Abstract
Membran reseptor-ligand interaksjoner medierer mange cellefunksjoner. Bindende kinetikk og nedstrøms signal utløst av disse molekylære interaksjonene er trolig påvirket av den mekaniske miljø der bindingen og signalering finner sted. En ny studie viste at mekanisk kraft kan regulere antigen gjenkjennelse av og aktivering av T-cellereseptoren (TCR). Dette ble gjort mulig av en ny teknologi vi utviklet og betegnet fluorescens biomembrane kraft probe (FBFP), som kombinerer single-molekyl kraft spektroskopi med fluorescens mikroskopi. Ved hjelp av en ultra-myk menneskelige røde blodceller som sensitive kraft-sensor, et high-speed kamera og sanntids bildebehandling sporing teknikker, er FBFP av ~ 1 PN (10 -12 N), ~ 3 nm og ~ 0,5 msek i kraft, romlig og tidsmessig oppløsning. Med FBFP kan man presist måle enkelt reseptor-ligand bindingskinetikk under tvang regulering og samtidig image binding-utløst intracellulær calCium signalering på en enkelt levende celle. Denne nye teknologi kan benyttes for å studere andre membran reseptor-ligand-interaksjon og signalisering i andre celler under mekanisk regulering.
Introduction
Celle-til-celle og celle-til-ekstracellulær matriks (ECM) adhesjon mediert av binding mellom celleoverflatereseptorer, ECM-proteiner, lipider og / eller en. Binding tillater cellene å danne funksjonelle strukturer 1, så vel som gjenkjenne, kommunisere og reagerer på miljøet 1-3. Til forskjell fra løselige proteiner (f.eks, cytokiner og vekstfaktorer) som binder seg fra en tre-dimensjonal (3D) væskefasen til celleoverflatereseptorene, celle adhesjonsreseptorer danne bindinger med deres ligander over en smal junctional gap for å bygge bro to motstående flater som begrenser molekyl diffusjon i en dimensjonal (2D) grensesnitt 4-7 to. I motsetning til 3D-kinetikk som vanligvis måles ved tradisjonelle bindingsanalyser (for eksempel overflate-plasmonresonans eller SPR), 2D kinetikken er å kvantifisere med spesialiserte teknikker som atomkraftmikroskopi (AFM) 8-10, strømningskamret 11,12, mikropipette 13,14, optiskpinsett 15 og biomembrane kraft probe (BFP) 16-21.
Mer enn bare å gi fysisk binding for cellulær kohesjon, adhesjonsmolekyler er en viktig del av signal maskiner for cellen til å kommunisere med omgivelsene. Det har vært en økende interesse for å forstå hvordan ligand inngrep av adhesjonsmolekyler initierer intracellulær signalisering, og hvor det opprinnelige signal blir omformet inne i cellen. Intuitivt egenskapene til reseptor-ligand binding kan påvirke signalene det fremkaller. Det er imidlertid vanskelig å dissekere mekanistiske forhold mellom det ekstracellulære interaksjon og intracellulære signalhendelser ved hjelp av tradisjonelle ensemble av biokjemiske analyser på grunn av deres mange begrensninger, f.eks, en dårlig tidsmessig oppløsning og den fullstendige mangel på romlig oppløsning. Eksisterende metoder som tillater både biofysiske (2D reseptor-ligand binding kinetikk) og biokjemiske (signalanlegg) observasjoner på levendeceller inkluderer substrater av tunbare stivhet 22, elastomer søyle arrays 23 og strømningskamret / microfluidic enheter innlemmet med fluorescens evne 24-26. Men avlesninger av signalering og reseptor-ligand binding må skaffes separat (oftest ved ulike metoder), noe som gjør det vanskelig å dissekere tidsmessige og romlige relasjoner for obligasjons egenskaper med signale hendelser.
Konvensjonell BFP er en ultra kraft spektroskopi med høy tid og rom oppløsning 17. Den bruker en fleksibel røde blodceller (RBC) som en kraftmåler, slik at måling av enkelt-molekyl 2D kinetikk, mekaniske egenskaper og konformasjonsendringer 14,16,19-21,27-29. En fluoriserende bildebasert BFP (FBFP) korrelerer reseptor-ligand-bindingskinetikken med bindingen-utløste cellesignalisering ved enkelt-molekyl skala. Med dette oppsettet, in situ cellesignale aktiviteter i sammenheng med overflate mekanismercal stimulering ble observert i T-celler 27. Den FBFP er allsidig og kan anvendes for undersøkelser av celle-adhesjon og signalisering medieres av andre molekyler i andre celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene til og har blitt godkjent av menneskelige forskningsetiske komité for Georgia Institute of Technology.
1. Menneskelig RBC Isolation, Biotinylation og Osmolaritet Adjustment
Merk: Trinn 1.1 bør utføres av en utdannet medisinsk faglig for eksempel en sykepleier, med en Institutional Review Board godkjent protokollen.
- Skaff 8-10 ul (en dråpe) av blod fra fingerstikk og tilsett 1 ml av karbonat / bikarbonat-buffer (tabell 1 og 2). Forsiktig vortex eller pipettere blandingen og sentrifuger i 1 min ved 900 x g. Kast supernatanten og vask en gang til.
- I et lite begerglass veie 3,5 til 4 mg av biotin-PEG3500-NHS-linker (tabell 1). Oppløs den i karbonat / bikarbonat-buffer for å gjøre den endelige konsentrasjonen på 3 mg / ml.
- Bland 171 ul av karbonat / bikarbonat-buffer, 10 pl av RBC pakningen og 1049 ulBiotin-PEG3500-NHS linker løsning og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Vask en gang med RBC karbonat / bikarbonat-buffer og deretter to ganger med N2-5% buffer (tabell 1 og 2).
- I mellomtiden plasseres linker flasken med hetten løsnet i et glass vakuumeksikator fylt med tørkemidler i bunnen og vakuum i 5 min, og fylle eksikator med argon. Stramme hetten og ta flasken ut. Forsegle flasken med plast parafin film (tabell 1), plasser den i en beholder fylt med tørkemidler på bunnen og butikk i -20 ° C.
Bemerk: Trinnene som innebærer bruk av biotin-PEG3500-NHS linker, inkludert 1,2 til 1,4 (med unntak av inkubasjon og vask i 1,3), må utføres så raskt som mulig. - Fortynn nystatin til N2-5% buffer for å lage en endelig konsentrasjon på 40 ug / ml. Bland 5 ul biotinylert RBC med 71,4 ul av nystatin (tabell 1) løsning og inkuberes i 1 time ved 0 &# 176; C. Vask to ganger med N2-5% buffer og butikk med N2-5% buffer + 0,5% BSA (tabell 1) i kjøleskap (4 ° C).
2. Perler silanisering
- Rengjøring av Bead Surface
- Veie 50 mg av glassperler pulver og re-suspendere dem i 500 mL av DI vann.
- Bland 0,5 ml 30% H 2 O 2 (tabell 1) med 9,5 ml avionisert vann i et 50 ml begerglass, deretter tilsett 2 ml konsentrert NH4OH (tabell 1) og bringe denne oppløsning til en kjele på en varm plate .
- Tilsett glassperler til den kokende oppløsning og fortsetter å koke i ytterligere 5 min. Virvle løsningen hvert min.
- Etter koking, overføre ~ 5 ml av denne varme perle suspensjonen i en 15 ml mikro-sentrifugerør og topp opp med RT DI vann. Sentrifuger ved 3500 xg i 5 min, ta ut og kast supernatanten.
- Overføre ytterligere 5 ml varmt perle suspensjon og legge til vasket perler, Fylle opp med mer DI vann, bland godt, og sentrifuger igjen. Gjenta dette inntil ca. 50 ml DI-vann benyttes, som vil være totalt 4 til 5 ganger med vaske.
- Overfør perlesuspensjon i en 1 ml ampulle. Gjenta vaske perlene med metanol (tabell 1) ved sentrifugering ved 17.000 xg i 5 minutter til 3 ganger, og til slutt re-suspendere kulene i 1 ml av 100% metanol.
- Perlene Surface Tiolering
- Til et 50 ml sentrifugerør legge 45,6 ml metanol, 0,4 ml eddiksyre (tabell 1), 1,85 ml av DI vann, 1,15 ml 3-merkaptopropyltrimetoksysilan (MPTMS) (tabell 1) og 1 ml kuler suspensjon fremstilt i 2.1, og deretter inkubert ved romtemperatur i 3 timer.
- Etter reaksjonen fjerne alle reaktantene ved vasking en gang med frisk metanol, og re-suspendere kulene i 500 mL metanol. Jevnt dele denne konsentrerte glass perle suspensjon i et sett av 20 tørre og rene glassflasker medskrulokk. Fordamp av metanol ved hjelp av en stråle av tørr argon og sakte rotere ampuller, slik som å lage et tynt lag av tørre perler på sidene av hver ampulle.
- Plasser ampuller med perlene inn i en forvarmet tørkeovn ved 120 ° C i 5 minutter og deretter ta ut og sette inn raskt lokket (r) løst på. Plasser hetteglassene i en glass vakuumeksikator fylt med tørkemidler i bunnen og vakuum eksikkator med en vakuumpumpe før den har avkjølt.
- Rens det støvsuges eksikator med tørr argon for å bringe tørkekammer for normalt atmosfæretrykk. Fjern eksikkatoren lokket og raskt skru lokket (e) på hetteglasset. Forsegle hetteglass med plast parafin film og lagre dem ved RT i et tørt mørk oppbevaringsboks.
- Ved umiddelbar bruk, ta ett hetteglass med tørre perler og vaske en gang med fosfatbuffer (tabell 1 og 2), re-suspendere i 50 ul fosfatbuffer og butikken ved 4 ° C. Vil denne konsentrerte vulst preparatet bli referert tilsom "MPTMS perler" i følgende trinn.
Merk: Med riktig oppbevaring, kan MPTMS perler forbli funksjonell for inntil tre måneder.
3. Bead funksjon
- Kovalent Coating Proteiner på Perler
- Ta et visst volum (for eksempel 2,5 mL) av proteinet lager og blandes med likt volum av karbonat / bikarbonat-buffer for å få en løsning.
Merk: Volumet avhenger av lager-konsentrasjon og den ønskede endelige tetthet området av proteinet på overflaten kuler. - I et lite begerglass veie 2-3 mg av MAL-PEG3500-NHS-linker (tabell 1) og oppløse den med karbonat / bikarbonat-buffer for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0,231 mg / ml.
- Bland Løsning 1 med et like stort volum av linkeren oppløsningen fremstilt i 3.1.2. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 30 min for å gjøre Løsning 2.
- I mellomtiden, plasserer linker flaske med løsnet cap i et glass vakuumeksikator filled med tørkemidler i bunnen og vakuum i 5 min, og fylle eksikator med argon. Stramme hetten og ta flasken ut. Forsegle flasken med plast parafin film, legg den i en beholder fylt med tørkemidler på bunnen og butikk i -20 ° C.
Bemerk: Trinnene som innebærer bruk av MAL-PEG3500-NHS linker, inkludert 3.1.2-3.1.4 (med unntak av inkubering i 3.1.3), må utføres så raskt som mulig. - Bland 5 mL av MPTMS perler med Løsning 2 og tilsett fosfatbuffer (tabell 1) for å gjøre et sluttvolum på 250 ul.
- Inkubering av kulene over natten ved romtemperatur, vaskes 3 ganger med fosfatbuffer, og re-suspen i 100 ul fosfatbuffer og oppbevares ved 4 ° C.
- Ta et visst volum (for eksempel 2,5 mL) av proteinet lager og blandes med likt volum av karbonat / bikarbonat-buffer for å få en løsning.
- Forbereder Protein / streptavidin (SA) kuler
- Følg protokollen 3.1.1-3.1.4.
- Bland 5 ul MPTMS perler med Løsning 2 og 5 ul av 4 mg / ml streptavidin-maleimid (SA-MAL) (tabell 1) Oppløsning og deretter legge fosfatbuffer for å lage et sluttvolum på 250 ul.
- Inkubering av kulene over natten ved romtemperatur, vaskes 3 ganger med fosfatbuffer og til slutt re-suspen i 100 ul fosfatbuffer og oppbevares ved 4 ° C.
- Coating streptavidin på Glassperler
- Bland 5 mL av MPTMS perler med 5 ul av 4 mg / ml SA-løsning og tilsett 140 pl fosfatbuffer.
- Inkubering av kulene over natten ved romtemperatur, vaskes 3 ganger med fosfatbuffer, og re-suspen i 50 ul fosfatbuffer og oppbevares ved 4 ° C.
- Belegg SA kuler med en Biotinylated Protein
- Bland 5 ul SA belagte perler med proteinet (volum avhengig av det ønskede belegg densitet) og legge fosfatbuffer for å gjøre sluttvolumet til 100 ul.
- Inkuber blandingen over natten ved 4 ° C eller i 3 timer ved romtemperatur, vaskes 3 ganger med fosfatbuffer, og re-suspendere i 50 ul phosphate buffer og oppbevar ved 4 ° C.
4. Cell Forberedelse
Bemerk: For å rense cellene ved å følge standard-celle renseprotokoller som svarer til den type av celler som brukes, for eksempel T-celler 27 eller visse cellelinjer 21,29.
- For FBFP eksperimenter, når cellesuspensjonen blir fremstilt, tilsett fura2-AM (tabell 1) oppløst i DMSO i cellesuspensjonen for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 2 mM, inkuber i 30 min ved RT og deretter vaske en gang. Hold dette fluorescently lastet cellesuspensjon i mørke før bruk.
5. Forberedelse av Mikropipetter og en Cell Chamber
- Forbereder Mikropipetter
- Kutte lang kapillær glassrør (tabell 1) med et glass cutter i korte biter av rundt 3 inches i lengde. Mount ett stykke på mikropipette avtrekker (tabell 1), klikk på "Trekk", mentonn, slik at den midterste av kapillaren vil bli varmet opp av maskinen og kapillær vil bli trukket på de to ender, slik at to kapillærer med skarpe spisser (rå Mikropipetter).
Merk: Ved å følge produktet retningslinje, har den ønskede morfologi av rå pipetten 6-8 mm konisk og 0,1-0,5 um spiss. - Montere en rå pipette på pipette innehaveren av mikropipette smie (tabell 1). Varme for å smelte glasskule på smia. Sett spissen av pipetten rå inni glasskule. Kjøle ned glass sfære og trekk den rå pipetten til å bryte den fra utsiden og la spissen inne i kula. Gjenta denne prosedyren til ønsket tips åpningen er oppnådd.
Note: Eksempler på en mikropipette spiss indre diameter: 2,0 til 2,4 um for en RBC, ~ 1,5 mikrometer for en vulst, ~ 2-4 mikrometer for en T-celle og -7 um for en hybridomcelle.
- Kutte lang kapillær glassrør (tabell 1) med et glass cutter i korte biter av rundt 3 inches i lengde. Mount ett stykke på mikropipette avtrekker (tabell 1), klikk på "Trekk", mentonn, slik at den midterste av kapillaren vil bli varmet opp av maskinen og kapillær vil bli trukket på de to ender, slik at to kapillærer med skarpe spisser (rå Mikropipetter).
- Bygge en Cell Chamber
Merk: cellen kammeret er bygget på basis av en hjemme-gale kammer holder, som består av to metallstykker kvadrater (kobber / aluminium) og et håndtak som binder dem sammen (figur 1D). - Skjær en 40 mm x 22 mm x 0,2 mm dekkglass ved anvendelse av en glass kutter inn i to 40 mm x 11 mm x 0,2 mm stykker (dekk 1 og 2). Lim dekk en av fett til oversiden av kammeret holder på den måten at det broer de to metall firkanter, og tilsvarende lim dekk 2 til bunnsiden, som vil danne en parallell-dekkkammeret (figur 1D).
- Bruke en pipette for å injisere 200 ul forsøksbuffer inn mellom to dekkglass. Sørg for at bufferen festes til begge dekk. Forsiktig rotere og rist kammeret for å la bufferen berøre begge ender av kammeret.
- Injisere mineralolje forsiktig inn i begge sider av kammeret som flankerer den eksperimentelle buffersone for derved å avtette buffer fra friluft. Injiser perler suspensjoner av probe (for eksempel pMHC-belagte perler), RBC og mål(for eksempel T-celler) i de øvre, midtre og nedre deler av buffersonen henholdsvis.
6. BFP eksperiment
Figur 1: FBFP sammenstillingen (A) et oversiktsbilde over FBFP maskinvaresystemet.. (B) En skjematisk tegning av FBFP maskinvaresystem. (C) Den dual-cam system "DC2" (orange) på hvilken høyhastighetskamera (blå) og en fluorescens-kamera (hvit) ble montert. (D) Mikroskopet scenen som tilpasser et eksperiment kammer og tre mikropipette manipulasjon systemer. (E og F) mikrografer av BFP innstilling i en eksperimentell kammer. (E) Mikropipetter montasje som viser sonden pipette (til venstre), target pipette (øverst til høyre) og hjelper pipette (lavere right). (F) Probe bead plassering. En sonde perle ble manipulert av en hjelper pipette og festet til en RBC apex å danne en kraft probe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Slå på mikroskopet (tabell 1) og lyskilden. Plasser kammeret mot hovedobjektbordet (figur 1 A, D).
- Installere alle tre mikropipetter av BFP (Figur 1D Venstre:. Sonde, for å ta en RBC, høyre: målet, å ta en celle eller perle, nederst til høyre: hjelper, for å ta en perle).
- Bruk en mikro-injektor (tabell 1) for å etterfylle en mikropipette med eksperimentell buffer. Ta av pipetten holderen (tabell 1) og hold den på et lavere sted å la vann drypper fra spissen. Raskt sette mikropipette i holderen tips og sørge for at ingen luftboble kommer inn i mikropipetteunder innføringen. Stram delens skrue.
- Hver pipette holder montere på den tilsvarende mikro-manipulator. Skyv mikropipette mot kammeret slik at deres tips inn i kammeret bufferområdet. Justere plasseringen av mikropipette og finne dem under mikroskopet synsfelt.
- Flytte rundt på kammeret holder scenen for å finne kolonier av tre elementer (RBC, mål og sonde perler) én etter én. Justere plasseringen av den tilsvarende mikropipette ved å dreie knotten av manipulatorer for å la spissen av en mikropipette tilnærmingen celle / perle. Aspirer celle / perle ved å justere trykket i den tilsvarende mikropipette. Alle tre mikropipetter vil fange deres tilsvarende elementer.
- Flytte rundt på kammeret holder scenen for å finne en åpen plass unna kolonier av de injiserte elementer hvor forsøket skal utføres. Slå mikroskop visuell modus for å visualisere bildet på kompUter program på dataskjermen. Flytt alle tre elementene på pipetter inn i programmet visjon feltet.
- Juster sonden vulsten og RBC, og nøye manøvrere sonden vulst til spissen av RBC, kort støter vulsten på RBC og forsiktig trekke. Justere trykket på hjelpe mikropipette for å blåse forsiktig vulsten bort, slik at det vil være igjen limt på RBC apex (figur 1F). Bevege seg bort hjelperen mikropipette og justere målet og probe perle (Figur 2A).
Fig. 2: BFP ordningen og dens testsyklus (A) Video-mikroskopibilde som viser en kraft probe (til venstre) og et mål T-celle (høyre) aspireres ved deres respektive pipettes.The stasjonær kraft probe består av et svellet RBC og en tilknyttet ligand-bærende vulst. Reseptoren bærendeT-celle (target) er montert på en piezotranslator justert motsatt til proben. ROI er angitt i grønt. Kanten bane er antydet i en blå linje. Innsatsen viser ligand (pMHC, perle side) og reseptor (TCR, T-celle side) par på de to motstående flater i området markert med oransje. (B) intensitetsprofilen til vulsten kant i (A). ROI-regionen i x -direction plottes som x -aksen (i pikselantall) og lysintensiteten (i gråtoner verdi) fordelt etter binning 30 piksler langs y -direction. (C) Den avbøyning av RBC og posisjonen av vulsten og målet (T-celle) i en testsyklus av kraft klemme assay. De vertikale og horisontale stiplede linjer angir null-kraft stilling av RBC apex og tidsforløpet, respektivt. Linjen kant bane av RBC deformasjon er vist i blått i hvert panel. De samme ennå færre trinn er vedtatt i vedheft frekvensassay (som mangler de trinn å "klemme" og "dissosiere") og termisk svingning assay (som mangler trinnet med "dissosiere").
- På programmet, i synsfeltet vinduet bruke verktøyene i programmet for å måle de respektive radier for sonden mikropipette (R p), RBC (R 0), den sirkulære kontaktflaten mellom RBC og sonden vulst (R c) , som tillater estimering av fjærkonstanten av RBC (k) ved den følgende ligning 17,30,
der Δ p er aspirasjon press på sonden pipettespissen.
Merk: Det følger av Hookes lov som bindende kraft, F, kan kvantifiseres ved produktet av fjærkonstanten og forskyvning av sonden vulst (d), det vil si F = D (Figur 2C). - Skriv inn ønsket RBC våren konstant inn i programmet (Vennligst referer til protokoll pkt 6.6. Den fjærkonstant er vanligvis satt til 0,25 eller 0,3 PN / nm for kraften klemmen analysen og heft frekvens analyse og 0,1 PN / nm for den termiske svingninger assay) , som vil returnere et nødvendig trykk aspirasjon i enheten av centimeter vann. Juster høyden på vanntanken som linker til sondens pipette til ønsket aspirere trykk er nådd.
- Trekke en horisontal linje på tvers av RBC apex, noe som vil gi en kurve i den tilstøtende vinduet angir lysheten (gråskala-verdi) for hver piksel langs denne linjen. Dra terskellinjen til å være på omkring halvparten av dybden på kurven (figur 2A, B).
Merknad: Minste punkt på kurven lysstyrken under terskelverdien linje indikerer plasseringen av vulsten grense, og dermed bare en lokalt minimum er tillatt. Dersom to eller flere lokale minima er i dag, detindikerer bildet ikke er optimal (sannsynligvis på grunn av bildet være ute av fokus, eller en dårlig innretting mellom sonden perle og RBC). - Velg ønsket eksperimentet modus: termiske svingninger analysen, vedheft frekvens assay eller kraft klemme analysen. Angitt parameterne som ønsket (f.eks impingement kraft = 15 PN, lasting rate = 1000 PN / s, kontakttid = 1 sek, lukkekraft = 20 PN (for kraft klemme assay), etc).
- Klikk på "Start", som tillater programmet å bevege seg målet pipette og drive målet i og ut av kontakt med sonden (se avsnitt Representative resultater for detaljer). Datainnsamlingen blir utført i parallell, som registrerer posisjonen til sonden vulsten i sanntid. Stoppe programmet ved å klikke på knappen "Stopp eksperiment", da et vindu vil komme ut for å tillate lagring av de innsamlede data.
7. fluorescens BFP (FBFP) eksperiment
- For å bruke fluorescence funksjon av BFP system, slå på eksitasjonslyskilde (tabell 1) og fluorescens kameraet (tabell 1), som blir styrt av en separat program (tabell 1). På programmet, velg parametrene for fluorescens bildebehandling, inkludert gevinst, eksponering, eksitasjon kanaler (i dette tilfellet, 340 nm og 380 nm lys), osv. Følg alle preparater i BFP forsøket protokollen, inkludert innretting av sonden og target, som vil tillate for visualisering av målcellen levende bilde fluorescerende eksitert ved 340 nm eller 380 nm eksitasjon lys.
- Bruk snitteverktøyet til omtrent seksjon området innenfor hvilket cellen vil holde seg under hele registreringsperioden.
Bemerk: På grunn av bruken av tilnærmingen-kontakt-tilbaketrekking syklus, vil cellen være bevegelige frem og tilbake gjentatte ganger, således at snittområdet er mye større enn selve cellen. - Klikk på "Record" for å tillate 340 nm end 380 nm lys for vekselvis å eksitere den intracellulære fluorescens-fargestoff (fura2), og et par av tilsvarende fluorescens bilder blir vekselvis registrert omtrent en gang hvert sekund. Klikk samtidig på "Start" i programmet for å starte BFP eksperimentet for analyse molekylær interaksjon og fluorescensavbildning eksperimentet for å overvåke intracellulær kalsiumsignalisering. Systemet vil gi en rå datafil for reseptor-ligand-binding (se figur 6A nedenfor) og en serie av fluorescerende bilder i TIFF format for kalsiumsignaler.
8. Data Analysis
- BFP Data Analysis
- Dataanalyse for vedheft frekvens assay
- Sekvensielt inspisere hver syklus er "force vs. tid" signal og bare registrere hvilke sykluser inneholde en heft hendelse, og som ikke gjør det, og oppsummere for å gi en gjennomsnittlig vedheft frekvens.
- Samle bruddstyrken av hvert adhesjon hendelse somer toppverdien av den lineært rampe kraft før bindingen ruptur. Etter oppsamling av en tilstrekkelig mengde av bruddstyrker i en rekke rampehastigheter, utlede bruddkraftfordelingen ved hvert rampehastighet hvorfra kraften avhengige off-rate av reseptor-ligand dissosiasjon er utledet ved bruk av dynamisk kraft spektroskopianalyse 18,31.
- Dataanalyse for termisk svingninger assay
- Sekvensielt inspisere klem fase signal i hver syklus, som trolig inneholder flere bond foreningen og dissosiasjon hendelser. Bruk klem fase termiske svingninger nivå (gjennomsnittlig standardavvik for en glidende intervall på 70 sekvensielle tidspunkter av perlen posisjon) i "force vs. tid" signal som en guide for å skille de bond foreningen og dissosiasjon hendelser, siden en obligasjon formasjon tilsvarer en reduksjon i den termiske svingninger.
- Utpeke intervallet fra øyeblikket obligasjon dissosiasjon (når thermal svingninger fortsetter å normalnivå) til chat neste bindingsdannelse som ventetid på, og utpeke varigheten av obligasjonen fra sin tilknytning til dissosiasjon som bond levetid, som begge er samlet inn i løpet av data inspeksjon. Beregne gjennomsnittlig ventetid og gjennomsnittlig obligasjons levetid, som henholdsvis reflektere gjensidige av på-rate og at av off-rate i henhold null-force 16,30.
- Dataanalyse for kraft klemme assay
- Record parametre for alle levetids hendelser, inkludert den midlere kraft og bindingen levetid med sekvensnummer, så vel som et starttidspunkt og et sluttidspunkt, som vil tillate en å trekke en kumulativ kurve levetid (for eksempel figur 6C, gul kurve).
- Samle inn en tilstrekkelig mengde av levetiden hendelser under en rekke krefter. Gruppere dem i ulike styrke binger, som vil produsere en gjennomsnittlig levetid på hver kraft bin, og helt gi en "gjennomsnittlig levetid vs. force "kurve (figur 4).
- Dataanalyse for vedheft frekvens assay
- Kalsium fluorescens Imaging Data Analysis
- Juster intensiteten terskel inntil fluorescens bilder viser en klar kontur av cellen i både 340 nm og 380 nm kanaler uten bakgrunnsstøy (figur 5A, B). Deretter gjennomgå den intracellulære Ca2 + signal ramme for ramme med en pseudo-farge som angir intensitetsnivå (figur 6B), som er utledet på grunnlag av forholdet mellom intensiteten på 340 nm / 380 nm, for å generere den "normaliserte Ca2 + intensitet vs . time "kurve (figur 6C). Bruk pseudo-farge fluorescens bilder å produsere en film som viser fluorescens nivået sekund for sekund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BFP teknikken ble utviklet av den Evans laboratorium i 1995 17. Denne picoforce verktøyet har blitt mye brukt til å måle interaksjoner av proteiner immobilisert på overflater, slik som å analysere to-dimensjonale kinetikken av adhesjonsmolekyler i samspill med deres ligander 16,19,20, 30, for å måle molekyl elastisitet 21,29, og for å bestemme protein konformasjonsendringer 21. For en FBFP, et ekstra sett med epi-fluorescens-relaterte enheter med tilsvarende programvaresystem (tabell 1) er lagt til (Figur 1A - C).
Den FBFP Systemet består av en maskinvaresystem (optiske, mekaniske og elektriske komponenter) og et programvaresystem (tabell 1 og figur 1A, B). Et invertert mikroskop (figur 1A, midten) med optiske komponenter og gjør at lyse-feltet og epi-fluorescens mikroskopi utgjør hoveddelen avden FBFP system, hvorpå eksperimentet trinnet og pipettes manipulatorer er montert. En fluorescens-lyskilde kontroller (figur 1A, øverst til venstre) blir brukt til å levere alternerende eksitasjon lys. En dual-cam system "DC2" splitter lyset i to og overfører dem til en høyhastighetskamera (blå) og en fluorescens-kamera (hvit) (figur 1A, nederst i venstre hjørne). Den tidligere samler sonden bildet for posisjonsbestemmelse og sistnevnte Samler fluorescens bilder som slippes ut fra målet celle på to bølgelengder. Eksperimentet er overvåket og kontrollert av to datamaskiner som Host PC 1 (figur 1A, øverst i høyre hjørne, beskjæres i bildet på grunn av begrenset plass) er koblet til både høyhastighetskamera og fluorescens kamera og er ansvarlig for forsøket utførelse og datainnsamling, og Host PC 2 er koblet til overvåkingskamera og ansvarlig for å presentere en full oversikt over BFP experiment (figur 1A, B).
Under et eksperiment, bruker experimentalist tre mikropipetter å hente og manipulere celler og mikrosfærer henholdsvis (figur 1E, F). Et typisk bilde av en BFP eksperiment består av en kraft probe, som blir satt sammen ved å feste en sonde perle på toppen av en aspirert RBC, og en target celle / perle (figur 2A). En region av interesse (ROI) som inneholder den kantområdet til vulst på RBC apex, blir registrert av en hurtig-fotoboks (2000 fps) for å overvåke deformasjon av RBC i sanntid. Den sporede forskyvning av vulsten kan deretter brukes til å beregne den ytre kraft som utøves på den kraft som probe (se note i protokoll avsnitt 6.6), gitt fjærkonstanten til BFP (figur 2A, B).
Vedheft frekvens analysen, termisk svingninger analysen, og kraft klemme analysen er de tre mest brukte forsøksmoduser på en BFP system. Av annonsenå velge en hvilken som helst av disse tre modi, blir en BFP eksperiment sammensatt av gjentatte testsykluser som blir utført sekvensielt.
I adhesjon frekvens assay, nærmer seg målet, og kommer i kontakt med proben vulst på et gitt kontakttid (for eksempel 1 sekund) og trekkes direkte tilbake til den opprinnelige posisjon, og starte neste syklus. En adhesjon hendelse blir reflektert av en strekkraft signal under tilbaketrekkingsfasen. Denne tilnærmingen-kontakt-tilbaketrekksyklusen gjentas 50 ganger, minst tre target-probe-par for å beregne en midlere SEM av adhesjon frekvens, P a.
Termisk svingning assay brukes for levetids måle under null-kraft. I hver syklus, etter berøring av sonden vulst, er målet trekkes tilbake til null-kraft stilling og fastklemt i kontakt med vulsten uten enten kompresjon eller strekk i 20 sekunder, og deretter går tilbake til den opprinnelige stilling for å begynne den neste syklus. Bond forening / dissosiasjon etter null-force ermanifestert som et plutselig fall / økning i de termiske svingninger i perle 16,30.
Force klemme assay brukes for å måle under levetids krefter. En ønsket klemkraft (for eksempel 20 pN) er satt før forsøket. Målet er drevet gjentatte ganger for å kontakte sonden vulsten for en gitt kontakttid (for eksempel ett sekund) for å tillate dannelse av et reseptor / ligand binding (figur 2C, paneler 2 og 3), og deretter trekke tilbake (figur 2C, Panel 4 ). Dersom det dannes ingen binding, reflekteres på ingen strekkraft signal på RBC, eller hvis bindingen brister før de når den innstilte klemkraft, vil målet tilbake til den opprinnelige posisjon, og starte den neste syklus. I bindende hendelser som overlever tilbaketrekkingsfasen, er målet holdt på klemkraft med en tilsvarende forlengelse av RBC ved d til obligasjons dissosierer (Figur 2C, paneler 5 og 6), og deretter tilbake til den opprinnelige position å starte neste syklus (Figur 2C, Panel 7). Levetiden er definert som tidsintervallet fra det øyeblikk da den kraft som nådde det ønskede nivå til øyeblikket for bindingen dissosiasjon 20.
For alle disse tre BFP eksperimentelle moduser, bør experimentalist kunne se den tilnærmingen-hemmende-contact-retract- (clamp -) (dissociate-) avkastning testing syklus (figur 2C), som vil bli gjentatt for flere ganger 16,20 21.
Data som samles inn fra hver forsøksmåte BFP kunne analyseres på forskjellige måter for å utlede ønskede resultater. Den gjennomsnittlige levetiden kurven er en representativt resultat fra den kraft som klemmen analysen (figur 4). Det gjenspeiler de gjensidige off-priser av reseptor-ligand dissosiasjon henhold krefter. Termisk analyse tillater svingning for karakterisering av 2D-on-off-frekvensen og frekvensen av et reseptor-ligand-paret i henhold til null-kraft 16; mens vedheft freq-frekvensen analysen gjengir 2D on-rate, off-rate og tilhørighet i henhold null-force 13.
Tillegget av fluorescens bildefunksjon gjør det mulig å overvåke den intracellulære Ca2 + nivået av en enkelt celle, som er brukt som avlesning av cellesignalisering i dette systemet. For å bruke denne funksjonen under en FBFP eksperiment, må man pre-load cellene med en Ca 2+ indikator. I tilfelle av fura2-AM er den fluorescerende fargestoff, ble fluorescens bilder i den samme celle i henhold til 340 nm og 380 nm eksitasjon kanaler registrert vekselvis i eksperimentet og inspisert pair-by-paret i analysen. En terskelintensitets ble tilordnet til hver kanal er fluoriserende bilde for å fjerne bakgrunnsstøy og gjenkjenne cellen kontur (figur 5). Sammenligning av hvert par av fluorescens bildene tillater beregning av den intracellulære Ca 2+ nivå. Klare fluorescerende bilder av cellen i henhold til både 340 nmog 380 nm eksitasjon kanaler er nødvendig for nøyaktig måling av Ca 2+ nivå (figur 5A, B), mens dårlige bilder med ikke-neglisjerbar bakgrunnsstøy vil resultere i forspente resultater og bør unngås (figur 5C).
Ved å introdusere kontrollerbare mekaniske stimuleringer på cellen og registrere mobil Ca 2+ nivå samtidig gir FBFP en kraftig single-molekyl verktøy for å studere mekanisk-transduksjon på en levende celle. Det er verdt å merke seg at plattformen er beskrevet her er ganske allsidig; I prinsippet kan man lage mange måter å påføre kraft til cellen for å passe bestemte formål og samtidig overvåkning av forskjellige signaliseringshendelser av interesse. Den kraftavhengig kinetiske detaljer blir deretter analysert i sammenheng med den valgte signale avlesning for å trekke ut egenskapene til kraftregulerte reseptor-ligand-kinetikk, den induserte signaleringen, og deres korrelasjon. I eksempelet på TCR signaling, en agonist spesifikke TCR-pMHC fangsten bindingen ble først oppdaget og deretter dens relevans for T-celle Ca 2+ flux ble undersøkt 27. Strategien var å ta toppverdien av Ca 2+ flux som signalanlegget avlesning til å søke sitt beste prediktor mellom ulike kinetiske parametere, inkludert antall sammenvoksninger, kraften amplitude av bindingen, gjennomsnittlig levetid, den lengste levetiden og den kumulative levetid sekvensielt dannet bindinger. Vist i figur 6 er et eksempel på opp samtidig individuell bindingen levetid (hvor en klemkraft på 10 pN ble anvendt) av en T-celle og deres akkumulering sammen med det tilsvarende Ca 2 + signal kurve. I dette tilfelle oppsto fire hendelser levetid før det tidspunkt da Ca 2+ nivået begynte å heve på 55 sek, samler en sum av 10 andre binding levetid. Dette nivået av levetiden akkumulering utløste Ca2 + signal med en topp av normalisert fura2 ratiopå 1,8 som skjedde på 65 sek. En systematisk matematisk analyse av slike data samlet inn fra mange individuelle celler viste at den beste korrelerer av Ca 2+ signaliserer styrke levetid kumulerte i 1. minutt av gjentatte TCR-pMHC interaksjoner (se Referanse 27 for tekniske detaljer).
Figur 3: Eksemplarisk tid-force rådata kurver av en no-adhesjon hendelse (A), et brudd kraft hendelse (B) og en levetid hendelse (C). Forskjellige faser av syklusen og de tilsvarende kurvesegmentene er respektivt merket i hvert panel. Kraften (y-aksen) er avledet fra sporer posisjonen endring av sonden vulsten, slik som vist i figur 2C. (A) Ingen vedheft: trykk (negativ) kraft i kontakt fase returnerer to null ved tilbaketrekning. (B) Et brudd kraft hendelse: en strekk (positiv) kraft trekker via reseptor-ligand-binding til å forlenge RBC, som brister under tilbaketrekkingsfasen. (C) En levetid hendelsen: obligasjonen vedvarer til klemkraft er nådd og dissosierer etterpå. Varigheten av levetiden arrangementet er indikert. Bruddstyrken hendelse (B) og begynnelsen av levetiden hendelse (C) er markert med en stjerne.
Figur 4:. "Gjennomsnittlig levetid vs. force" kurven av OT1 T-celle i samspill med sin agonist OVA (grønn) og antagonist G4 (blå) er de samlede data gruppert i ulike styrke binger, og middelverdien ± SEM av obligasjons levetid er plottet mot kraft.
Figur 5:. Representant Ca 2+ bilder spent på to bølgelengder (A, B) Korrekt bilde anerkjennelse av en T-celle (angitt i rødt) i 340 nm (A) og 380 nm (B) kanaler basert på punkt-til- punkt screening ved anvendelse av en riktig tilordnet intensitetsterskel. (C) Manglende evne til å gjenkjenne fluorescens bildet av en T-celle (angitt i rødt) på 340 nm eksitasjon kanalen, på grunn av dårlig fura2 lasting.
Figur 6: overlagring av "intracellulær Ca2 + nivå (relativ fura2 ratio) mot tid" og "kumulative levetid mot tid" kurver over et OT1 T-celle, generererd ved gjentatte ganger å trykke på T-celle med en OVA-belagte kule over 300 sekunder. (A) En kraft kurve som viser en sekvens av ikke-adhesjon, brudd styrke, og levetid hendelser som genereres ved gjentatte kontakter over tid. (B) Epi-fluorescens pseudo-fargebilder av intracellulære Ca2 + signaler i T-cellen ved forskjellige tidspunkter. Den normaliserte Ca 2+ nivå er indikert av pseudo-fargeskalaen på høyre side. (C) superimposition av Ca 2+ signalkurve (rød) og den kumulative levetid kurven (gul) på samme tid kurset. Ca 2+ kurve ble plottet basert på Ca 2+ imaging. A Ca 2+ flux varsles med en skarp økning i normalisert fura2 forholdet. Tidspunktet for når Ca 2+ når toppen er angitt med en stiplet linje. Tiden det tar før hver levetid hendelsen er merket på den kumulative levetid kurven (solid trekant).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En vellykket FBFP forsøket innebærer noen kritiske betraktninger. Først, for den kraft som beregningen for å være pålitelig, mikropipette, RBC, og sonden vulsten må være tilpasset så nær koaksial som mulig. Projeksjonen av RBC inne i pipetten bør være omtrent en sonde pipette diameter, slik at friksjonen mellom RBC og pipetten er ubetydelig. For en typisk human RBC, er den optimale pipetten diameter 2,0 til 2,4 pm, noe som gir en beste tilpasning av ligning 1 17,30. For det andre, for å sikre målinger i kraft klemme assay og termisk svingning analyse er for det meste enkeltbindinger, en adhesjon frekvens på under 20% må opprettholdes 10,13,30. Her bør ikke-spesifikk adhesjon kontrolleres nøye (vanligvis <5% av tilstrekkelig blokkering med BSA). I tillegg bør dataene samles inn bare fra klebe hendelser med en enkelt kraft-slipp - kjennetegn på et enkelt molekyl-atferd (analogt til en enkelt-trinns forsvinningav fluorescens i enkeltmolekylet FRET). Tredje, lasting konsentrasjon av fluorescens fargestoff bør optimaliseres fra sak til sak for å oppnå best mulig bildekvalitet. For det fjerde må toksisiteten av fargestoffet lasting til T-celle eller andre celler av interesse som skal undersøkes nøye før hvert eksperiment. For eksempel, bindingsaffiniteten av reseptor-ligand interaksjoner ved fargestoff lasting må bli målt og sammenlignet med det uten fargestoff lasting. Dersom den bindende affinitet endres dramatisk på grunn fargestoff lasting, har en annen farge eller en annen laste konsentrasjon for å bli vurdert. Femte, er terminalt biotin-merkede proteiner trukket å tillate praktisk, konkret, og sterk kopling som bevarer proteinets opprinnelige orientering.
En stor styrke for FBFP, er at den utfører en enkeltbinding assay på en enkelt celle. Til tross for lav gjennomstrømning, avdekker enkeltobligasjon analyse ofte viktige funksjoner som er utilgjengelige ved konvensjonell ensemble megthods. For eksempel ved å undersøke levetid fordelingen ved hver kraft bin, kan man relatere forskjellige bindingsegenskaper med protein konformelle stater, og gir innsikt i hvordan makt regulerer protein konformasjonsendringer 20,32. BFP kan også brukes til å måle molekyl stivhet fra styrke og piezo-oversetter forskyvningsdata av tilbaketrekkingsfasen, som kan brukes til å undersøke protein-konformasjonelle dynamikk 20,21.
Mange metoder har blitt utviklet for å studere reseptor-mediert celle adhesjon og signalering. Reseptor-ligand-bindingskinetikken måles vanligvis med rekombinante proteiner i fullstendig isolert fra det cellulære miljø. En slik praksis er potensielt problematisk. For eksempel har det nylig blitt vist at in situ kinetikk målt på levende celler drastisk forskjellig fra det som ble målt ved hjelp av de tilsvarende rekombinante proteiner 14, avslører ny innsikt av reseptoren & #8217; s cellulære funksjoner. Ikke bare er i stand til å kvantifisere FBFP reseptor-ligand-kinetikken in situ, men enda viktigere, kan den også samtidig registrere den bindende-indusert cellesignalisering. Som demonstrert for TCR 27, den rike informasjon om bindingsegenskaper og cellesignale innhentet ved hjelp FBFP gir en enestående mulighet for å analysere sine relasjoner og forstå de molekylære mekanismene for mekanisk-transduksjon. Det er sannsynlig at FBFP vil finne flere programmer i andre viktige reseptor-ligand systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
| Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
| Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
| Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
| Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
| Capillary Tube 0.7-1.0 mm x 30 inches | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
| Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
| Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
| 1 ml syringe | BD | 309602 | chamber assembly |
| Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
| Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
| Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
| Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
| Camera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
| Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
| Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
| Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
| 3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
| LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
| 3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
| Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
| Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
| Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
| Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
| Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
| Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | 8.4 g/L sodium carbonate (Na2CO3), 10.6 g/L sodium bicarbonate (NaHCO3) | ||
| Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | 27.6 g/L NaPhosphate monobasic (NaH2PO4 • H2O), 28.4 g/L Anhy. NaPhosphate dibasic (Na2HPO4) | ||
| N2-5% buffer (pH 7.2) | 20.77 g/L potassium chloride (KCl), 2.38 g/L sodium chloride (NaCl), 0.13 g/L potassium phosphate monobasic (KH2PO4), 0.71 g/L anhy. sodium phosphate dibasic (Na2HPO4), 9.70 g/L sucrose |
References
- Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. Mechanical control of stem cell differentiation. Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).
- Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters. Frontiers in immunology. 3, 86 (2012).
- Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network. Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).
- Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. T cell antigen recognition at the cell membrane. Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).
- Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions. Physical biology. 9, 045005 (2012).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
- Marshall, B. T., et al. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423, 190-193 (2003).
- Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).
- Yago, T., et al. Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear. The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).
- Yago, T., et al. Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF. The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).
- Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 (2010).
- Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).
- Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib. Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).
- Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells. The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).
- Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).
- Nesbitt, W. S., et al. Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow. The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).
- Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor. Blood. 100, 2793-2800 (2002).
- Lefort, C. T., Ley, K. Neutrophil arrest by LFA-1 activation. Frontiers in immunology. 3, 157 (2012).
- Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling. Cell. 157, 357-368 (2014).
- Lou, J., et al. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature communications. 5, 4886 (2014).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).
- Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. Force history dependence of receptor-ligand dissociation. Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).
- Xiang, X., et al. Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin. PloS one. 6, e27946 (2011).
