Abstract
Membranrezeptor-Liganden-Wechselwirkungen vermitteln viele zelluläre Funktionen. Bindungskinetik und nachgeschalteten Signal durch diese molekularen Wechselwirkungen ausgelöst werden wahrscheinlich durch die mechanische Umgebung, in der Bindung und Signalisierung erfolgen betroffen. Eine neuere Studie hat gezeigt, dass eine mechanische Kraft kann die Antigen-Erkennung durch regulieren und Auslösen der T-Zellrezeptor (TCR). Dies wurde durch eine neue Technologie, die wir entwickelt und bezeichnet Fluoreszenz Biomembran Kraftsonde (fBFP), die Einzelmolekülkraftspektroskopie mit Fluoreszenzmikroskopie kombiniert möglich. Mit seinem ultra-soft menschlichen roten Blutkörperchen als sensitive Kraftsensor, ein High-Speed-Kamera und Echtzeit-Bildgebung Tracking-Techniken ist von ~ 1 pN (10 -12 N), ~ 3 nm die fBFP und ~ 0,5 ms in Kraft, räumlicher und zeitlicher Auflösung. Mit der fBFP, kann man genau einzigen Rezeptor-Ligand-Bindungskinetik unter Kraftregelung und gleichzeitig image Bindung ausgelöste intrazelluläre cal messencium Signalisierung auf einer einzelnen lebenden Zellen. Diese neue Technologie kann verwendet werden, um andere Membranrezeptor-Liganden-Wechselwirkung und Signalisierung in anderen Zellen unter mechanischer Regulierung untersuchen.
Introduction
Zell-zu-Zell und Zell-extrazellulären Matrix (ECM) Haftung wird durch die Bindung zwischen Zelloberflächenrezeptoren, ECM-Proteine und / oder Lipide 1 vermittelt. Bindung erlaubt den Zellen funktionalen Strukturen 1 zu bilden, ebenso wie zu erkennen, zu kommunizieren und zu reagieren, um die Umwelt 1-3. Anders als lösliche Proteine (zB Cytokine und Wachstumsfaktoren), die binden aus einem dreidimensionalen (3D) Fluidphase auf die Zelloberflächenrezeptoren Zelladhäsionsrezeptoren bilden Bindungen mit ihren Liganden über einen schmalen Spalt junctional zu zwei einander gegenüberliegenden Oberflächen, die Molekular beschränken brücken Diffusion in einem zweidimensionalen (2D) Schnittstelle 4-7. Im Gegensatz zu 3D-Kinetik, die üblicherweise durch herkömmliche Bindungstests (zB Oberflächenplasmonresonanz oder SPR) gemessen werden, 2D-Kinetik mit spezialisierten Techniken wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) 8-10 quantifiziert werden, Durchflusskammer 11,12, Mikro 13,14, optischePinzette 15 und Biomembran Kraftsonde (BFP) 16-21.
Mehr als lediglich die Bereitstellung physikalische Verknüpfung für die zelluläre Kohäsion, sind Adhäsionsmoleküle, eine Hauptkomponente des Signal-Maschine, damit die Zelle mit ihrer Umgebung zu kommunizieren. Hat eine zunehmende Interesse für das Verständnis, wie Ligand Eingriff Adhäsionsmoleküle initiiert intrazellulären Signalisierung und wie die anfängliche Signal innerhalb der Zelle transduziert. Intuitiv Eigenschaften des Rezeptor-Ligand-Bindung kann die Signale induziert auswirken. Es ist jedoch schwierig, mechanistische Beziehungen zwischen der extrazellulären Interaktion und intrazelluläre Signalereignisse sezieren Verwendung traditioneller Ensemble von biochemischen Assays wegen ihrer vielen Einschränkungen, beispielsweise eine schlechte zeitliche Auflösung und das völlige Fehlen von räumlicher Auflösung. Bestehende Verfahren, die sowohl biophysikalischer (2D-Rezeptor-Liganden-Bindung Kinetik) zu ermöglichen und biochemische (Signalisierung) Beobachtungen über Live-Zellen umfassen Substrate von abstimmbaren Steifigkeit 22, Elastomer Säule Arrays 23 und Strömungsraum / mikrofluidischen Vorrichtungen mit Fluoreszenzfähigkeit 24-26 integriert. Jedoch haben Auslesungen Signalisierung und Rezeptor-Ligandenbindungs separat (häufig durch verschiedene Verfahren) erhalten werden, was es erschwert, zeitlichen und räumlichen Beziehungen der Bindungseigenschaften mit Signalisierungsereignisse zu sezieren.
Konventionelle BFP ist eine ultrasensitive Kraftspektroskopie mit hoher Raum-Zeit-Auflösung 17. Es verwendet eine flexible roten Blutkörperchen (RBC) als Kraftsensor, eine Messung der Einzelmolekül 2D Kinetik, mechanische Eigenschaften und Konformationsänderungen 14,16,19-21,27-29. Ein Fluoreszenz-Bildgebung basiert BFP (fBFP) korreliert die Rezeptor-Ligand-Bindungskinetik mit der Bindung ausgelöste Zellsignalisierung bei Einzelmolekülskala. Mit diesem Setup in situ Zellsignalisierung Tätigkeiten im Zusammenhang mit der Oberfläche mechanical Stimulation wurde in T-Zellen, 27 beobachtet. Die fBFP ist vielseitig und kann für die Untersuchung der Zellhaftung und Signalisierung durch andere Moleküle in anderen Zellen vermittelt werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dieses Protokoll folgt den Richtlinien und wurde von der menschlichen Forschung Ethik-Kommission des Georgia Institute of Technology genehmigt.
1. Menschen RBCs Isolation, Biotinylierung und Osmolarität Adjustment
Hinweis: Schritt 1.1 sollte von einem ausgebildeten Arzt, wie eine Krankenschwester durchgeführt werden, mit einem Institutional Review Board genehmigten Protokoll.
- Erhalten 8-10 ul (ein Tropfen) Blut von Finger stechen und fügen Sie 1 ml der Carbonat / Bicarbonat-Puffer (Tabelle 1 und 2). Vorsichtig vortexen oder einer Pipette die Mischung und Zentrifuge für 1 min bei 900 x g. Überstand verwerfen und waschen Sie einmal.
- In einem kleinen Becherglas wiegen 3,5-4 mg Biotin-NHS-PEG3500-Linker (Tabelle 1). Löst ihn in Carbonat / Bicarbonat-Puffer, um eine Endkonzentration von 3 mg / ml zu ergeben.
- Mischungs 171 ul / Bicarbonat-Puffer, 10 ul RBC Packung und 1049 ulBiotin-PEG3500-NHS Linker Lösung, Inkubation bei Raumtemperatur 30 min. Waschen Sie die RBC einmal mit Carbonat / Bicarbonat-Puffer und dann zweimal mit N2-5% Puffer (Tabelle 1 und 2).
- In der Zwischenzeit setzen Sie die Linker-Flasche mit gelockerten Kappe in einem Glas Vakuumexsikkator mit Trockenmittel in den Boden und Vakuum für 5 Minuten gefüllt, und füllen Sie den Exsikkator mit Argon. Ziehen Sie den Deckel und nehmen Sie die Flasche aus. Verschließen Sie die Flasche mit Kunststoffparaffinfilm (Tabelle 1), legen Sie sie in einen Behälter mit Trockenmittel auf der Unterseite und lagern in -20 ° C gefüllt.
Hinweis: die Schritte, die die Verwendung von Biotin-PEG3500-NHS Linker beinhalten, einschließlich 1,2-1,4 (außer der Inkubation und Waschen in 1,3), müssen so schnell wie möglich durchgeführt werden. - Verdünnter Nystatin in N2-5% Puffer bis zu einer Endkonzentration von 40 ug / ml zu ergeben. Mischen Sie 5 ul biotinyliertes RBC mit 71,4 ul Nystatin (Tabelle 1) Lösung, Inkubation für 1 h bei 0 &# 176; C. Zweimal waschen mit N2-5% Puffer und Speicher mit N2-5% Puffer + 0,5% BSA (Tabelle 1) im Kühlschrank (4 ° C).
2. Glasperlen Silanisierung
- Reinigung der Partikeloberfläche
- Wiegen 50 mg Glaskügelchen Pulver und resuspendieren sie in 500 & mgr; l DI-Wasser.
- Mischungs 0,5 ml 30% H 2 O 2 (Tabelle 1) mit 9,5 ml DI-Wasser in einem 50 ml Becherglas, dann 2 ml konzentrierte NH 4 OH (Tabelle 1) und bringt diese Lösung in einem Kessel auf eine heiße Platte .
- In der Glasperlen in die kochende Lösung und weiterhin für weitere 5 Minuten kochen lassen. Vorsichtig schwenken die Lösung alle min.
- Nach dem Kochen zu übertragen ~ 5 ml dieser heißen Perlensuspension in ein 15 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und mit RT DI-Wasser. Zentrifuge bei 3.500 xg für 5 min, zu entfernen und den Überstand verwerfen.
- Übertragen Sie weitere 5 ml heißem Beadsuspension und zu den gewaschenen Perlen, Auffüllen mit DI-Wasser, gut mischen und zentrifugieren erneut. Diesen Vorgang wiederholen, bis etwa 50 ml DI-Wasser verwendet wird, die insgesamt 4 bis 5 mal Waschen wird.
- Übertragen Sie die Bead-Suspension in eine 1 ml-Fläschchen. Wiederholen Waschen der Perlen mit Methanol (Tabelle 1) durch Zentrifugation bei 17.000 xg für 5 Minuten 3 Mal und schließlich resuspendieren der Kügelchen in 1 ml 100% igem Methanol.
- Wulstoberfläche Thiolierung
- In ein 50 ml Zentrifugenglas 45,6 ml Methanol, 0,4 ml Essigsäure (Tabelle 1), 1,85 ml entionisiertes Wasser, 1,15 ml 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan (MPTMS) (Tabelle 1) und 1 ml Kügelchen enthaltenden Suspension in 2.1 hergestellten dann bei RT inkubiert 3 Stunden.
- Nach der Reaktion entfernen Sie alle Reaktionspartner durch einmaliges Waschen mit frischem Methanol und resuspendieren die Perlen in 500 ul Methanol. Teilen Sie gleichmäßig Diese konzentrierte Glasperlensuspension in einen Satz von 20 trockene und saubere Glasgefäße mitSchraubverschlüsse. Abzudampfen das Methanol unter Verwendung einer Strahl aus trockenem Argon und langsam rotieren die Fläschchen, um so eine dünne Schicht von trockenen Perlen auf den Seiten jedes Fläschchen zu machen.
- Legen Sie die Durchstechflaschen mit Perlen in einem vorgewärmten Trockenschrank bei 120 ° C für 5 Minuten und dann herausnehmen und schnell setzen Sie die Kappe (n) lose auf. Legen Sie die Fläschchen in einem Glas Vakuum-Exsikkator mit Trockenmittel in den Boden gefüllt und Vakuum Exsikkator mit einer Vakuumpumpe, bis gekühlt.
- Spülen Sie die gesaugt Exsikkator mit trockenem Argon in den Exsikkator zu normalem Atmosphärendruck zu bringen. Entfernen Sie den Deckel und Exsikkator schnell nachziehen die Kappe (n) auf dem Fläschchen. Verschließen Sie die Fläschchen mit Kunststoffparaffinfilm und speichern Sie sie bei Raumtemperatur in einem trockenen dunklen Aufbewahrungsbox.
- Nach den sofortigen Einsatz, nehmen Sie eine Flasche mit Trockenperlen und einmal mit Phosphatpuffer (Tabellen 1 und 2), re-suspendieren in 50 ul Phosphatpuffer und bei 4 ° C zu waschen. Diese konzentrierte Wulst Vorbereitung wird Bezug genommen werdenals "MPTMS Perlen" in den folgenden Schritten.
Hinweis: Bei sachgerechter Lagerung könnte MPTMS Perlen Funktions für bis zu drei Monate bleiben.
3. Bead Funktionalisierung
- Kovalent Beschichtung Proteine auf Beads
- Nehmen Sie ein bestimmtes Volumen (beispielsweise 2,5 & mgr; l) des Proteins Lager und mit gleichen Volumen von Carbonat / Bicarbonat-Puffer, um Lösung 1 machen mischen.
Hinweis: Das Volumen hängt von der Ausgangskonzentration und der gewünschten endgültigen Ort Dichte des Proteins auf der Oberfläche Kügelchen. - In einem kleinen Becherglas wiegen 2-3 mg MAL-PEG3500-NHS-Linker (Tabelle 1) zu und löse es mit Carbonat / Bicarbonat-Puffer, um eine endgültige Konzentration von 0,231 mg / ml zu erreichen.
- Mischungslösung 1 mit einem gleichen Volumen des in 3.1.2 hergestellten Lösung Linker. Inkubieren der Mischung bei RT für 30 min zur Lösung 2 zu machen.
- In der Zwischenzeit setzen Sie die Linker-Flasche mit gelockerten Kappe in einem Glas Vakuumexsikkator filled mit Trockenmittel in den Boden und Vakuum für 5 Minuten, und füllen Sie den Exsikkator mit Argon. Ziehen Sie den Deckel und nehmen Sie die Flasche aus. Verschließen Sie die Flasche mit Kunststoffparaffinfilm, legen Sie sie in einen Behälter mit Trockenmittel auf der Unterseite und lagern in -20 ° C gefüllt.
Hinweis: die Schritte, die die Verwendung von MAL-PEG3500-NHS Linker beinhalten, einschließlich 3.1.2-3.1.4 (außer für die Inkubation in 3.1.3), müssen so schnell wie möglich durchgeführt werden. - Mischen Sie 5 ul MPTMS Perlen mit Lösung 2 und fügen Phosphatpuffer (Tabelle 1), um ein Endvolumen von 250 ul zu machen.
- Die Perlen Inkubieren über Nacht bei RT, wäscht 3 mal mit Phosphatpuffer und resuspendieren in 100 ul Phosphatpuffer und bei 4 ° C.
- Nehmen Sie ein bestimmtes Volumen (beispielsweise 2,5 & mgr; l) des Proteins Lager und mit gleichen Volumen von Carbonat / Bicarbonat-Puffer, um Lösung 1 machen mischen.
- Vorbereiten Protein / Streptavidin (SA) Beschichtete Beads
- Folgen Protokoll 3.1.1-3.1.4.
- Mischen 5 ul MPTMS Perlen mit Lösung 2 und 5 & mgr; l 4 mg / ml Streptavidin-maleimid (SA-MAL) (Tabelle 1) Lösung und fügen Sie anschließend Phosphatpuffer, um ein Endvolumen von 250 ul zu machen.
- Die Perlen Inkubieren über Nacht bei RT, wäscht 3 mal mit Phosphatpuffer und schließlich resuspendieren in 100 ul Phosphatpuffer und bei 4 ° C.
- Beschichtung Streptavidin auf Glasperlen
- Mischen Sie 5 ul MPTMS Perlen mit 5 ul von 4 mg / ml SA-Lösung und fügen Sie 140 ul Phosphatpuffer.
- Die Perlen Inkubieren über Nacht bei RT, wäscht 3 mal mit Phosphatpuffer und resuspendieren in 50 ul Phosphatpuffer und bei 4 ° C.
- Beschichtung der SA Coated Beads mit einem biotinylierten Protein
- Mischen 5 ul SA-beschichteten Kügelchen mit dem Protein (Volumen je nach der gewünschten Beschichtungsdicke) und fügen Phosphat-Puffer, um das Endvolumen auf 100 ul zu sein.
- Inkubieren der Mischung über Nacht bei 4 ° C oder 3 h bei RT, wäscht 3 mal mit Phosphatpuffer und resuspendieren in 50 ul phosphate puffern und bei 4 ° C.
4. Zellpräparation
Hinweis: Um die Zellen zu reinigen, folgen Standardzelle Reinigungsprotokolle entsprechend der Art der Zellen, in Verwendung, beispielsweise T-Zellen, 27 oder bestimmte Zelllinien 21,29.
- Für fBFP Experimenten sobald die Zellsuspension hergestellt wird, hinzuzufügen Fura2-AM (Tabelle 1), gelöst in DMSO in die Zellsuspension zu einer Endkonzentration von 2 & mgr; M zu erreichen, Inkubation für 30 min bei RT und dann noch einmal zu waschen. Bewahren Sie diese fluoreszierend geladen Zellsuspension in dunklen bis zur Verwendung.
5. Vorbereitung für Mikropipetten und eine Zellkammer
- Vorbereiten Mikropipetten
- Geschnitten lange Kapillare Glasrohre (Tabelle 1) mit einem Glasschneider in kurze Stücke von etwa 3 cm in der Länge. Berg ein Stück auf die Mikropipette Abzieher (Tabelle 1), klicken Sie auf "Pull" aberTonne, so dass die Mitte der Kapillare wird von der Maschine aufgeheizt werden und die Kapillare wird an den beiden Enden gezogen, um zwei Kapillaren mit scharfen Spitzen (raw Mikropipetten) zu machen.
Hinweis: Indem man dem Produktrichtlinie, die gewünschte Morphologie des Ausgangs Pipette 6-8 mm Konus und 0,1-0,5 & mgr; m Spitze. - Montieren Sie eine rohe Pipette auf den Pipettenhalter des Mikroschmiede (Tabelle 1). Wärme, um die Glaskugel auf die Schmiede zu schmelzen. Legen Sie die Spitze des rohen Pipette in der Glaskugel. Abkühlung der Glaskugel und ziehen Sie die raw-Pipette, um es von außen zu brechen und hinterlassen ihre Spitze in der Kugel. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der gewünschte Spitzenöffnung erhalten wird.
Anmerkung: Beispiele einer Mikropipettenspitze Innendurchmesser: 2,0-2,4 & mgr; m für eine RBC, ~ 1,5 & mgr; m für einen Wulst ~ 2-4 & mgr; m für eine T-Zelle und -7 um eine Hybridomzelle.
- Geschnitten lange Kapillare Glasrohre (Tabelle 1) mit einem Glasschneider in kurze Stücke von etwa 3 cm in der Länge. Berg ein Stück auf die Mikropipette Abzieher (Tabelle 1), klicken Sie auf "Pull" aberTonne, so dass die Mitte der Kapillare wird von der Maschine aufgeheizt werden und die Kapillare wird an den beiden Enden gezogen, um zwei Kapillaren mit scharfen Spitzen (raw Mikropipetten) zu machen.
- Der Aufbau einer Zellkammer
Hinweis: Der Zellraum wird auf der Basis eines Heim-mad gebaute Kammerhalterung, die aus zwei Metallstücken Quadrate (Kupfer / Aluminium) und einem Griff, der sie miteinander verbindet (Figur 1D) besteht. - Schneiden eine 40 mm x 22 mm x 0,2 mm Deckglas mit einem Glasschneider in zwei 40 mm x 11 mm x 0,2 mm große Stücke (Deckglas 1 und 2). Kleber Deck 1 durch Fett auf die Oberseite des Kammerhalterung in der Weise, dass sie die beiden Metallquadraten überbrückt und in ähnlicher Kleber Deckglas 2 an der Unterseite, die eine Parallel-Deckzellraum (1D) bildet.
- Verwende eine Pipette, um 200 ul Versuchspuffer zwischen den beiden Deckplättchen injizieren. Sicherstellen, dass der Puffer wird an beiden Deckgläsern. Vorsichtig drehen und schütteln Sie die Kammer, damit der Puffer berühren beide Enden der Kammer.
- Mineralöl sorgfältig zu injizieren in beide Seiten der Kammer flankieren den experimentellen Pufferzone, wodurch die Puffer von der Open-Air-Abdichtung. Injizieren Suspensionen Sondenkügelchen (zB pMHC-beschichteten Perlen), RBCs und Zielvorgaben(Zum Beispiel T-Zellen) in den oberen, mittleren und unteren Bereich der Pufferzone auf.
6. BFP Experiment
Abbildung 1: fBFP Baugruppe (A) Eine Übersicht Bild des fBFP Hardware-System.. (B) eine schematische Zeichnung des fBFP Hardwaresystem. (C) Das Doppelnockensystem "DC2" (orange), auf die die Hochgeschwindigkeitskamera (blau) und ein Fluoreszenz-Kamera (weiß) montiert wurden. (D) Der Mikroskoptisch, der einen Experimentierraum und drei Mikromanipulationssysteme anpasst. (E und F) Mikroskopische Aufnahmen von BFP-Einstellung in einer Versuchskammer. (E) Mikropipetten Anordnung, die die Sonde Pipette (links), Zielpipette (oben rechts) und Helfer-Pipette (untere rechts). (F) Probe Perlenplatzierung. Eine Sonde Raupe wurde von einem Helfer Pipette manipuliert und zu einem RBC Spitze, um eine Kraft zu bilden Sonde angebracht ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Einschalten des Mikroskops (Tabelle 1) und der Lichtquelle. Setzen Sie die Kammer auf die Hauptmikroskoptisch (1A, D).
- Installieren Sie alle drei Mikropipetten von BFP (1D. Links: Sonde, um eine RBC, richtig zu greifen: Ziel, um eine Zelle oder ein Kügelchen, unten rechts greifen: Helfer, um eine Perle zu greifen).
- Verwenden Sie ein Mikro-Injektor (Tabelle 1) zu einer Mikropipette mit experimentellen Puffer verfüllen. Nehmen Sie den Pipettenhalter (Tabelle 1) und halten Sie sie zu einem niedrigeren Ort, um Wasser tropft von der Spitze zu ermöglichen. Legen Sie schnell die Mikropipette in die Halterung Spitze und sicherstellen, dass keine Luftblase wird in die Mikropipettewährend des Einsetzens. Ziehen Sie die Halteschraube.
- Hängen Sie jede Pipettenhalter auf dem entsprechenden Mikromanipulator. Schieben Sie die Mikropipette zu der Kammer, so daß ihre Spitzen in die Kammer Pufferbereich. Stellen Sie die Position der Mikropipette und finden sie unter dem Mikroskop Feld.
- Bewegen Sie sich die Kammer Halter Bühne, um die Kolonien aus drei Elementen (die Erythrozyten, die Ziele und die Sonde Perlen) finden one-by-one. Stellen Sie die Position des entsprechenden Mikropipette, indem Sie die Knöpfe der Manipulatoren, um die Spitze der Mikropipette Ansatz einer Zellen / Perlen lassen. Absaugen Zellen / Perlen durch Einstellen des Drucks innerhalb des entsprechenden Mikropipette. Alle drei Mikropipetten werden ihre entsprechenden Elemente zu erfassen.
- Bewegen Sie sich die Kammer Halter Bühne, um einen offenen Raum von den Kolonien der eingespritzte Elemente, bei denen das Experiment durchgeführt werden, zu finden. Schalten Sie das Mikroskop visuellen Modus, um das Bild auf dem Layout-Datei visualisierenuter-Programm auf dem Computerbildschirm. Verschieben Sie alle drei Elemente auf Pipettenspitzen in Sichtfeld des Programms.
- Ausrichten der Sonde Wulst und RBC und vorsichtig manövrieren die Sonde Wulst zum Scheitelpunkt der RBC kurz auftreffen den Wulst auf den RBC und sanft zurückzuziehen. Stellen Sie den Druck der Hilfsmikropipette vorsichtig blasen den Wulst entfernt, so dass es auf die RBC Scheitel (1F) links geklebt werden. Entfernen Sie den Helfer Mikropipette und richten Sie das Ziel und Sonde Wulst (2A).
Abb. 2: BFP System und seine Testzyklus (A) Video-Aufnahme zeigt eine Kraft-Sonde (links) und ein Ziel-T-Zellen (rechts) durch ihre jeweiligen pipettes.The stationären Kraft-Sonde abgesaugt besteht aus einem geschwollenen RBC und ein angeschlossenes Liganden-tragenden Kügelchen. Die Rezeptor-tragendenT-Zelle (Ziel) mit einem Piezotranslator an der Sonde gegenüberliegende ausgerichtet ist. Die ROI wird grün angezeigt. Der Rand-Tracker ist in einem blauen Linie dargestellt. Das Insert zeigt die Ligand (pMHC, Wulstseite) und Rezeptor (TCR, T-Zellen-Seite) Paar an den beiden gegenüberliegenden Oberflächen in dem in orange markierten Bereich. (B) Das Intensitätsprofil der Wulstrand in (A). Die ROI-Bereich in der x-Richtung wird als x-Achse (in Pixelzahl) und der Lichtintensität (in Grauwert) von Binning 30 Pixel entlang der y-Richtung gemittelt aufgetragen. (C) Die Auslenkung der RBC und die Position des Wulstes und dem Target (T-Zelle) in einem Testzyklus der Kraftspann Assay. Die vertikalen und horizontalen gestrichelten Linien zeigen den Nullkraft-Position des RBC Apex und dem zeitlichen Verlauf auf. Die Linie Rand tracker des RBC Verformung wird in blau in jeder Tafel gezeigt. Die gleichen Schritte werden jedoch weniger Haftung Frequenz angenommenAssay und Temperaturschwankungen Assays (das den Schritt der "dissoziieren" fehlt) (welches die Schritte "clamp" und "dissoziieren" fehlt).
- Auf dem Programm, in dem Sichtfeld Fenster mit den Werkzeugen im Programm, um die jeweiligen Radien der Sonde Mikropipette (R p) zu messen, die RBC (R 0), die kreisförmige Kontaktfläche zwischen der RBC und Sonde Wulst (R c) , das die Abschätzung der Federkonstante der RBC (k) durch die folgende Gleichung 17,30 ermöglicht,
wo Δ p der Druck, bei Aspiration Sonde Pipettenspitze.
Hinweis: Aus dem Hookeschen Gesetz, dass die Bindungskraft, F, kann durch das Produkt der Federkonstante und Verschiebung der Sonde Wulst (d), dh F = d quantifiziert werden (Abbildung 2C). - Geben Sie die gewünschte RBC Federkonstante in das Programm (Bitte zu Protokoll Abschnitt 6.6 verwiesen. Die Federkonstante wird in der Regel bei 0,25 oder 0,3 pN / nm für die Kraftklemme Assay und Haftung Frequenz-Assay und 0,1 pN / nm für die thermische Fluktuation Test eingestellt) , die eine erforderliche Ansaugdruck in der Einheit Zentimeter Wasser zurück. Stellen Sie die Höhe des Wassertanks, die an der Sonde Pipette verbindet, bis die erforderliche Absaugen Druck erreicht ist.
- Zeichnen Sie eine horizontale Linie über die RBC Spitze, die eine Kurve in der benachbarten Fenster, das die Helligkeit (Grauwert) von jedem Pixel entlang dieser Linie ergeben wird. Ziehen Sie die Schwellenlinie bei etwa der Hälfte der Tiefe der Kurve (2A, B) sein.
Hinweis: Der Minimalpunkt auf der Helligkeitskurve unterhalb der Schwellenlinie zeigt die Position des Wulstes Grenze, also nur ein lokales Minimum erlaubt. Wenn zwei oder mehrere lokale Minima gibt es derzeit,zeigt das Bild nicht optimal ist (wahrscheinlich aufgrund nicht scharf das Bild, oder eine schlechte Ausrichtung zwischen der Sonde und dem Wulst RBC). - Wählen Sie den gewünschten Modus Experiment: Temperaturschwankungen Assay Haftung Frequenz-Assay oder Klemmkraft-Test. Stellen Sie die Parameter wie gewünscht (zB Aufprallkraft = 15 pN, Laderate = 1.000 pN / s, Kontaktzeit = 1 s, Schließkraft = 20 pN (für Klemmkraft-Test), etc).
- Klicken Sie auf "Start", die das Programm, um die Zielpipette voran zu treiben, das Ziel in und aus dem Kontakt mit der Sonde (siehe Repräsentative Ergebnisse Abschnitt) ermöglicht. Datenerfassung werden parallel, die die Position der Sonde Wulst in Echtzeit aufzeichnet geführt werden. Beenden Sie das Programm, indem Sie auf die Schaltfläche "Stop-Experiment", zu welchem Zeitpunkt ein Fenster öffnet sich, damit das Speichern der erfassten Daten.
7. Fluoreszenz BFP (fBFP) Experiment
- Um die fluore verwendenscence Funktion der BFP Systems den Anregungslichtquelle (Tabelle 1) und dem Fluoreszenzkamera (Tabelle 1), die durch ein separates Programm (Tabelle 1) gesteuert werden. Auf dem Programm, wählen Sie die Parameter für die Fluoreszenz-Bildgebung, einschließlich Verstärkung, Belichtung, Anregungskanäle (in diesem Fall 340 nm und 380 nm-Licht), etc. Folgen alle Zubereitungen in BFP Versuchsprotokolls, einschließlich Ausrichten der Sonde und des Ziels, das zur Visualisierung der Zielzelle Live Fluoreszenzbild von 340 nm oder 380 nm Anregungslicht angeregt ermöglichen.
- Verwenden Sie die Schneidewerkzeug grob Abschnitt der Bereich, in dem die Zelle während der gesamten Aufzeichnungsdauer bleiben.
Hinweis: Durch die Verwendung des Ansatzes kontaktRückzugZyklus wird die Zelle vorwärts und rückwärts bewegt, wiederholt, damit die geschnittene Fläche wesentlich größer ist als die Zelle selbst. - Klicken Sie auf "Record", um die 340 nm eine Zulassungsd 380 nm-Licht, um abwechselnd erregt die intrazelluläre Fluoreszenzfarbstoff (Fura2) und ein Paar von entsprechenden Fluoreszenzbilder abwechselnd etwa einmal in jeder Sekunde aufgezeichnet werden. Gleichzeitig klicken Sie auf "Start" in das Programm, um die BFP Experiment zur Analyse molekularer Interaktionen und der Fluoreszenz-Imaging Experiment, um intrazellulären Calcium-Signalisierung überwachen zu beginnen. Das System wird eine Rohdatendatei für die Rezeptor-Ligand-Bindung (siehe 6A unten) und eine Serie von Fluoreszenzbildern in TIFF-Format für die Calciumsignale erzeugen.
8. Datenanalyse
- BFP Data Analysis
- Datenanalyse für die Haftung Frequenz-Test
- Sequentiell zu inspizieren jedes Zyklus "Kraft-Zeit" -Signal und einfach aufzeichnen, die Zyklen enthalten, einen Haft Veranstaltung und welche nicht, und zusammenfassen, um eine durchschnittliche Haftfrequenz ergeben.
- Sammeln Sie die Bruchkraft jeder Haftung Veranstaltung, dieist der Spitzenwert der linear rampenförmige Kraft, bevor Bindungsbruch. Nach dem Sammeln einer ausreichenden Menge an Bruchkräfte in einem Bereich von Rampenraten, leiten die Bruchkraftverteilung an jeder Rampenrate aus dem das kraftabhängige off-Rate von Rezeptor-Ligand-Dissoziation mit dynamischen Kraftspektroskopie-Analyse 18,31 abgeleitet.
- Datenanalyse für die thermische Fluktuation Test
- Sequentiell inspizieren die Klemmphasensignal eines jeden Zyklus, die wahrscheinlich enthält Fachbindung Assoziation und Dissoziation Veranstaltungen. Verwenden Sie die Spannphase Temperaturschwankungen Ebene (die durchschnittliche Standardabweichung von einer gleitenden Intervall von 70 aufeinanderfolgenden Zeitpunkten der Wulst-Position) in der "Kraft-Zeit" -Signal als Leitfaden, um die Bindung Assoziation und Dissoziation Ereignissen zu unterscheiden, da eine Bindung Bildung entspricht einer Verringerung der Temperaturschwankungen.
- Bestimmen Sie das Intervall vom Zeitpunkt des Bindungsdissoziationsenergie (wenn die thermal Schwankung wechselt in die normale Ebene) zu dem Zeitpunkt des nächsten Bindungsbildung als Wartezeit, und bezeichnen die Dauer der Bindung von ihrer Zuordnung zu Dissoziation Bindung Lebensdauer, die sowohl während der Datenprüfung erfasst werden. Berechnen Sie die durchschnittliche Wartezeit und durchschnittliche Bindungslebenszeit, die jeweils während der Kehrwert des on-Rate und der off-Rate unter Nullkraft 16,30.
- Datenanalyse für Kraftspanntest
- Nehmen Parameter aller Lebens Veranstaltungen, darunter die durchschnittliche Kraft und Rentenlaufzeit mit der Sequenznummer als auch die Startzeit und die Endzeit, die erlauben es, eine kumulierte Lebensdauerkurve ziehen wird (zum Beispiel 6C, gelbe Kurve).
- Sammeln Sie eine ausreichende Menge an Lebensereignisse unter einer Reihe von Kräften. Gruppe sie in unterschiedlichen Kraft Bins, die eine durchschnittliche Lebensdauer in jeder Kraft bin produzieren wird, und zusammen ergeben eine "mittlere Lebensdauer vs. Kraft "Kurve (Abbildung 4).
- Datenanalyse für die Haftung Frequenz-Test
- Calcium Fluoreszenz Imaging Data Analysis
- Einzustellen, die Schwellenintensität, bis die Fluoreszenzbilder zeigen eine deutliche Kontur der Zelle in beiden 340 nm und 380 nm-Kanäle ohne Hintergrundrauschen (5A, B). Dann überprüfen die intrazelluläre Ca 2+ Signalrahmen durch Rahmen mit einer Pseudofarbe, die den Intensitätspegel (6B), die abgeleitet ist von der Intensität Verhältnis von 340 nm / 380 nm, um den "normalisierten Ca 2+ Intensität vs erzeugen . Zeit "-Kurve (6C). Mithilfe der Pseudofarbfluoreszenzbilder, um einen Film, der die Fluoreszenzniveau zweite zeigt von Sekunde zu erzeugen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die BFP Technik wurde von der Evans Labor 1995 17 voran. Diese picoforce Werkzeug wurde ausgiebig auf Wechselwirkungen von Proteinen auf Oberflächen immobilisiert zu messen, um so zweidimensionale Kinetik von Adhäsionsmolekülen zu analysieren, um die Interaktion mit ihren Liganden 16,19,20 verwendet, 30, um das Molekular Elastizität 21,29 zu messen und zu bestimmen, Protein Konformationsänderungen 21. Für eine fBFP, ein zusätzlicher Satz von Epifluoreszenz bezogene Einrichtungen mit dem entsprechenden Software-System (Tabelle 1) zugegeben wird (1A - C).
Die fBFP System besteht aus einem Hardwaresystem (optischen, mechanischen und elektrischen Komponenten), und ein Softwaresystem (Tabelle 1 und 1A, B). Einem inversen Mikroskop (Abbildung 1A, Mitte) mit optischen Komponenten ermöglicht Hellfeld und Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskopie macht den Hauptteildie fBFP System, auf das das Experiment Bühne und Pipetten Manipulatoren montiert sind. Ein Fluoreszenzlichtquellensteuerung (1A, oben links) wird verwendet, um Wechselanregungslichter liefern. Ein Dual-CAM-System "DC2" teilt das Licht in zwei und überträgt sie auf ein Hochgeschwindigkeitskamera (blau) und einem Fluoreszenz-Kamera (weiß) (1A, links unten). Der ehemalige sammelt die Bildsonde zur Positionsbestimmung und die letztere sammelt Fluoreszenzbilder von der Zielzelle bei zwei Wellenlängen emittiert. Das Experiment wird überwacht und von zwei Computern, von denen Host-PC 1 (1A, oben rechts im Bild beschnitten Platzgründen) gesteuert wird, um sowohl die Hochgeschwindigkeitskamera und der Fluoreszenz-Kamera angeschlossen und ist für die Ausführung verantwortlich Experiment und Datenerfassung, und Host-PC 2 ist mit der Überwachungskamera verbunden ist und für die Präsentation eine vollständige Ansicht des BFP Erfah verantwortlichment (1A, B).
Während eines Experiments verwendet der Experimentator drei Mikropipetten zu greifen und zu manipulieren Zellen und Mikrokügelchen jeweils (1E, F). Ein typisches Bild eines BFP Experiment besteht aus einer Kraftsonde, die durch das Anbringen einer Sonde Perle auf dem Scheitelpunkt eines aspirierten RBC zusammengebaut ist, und einer Zielzelle / Kügelchen (2A). Ein Bereich von Interesse (ROI), die den Randbereich der Sicke auf dem RBC Scheitel enthält, wird durch eine schnelle Geschwindigkeitskamera (2,000 fps) verfolgt werden, um die Verformung der RBC in Echtzeit zu überwachen. Die verfolgte Verschiebung der Kügelchen dann verwendet werden, um die externe Kraft zu berechnen auf den Kraftfühler ausgeübt (siehe Hinweis im Protokoll Abschnitt 6.6), da die Federkonstante des BFP (2A, B).
Haftung Frequenz-Test, Temperaturschwankungen Assay und Kraftspann Assay sind die drei häufigsten verwendeten Versuchsarten auf einem BFP-System. Von adentscheiden jede dieser drei Betriebsarten wird ein BFP Experiment wiederholt Testzyklen, die nacheinander durchgeführt werden, zusammengesetzt ist.
Adhäsion Frequenz Assay nähert sich das Ziel und die Sonde Kontakte Wulst an einem gegebenen Kontaktzeit (zum Beispiel 1 Sekunde), und fährt direkt zurück in die ursprüngliche Position und startet den nächsten Zyklus. Eine Haft Ereignis wird durch eine Zugkraft-Signal während der Rückzugsphase reflektiert. Dieser Ansatz-Kontaktrückzugszyklus wird 50 mal für mindestens 3 Target-Sonden-Paaren wiederholt, um einen Mittelwert ± SEM der Adhäsion Frequenz P a zu berechnen.
Temperaturschwankungen Test wird für sein Lebenswerk Messungen unter Null-Kraft verwendet. In jedem Zyklus, nach dem Berühren der Sonde Wulst wird das Ziel an den Nullkraft-Position zurückgezogen ist und in Kontakt mit dem Wulst entweder ohne Druck oder Zug für 20 Sekunden festgeklemmt, und kehrt dann in die Ausgangsposition, um den nächsten Zyklus zu beginnen. Bond Verband / Dissoziation unter Nullkraftmanifestiert als plötzlicher Abfall / Anstieg der thermischen Fluktuationen des Wulstes 16,30.
Klemmkraft-Test ist für Lebensdauermessungen unter Kräfte eingesetzt. Eine gewünschte Spannkraft (zum Beispiel 20 pN) wird vor dem Experiment eingestellt. Das Ziel wird wiederholt angetrieben, um die Sonde Wulst für eine gegebene Kontaktzeit (zum Beispiel 1 Sekunde) zu kontaktieren, um die Bildung eines Rezeptor / Ligand-Bindung erlauben (2C Paneele 2 und 3) und ziehen sich dann zurück (2C Panel 4 ). Wenn keine Bindung gebildet wird, durch keine Zugkraft Signal auf der RBC reflektiert wird, oder wenn die Bindungsbrüche vor dem Erreichen der vorgegebenen Spannkraft, wird das Ziel in die ursprüngliche Position zurück und starten Sie den nächsten Zyklus. In den Bindungsereignissen, die die Rückziehphase zu überleben, das Ziel an der Klemmkraft mit einer entsprechenden Verlängerung der RBC von d bis die Bindung dissoziiert (2C Paneele 5 und 6), und dann auf die ursprüngliche Setzung zurückgehaltenIonen, um den nächsten Zyklus (2C, Panel 7) zu starten. Als Lebensdauer wird die Zeitspanne von dem Zeitpunkt definiert, wenn die Kraft, erreicht die gewünschte Stufe zu dem Zeitpunkt des Bindungsdissoziationsenergie 20.
Für alle diese drei BFP Versuchsarten sollte der Experimentator in der Lage, den Ansatz-impinge kontaktlosen herauszufahren (clamp -) sehen (dissociate-) return Testzyklus (Figur 2C), die mehrere Male wiederholt werden 16,20 , 21.
Aus jeder Versuchsmodus BFP gesammelten Daten können auf verschiedene Weise, um die gewünschten Ergebnisse abzuleiten analysiert werden. Die durchschnittliche Lebensdauerkurve ist ein Vertreter ergeben sich aus der Kraftspannassay (Abbildung 4). Es spiegelt die wechselseitige off-Raten des Rezeptor-Ligand-Dissoziation unter Kräften. Temperaturschwankungen Assay erlaubt die Charakterisierung von 2D-Rate und off-Rate von einem Rezeptor-Liganden-Paar unter Nullkraft-16; während Haftung frequency Test macht den 2D-Rate, off-Rate und Affinität unter Null-Kraft 13.
Das Add-In der Fluoreszenz-Bildgebungs Funktion können zur Überwachung des intrazellulären Ca 2+ Ebene einer einzelnen Zelle, die als das Auslesen der Zellsignalisierung in diesem System verwendet wird. Um diese Funktion während einer fBFP Experiment verwenden, muss man vor, laden die Zellen mit einem Ca 2+ Anzeige. Im Fall der Fura2-AM wobei der Fluoreszenzfarbstoff wurden die Fluoreszenzbilder der gleichen Zelle unter 340 nm und 380 nm Anregungskanäle abwechselnd in dem Experiment aufgezeichnet und geprüft Paar-zu-Paar in der Analyse. Eine Intensitätsschwelle wurde auf Fluoreszenzbild für jeden Kanal zugewiesen Hintergrundrauschen zu entfernen, und erkennen die Zellkontur (Figur 5). Vergleich von jedem Paar der Fluoreszenzbilder ermöglicht die Berechnung der intrazellulären Ca 2+ Ebene. Klar Fluoreszenzbilder der Zelle sowohl unter 340 nmund 380 nm Anregungskanäle sind für die genaue Messung der Ca 2+ Ebene (5A, B) erforderlich, während schlechte Bilder mit nicht zu vernachlässigenden Hintergrundgeräusche werden in verzerrten Ergebnissen führen und sollte vermieden werden (5C).
Durch die Einführung steuerbare mechanische Reize auf die Zelle und Rekordzelle Ca 2+ Ebene gleichzeitig stellt die fBFP eine leistungsfähige Einzelmolekül-Tool, um mechanisch-Weiterleitung auf einer lebenden Zelle zu studieren. Es ist erwähnenswert, dass die hier beschriebene Plattform ist sehr vielseitig; im Prinzip kann man zahlreiche Möglichkeiten der eine Kraft auf die Zelle, um bestimmte Zwecke zu entsprechen und gleichzeitig Überwachen verschiedener Signalwege von Interesse zu entwerfen. Die kraftabhängigen kinetischen Daten werden dann im Rahmen des gewählten Signalauslese analysiert, um Merkmale des kraftgeregelten Rezeptor-Ligand-Kinetik, die induzierte Signalübertragung und deren Korrelation zu extrahieren. In dem Beispiel von TCR signaling, ein Agonist spezifischen TCR-pMHC catch Anleihe wurde zum ersten Mal entdeckt und dann ihre Relevanz für T-Zell-Ca 2+ Fluss wurde 27 untersucht. Die Strategie bestand darin, den Spitzenwert des Ca 2+ Fluss nehmen, wie die Signalisierung Auslese seine beste Prädiktor unter verschiedenen kinetischen Parameter zu suchen, einschließlich der Anzahl der Adhäsionen, die Kraftamplitude der Bindung, die durchschnittliche Lebensdauer, die längste Lebensdauer und der kumulativen Lebensdauer der nacheinander gebildeten Bindungen. In Abbildung 6 ist ein Beispiel der gleichzeitig aufgenommenen Einzelbindung Lebenszeiten (wo eine Schließkraft von 10 pN angewendet wurde) einer T-Zelle und deren Akkumulation zusammen mit dem entsprechenden Ca 2+ Signalkurve. In diesem Fall trat vier Lebensereignisse vor der Zeit, in der Ca 2+ Ebene begann bei 55 Sekunden zu erhöhen, Akkumulieren einer Summe von 10-Sekunden-Bindung Lebensdauer. Dieses Niveau der Lebens Ansammlung löste eine Ca 2+ Signal mit einem Spitzenwert von normalisierten Fura2 Verhältnisvon 1,8, die bei 65 sec aufgetreten. Eine systematische mathematische Analyse solcher aus vielen einzelnen Zellen gesammelten Daten ergab, dass die besten Korrelat der Ca 2+ Signalstärke Lebenszeiten in der 1. Minute wiederholte TCR-Wechselwirkungen pMHC kumuliert (siehe technische Infos Artikel 27).
Abbildung 3: Beispielhafte Zeitkraft Rohdatenkurven eines nicht-haft Ereignis (A), eine Bruchkraft Ereignis (B) und eine Lebensdauer Veranstaltung (C). Verschiedene Phasen des Zyklus und den entsprechenden Kurvensegmente sind jeweils in jeder Platte markiert. Die Kraft (y-Achse) aus Verfolgen der Positionsänderung der Sonde Wulst abgeleitet wird, wie in 2C gezeigt. (A) Keine Haftung: die Druck (negativ) Kraft in der Kontaktphase kehrt to Null beim Zurückziehen. (B) eine Bruchkraft Veranstaltung: eine Zugkraft (positive) Kraft zieht über die Rezeptor-Liganden-Bindung an die RBC, die während der Rückzugsphase reißt verlängern. (C) Ein Lebensereignis: die Verbindung bleibt bestehen, bis die Spannkraft erreicht ist und danach distanziert. Die Dauer der Laufzeit-Ereignis wird angezeigt. Die Bruchkraft Ereignis (B) und der Beginn des Leben-Ereignis (C) sind mit einem Stern markiert.
Abb. 4: "Mittlere Lebensdauer vs. Kraft" Kurve OT1 T-Zelle mit ihrer Agonisten OVA (grün) und Antagonisten G4 (blau) interagieren Die gesammelten Daten in unterschiedlichen Kraft Bins gruppiert, und der Mittelwert ± SEM von Anleihelaufzeiten ist aufgetragen gegen Gewalt.
Abb. 5: Repräsentative Ca 2+ Bilder bei zwei Wellenlängen angeregt wird (A, B) Richtiges Bild Anerkennung einer T-Zelle in 340 nm (A) und 380 nm (B) Kanäle basierend auf Punkt-zu (rot gekennzeichnet) Punkt-Screening mit einem richtig zugewiesen Intensitätsschwelle. (C) Unmöglichkeit, die Fluoreszenzbild einer T-Zelle (rot gekennzeichnet) in der 340 nm Anregungskanal aufgrund der schlechten Fura2 Lade erkennen.
Abbildung 6: Überlagerung der "intrazellulären Ca 2+ (relativ Fura2-Verhältnis) gegenüber der Zeit" und der "kumulative Lebens versus Zeit" -Kurven eines OT1 T-Zelle zu erzeugen,d durch mehrfaches Berühren der T-Zelle mit einem OVA-beschichtete Kügelchen mehr als 300 Sekunden. (a) eine Kraftkurve, die eine Abfolge von nicht-Adhäsion, Bruchkraft und durch wiederholte Kontakte über die Zeit erzeugt Lebensereignisse. (B) Epi-Fluoreszenz Pseudofarbbilder von intrazellulärem Ca 2+ Signale in der T-Zelle zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Die normalisierte Ca 2+ Pegel durch den pseudo-Farbskala auf der rechten Seite angegeben. (C) Überlagerung der Ca 2+ Signalkurve (rot) und der kumulierten Lebensdauerkurve (gelb) auf der gleichen zeitlichen Verlauf. Die Ca 2+ Kurve wurde auf Basis des Ca 2+ Abbildungs aufgetragen. A Ca 2+ Fluss wird von einer scharfen Erhöhung der normierten Fura2 Verhältnis bezeichnet. Die Zeit, wenn Ca 2+ erreicht den Peak durch eine gestrichelte Linie angedeutet. Der Beginn Zeit jedes Lebensereignis auf der kumulierten Lebensdauerkurve (gefülltes Dreieck) gekennzeichnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eine erfolgreiche fBFP Experiment bringt einige kritische Überlegungen. Erstens, für die Kraftberechnung zu zuverlässig sein, die Mikropipette, die RBC und die Sonde Perle sollte so nah wie möglich koaxial ausgerichtet werden. Die Projektion der RBC in der Pipette über eine Sonde Pipetten Durchmesser sein, so dass die Reibung zwischen dem RBC und dem Pipetten vernachlässigbar ist. Für eine typische menschliche RBC ist die optimale Pipetten Durchmesser von 2,0-2,4 um, die eine beste Anpassung der Gleichung 1 17,30 ergibt. Zweitens, um sicherzustellen, Messungen in Kraftklemme Assay und Temperaturschwankungen Assay sind meist für Einzelbindungen, um eine Haft Frequenz von unter 20% hat gehalten 10,13,30 werden. Hier sollten unspezifische Verwachsungen vorsichtig (durch ausreichende Blockierung mit BSA in der Regel <5%) gesteuert werden. Darüber hinaus sollten die Daten nur aus Adhäsionsereignisse mit einem einzigen Kraftabfall gesammelt werden - Kennzeichen einer Einzelmolekülverhalten (analog zu einem einstufigen Verschwindender Fluoreszenz in Einzelmolekül-FRET). Drittens Lade Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs sollte auf einer Fall-zu-Fall-Basis optimiert werden, um die beste Bildqualität zu erzielen. Viertens ist die Toxizität der Farbstoffbeladung auf T-Zellen oder anderen Zellen von Interesse muss sorgfältig vor jedem Experiment untersucht werden. Zum Beispiel kann die Bindungsaffinität von Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung bei der Farbstoffbeladung müssen gemessen und verglichen werden, dass ohne Farbstoffbeladung. Wenn die Bindungsaffinität ist dramatisch ändern aufgrund der Belastung zu färben, hat einen anderen Farbstoff oder ein anderes Beladungskonzentration zu berücksichtigen. Fünftens sind unheilbar Biotin-markierte Proteine bevorzugt, bequem, spezifische und starke Kopplung, die native Orientierung des Proteins bewahrt ermöglichen.
Eine Hauptstärke des fBFP ist, dass es eine einzige Bindungsassay an einer einzigen Zelle durchführt. Trotz des geringen Durchsatzes, single-Bindung Analyse deckt oft wichtige Funktionen, die nicht zugänglich durch konventionelle Ensemble mich sindthoden. Zum Beispiel durch die Untersuchung der Lebensdauerverteilung an jedem Kraft bin, kann man verschiedene Bindungseigenschaften mit Protein Konformationen korrelieren, die einen Einblick darüber, wie Kraft regelt Protein Konformationsänderungen 20,32. Die BFP können auch verwendet werden, um molekulare Steifigkeit aus Kraft und piezoSetzerVerlagerung Daten der Rückzugsphase, die verwendet werden können, um Protein Konformationsdynamik 20,21 untersuchen messen.
Viele Verfahren sind entwickelt worden, um Rezeptor-vermittelte Zelladhäsion und Signalisierung zu untersuchen. Rezeptor-Ligand-Bindungskinetik in der Regel mit rekombinanten Proteinen in völliger Isolation von der zellulären Umgebung gemessen. Eine solche Praxis ist potenziell problematisch. Zum Beispiel wurde kürzlich gezeigt, dass in situ Kinetik gemessen an lebenden Zellen drastisch unterscheidet sich von der gemessenen mit den entsprechenden rekombinanten Proteinen 14 und enthüllt neue Erkenntnisse des Rezeptors & #8217; s Zellfunktionen. Nicht nur ist die fBFP fähig Quantifizieren Rezeptor-Ligand-Kinetik in situ, aber noch wichtiger ist, es kann auch gleichzeitig aufnehmen, die Bindung induzierte Zellsignalisierung. Wie für die TCR 27, der reichen Informationen der Bindungseigenschaften und Zellsignalisierung unter Verwendung fBFP bietet eine beispiellose Gelegenheit für die Analyse ihrer Beziehungen und das Verständnis der molekularen Mechanismen der mechanisch-Transduktion demonstriert. Es ist wahrscheinlich, dass fBFP mehr Anwendungen in anderen wichtigen Rezeptor-Ligand-Systeme zu finden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
| Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
| Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
| Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
| Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
| Capillary Tube 0.7-1.0 mm x 30 inches | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
| Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
| Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
| 1 ml syringe | BD | 309602 | chamber assembly |
| Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
| Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
| Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
| Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
| Camera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
| Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
| Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
| Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
| 3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
| LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
| 3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
| Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
| Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
| Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
| Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
| Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
| Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | 8.4 g/L sodium carbonate (Na2CO3), 10.6 g/L sodium bicarbonate (NaHCO3) | ||
| Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | 27.6 g/L NaPhosphate monobasic (NaH2PO4 • H2O), 28.4 g/L Anhy. NaPhosphate dibasic (Na2HPO4) | ||
| N2-5% buffer (pH 7.2) | 20.77 g/L potassium chloride (KCl), 2.38 g/L sodium chloride (NaCl), 0.13 g/L potassium phosphate monobasic (KH2PO4), 0.71 g/L anhy. sodium phosphate dibasic (Na2HPO4), 9.70 g/L sucrose |
References
- Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. Mechanical control of stem cell differentiation. Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).
- Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters. Frontiers in immunology. 3, 86 (2012).
- Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network. Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).
- Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. T cell antigen recognition at the cell membrane. Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).
- Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions. Physical biology. 9, 045005 (2012).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
- Marshall, B. T., et al. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423, 190-193 (2003).
- Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).
- Yago, T., et al. Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear. The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).
- Yago, T., et al. Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF. The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).
- Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 (2010).
- Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).
- Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib. Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).
- Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells. The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).
- Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).
- Nesbitt, W. S., et al. Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow. The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).
- Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor. Blood. 100, 2793-2800 (2002).
- Lefort, C. T., Ley, K. Neutrophil arrest by LFA-1 activation. Frontiers in immunology. 3, 157 (2012).
- Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling. Cell. 157, 357-368 (2014).
- Lou, J., et al. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature communications. 5, 4886 (2014).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).
- Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. Force history dependence of receptor-ligand dissociation. Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).
- Xiang, X., et al. Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin. PloS one. 6, e27946 (2011).
