ligand interacties upon loading dye moeten worden gemeten en vergeleken met die zonder kleurstof laden. Als de bindingsaffiniteit dramatisch veranderen vanwege ladingskleurstof, een andere kleurstof of een belastingstoestanden concentratie moet worden beschouwd. Ten vijfde, zijn terminaal biotine-gemerkte eiwitten liever handig, specifieke en sterke koppeling die thuishoren oriëntatie van het eiwit behoudt mogelijk te maken.
De kracht van de fBFP is dat voert een enkele binding assay op een enkele cel. Ondanks de lage doorzet, single-band analyse onthult vaak belangrijke functies die onbereikbaar met conventionele ensemble me zijnthods. Bijvoorbeeld door onderzoek van de levensduur van de distributie bij elke kracht bin, kan men correleren verschillende bindende eigenschappen met eiwit conformationele staten, het verstrekken van inzicht over hoe kracht regelt eiwit conformatie verandert 20,32. De BFP kan ook worden gebruikt om moleculaire stijfheid van de kracht en de piëzo-vertaler verplaatsingsdata van de retractiefase, die kunnen worden gebruikt om eiwit conformationele dynamica 20,21 onderzoeken te meten.
Vele werkwijzen zijn ontwikkeld voor receptor-gemedieerde celadhesie en signalerende bestuderen. Receptor-ligand binding kinetiek wordt algemeen gemeten met recombinant eiwitten in volledige afzondering van de cellulaire omgeving. Een dergelijke praktijk is potentieel problematisch. Zo werd recent aangetoond dat in situ kinetiek gemeten levende cellen sterk verschilt van die gemeten met de overeenkomstige recombinante eiwitten 14, waaruit nieuwe inzichten van de receptor & #8217; s cellulaire functies. Niet alleen is het fBFP staat kwantificeren receptor-ligand kinetiek in situ, maar nog belangrijker, kan ook gelijktijdig registreren de bindende geïnduceerde cell signaling. Zoals aangetoond voor de TCR 27, de rijke informatie van de bindende eigenschappen en cel signalering verkregen met behulp van fBFP biedt een ongekende kans voor het analyseren van hun betrekkingen en het begrip van de moleculaire mechanismen van mechanisch-transductie. Het is waarschijnlijk dat fBFP meer toepassingen in andere belangrijke receptor-ligand-systemen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
| Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
| Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
| Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
| Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
| Capillary Tube 0.7-1.0 mm x 30 inches | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
| Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
| Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
| 1 ml syringe | BD | 309602 | chamber assembly |
| Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
| Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
| Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
| Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
| Camera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
| Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
| Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
| Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
| 3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
| LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
| 3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
| Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
| Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
| Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
| Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
| Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
| Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | 8.4 g/L sodium carbonate (Na2CO3), 10.6 g/L sodium bicarbonate (NaHCO3) | ||
| Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | 27.6 g/L NaPhosphate monobasic (NaH2PO4 • H2O), 28.4 g/L Anhy. NaPhosphate dibasic (Na2HPO4) | ||
| N2-5% buffer (pH 7.2) | 20.77 g/L potassium chloride (KCl), 2.38 g/L sodium chloride (NaCl), 0.13 g/L potassium phosphate monobasic (KH2PO4), 0.71 g/L anhy. sodium phosphate dibasic (Na2HPO4), 9.70 g/L sucrose |
References
- Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. Mechanical control of stem cell differentiation. Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).
- Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters. Frontiers in immunology. 3, 86 (2012).
- Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network. Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).
- Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. T cell antigen recognition at the cell membrane. Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).
- Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions. Physical biology. 9, 045005 (2012).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
- Marshall, B. T., et al. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423, 190-193 (2003).
- Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).
- Yago, T., et al. Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear. The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).
- Yago, T., et al. Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF. The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).
- Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 (2010).
- Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).
- Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib. Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).
- Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells. The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).
- Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).
- Nesbitt, W. S., et al. Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow. The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).
- Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor. Blood. 100, 2793-2800 (2002).
- Lefort, C. T., Ley, K. Neutrophil arrest by LFA-1 activation. Frontiers in immunology. 3, 157 (2012).
- Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling. Cell. 157, 357-368 (2014).
- Lou, J., et al. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature communications. 5, 4886 (2014).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).
- Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. Force history dependence of receptor-ligand dissociation. Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).
- Xiang, X., et al. Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin. PloS one. 6, e27946 (2011).
